本發(fā)明涉及一株人垂體腺瘤細(xì)胞及其用途，屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

垂體腺瘤占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的10％-15％，是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一。有報(bào)道稱垂體腺瘤尸檢發(fā)現(xiàn)率高達(dá)14.4％，隨機(jī)人群MRI檢出率為22.5％。根據(jù)是否能分泌激素，垂體瘤可分為激素分泌性垂體瘤和無功能性腺瘤。而根據(jù)激素分泌的種類，激素分泌性垂體腺瘤又可以分為催乳素，生長激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，促甲狀腺激素以及促性腺激素分泌型垂體瘤。垂體瘤的臨床表現(xiàn)主要為腫瘤占位性癥狀以及激素分泌紊亂所導(dǎo)致的一系列臨床改變。前者主要表現(xiàn)為頭痛，視力下降，視野缺損等，后者根據(jù)激素的種類，可能對于患者的生長、發(fā)育、勞動能力和生育功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。治愈率低，治療難度大，預(yù)后不佳是目前臨床上垂體瘤治療上亟需解決的問題。目前為止，雖然對垂體瘤展開了大量的研究，但是對于垂體瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍遠(yuǎn)未清楚。其中，缺乏成熟高效的人源化細(xì)胞系，成為目前制約垂體腺瘤發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)特性研究的極大瓶頸。

垂體腺瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究疾病發(fā)生和治療的主要手段。人們對鼠和人不同類型的垂體腺瘤細(xì)胞進(jìn)行了長期研究，已成功建立了數(shù)個鼠類垂體腺瘤細(xì)胞系，在研究中得到廣泛應(yīng)用。目前分離培養(yǎng)成功、可以穩(wěn)定傳代并保持良好分泌功能的有來源于小鼠垂體ACTH腺瘤細(xì)胞的AtT-20細(xì)胞系、來源于大鼠垂體腫瘤的GH3細(xì)胞系、來源于大鼠垂體泌乳素瘤的MMQ細(xì)胞系及來源于轉(zhuǎn)基因小鼠促性腺激素垂體腺瘤的αT3-1、GT1-1等細(xì)胞系。

雖然基于人垂體腺瘤組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)平臺，從取材到培養(yǎng)的整個流程方法、條件歷經(jīng)改良，然而人類垂體腺瘤細(xì)胞系的建立始終困難重重。因垂體腫瘤細(xì)胞生長緩慢、體外生存環(huán)境難以維系垂體腫瘤細(xì)胞分泌功能及成纖維細(xì)胞混雜等問題，至今仍無人類永生化垂體腺瘤細(xì)胞系建立。因此，現(xiàn)有臨床及基礎(chǔ) 實(shí)驗(yàn)研究多基于鼠源垂體腫瘤細(xì)胞系平臺之上開展。但由于嚙齒類動物垂體腫瘤細(xì)胞與人源垂體腫瘤組織的起源存在較大物種間差異，故鼠源垂體腫瘤細(xì)胞平臺獲取的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)仍較難轉(zhuǎn)嫁于人體實(shí)驗(yàn)，故成熟的人源垂體腺瘤細(xì)胞亟待開發(fā)。

目前只有鼠源垂體瘤細(xì)胞，并沒有人源化的垂體瘤細(xì)胞，原代培養(yǎng)的人垂體瘤細(xì)胞存在著許多難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株可以穩(wěn)定傳代的人源無功能垂體腺瘤細(xì)胞系。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

人垂體腺瘤細(xì)胞株，細(xì)胞株名稱為HPA1446，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12672。

該細(xì)胞具有垂體來源細(xì)胞的生物學(xué)特性：

本發(fā)明所述的人腦垂體瘤細(xì)胞系HPA1446是從無功能垂體腺瘤患者的腫瘤組織中分離培養(yǎng)獲得，該細(xì)胞通過細(xì)胞因子依賴法和反復(fù)貼壁法篩選獲得人垂體瘤細(xì)胞，經(jīng)過端粒酶轉(zhuǎn)染，細(xì)胞純化，單克隆篩選出具有較強(qiáng)增殖能力的細(xì)胞株HPA1446細(xì)胞，在體外經(jīng)過超過20次的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞仍保持垂體腫瘤特性。該細(xì)胞具有垂體瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，并表達(dá)多種垂體來源組織的標(biāo)志蛋白，同時也具有腫瘤特性和成瘤能力。

(1)在光學(xué)顯微鏡下大多呈圓梭形，部分為三角形或多角形，有較好的折光性，核膜完整，核仁清晰；(2)穩(wěn)定傳代，首次傳代20代以上；(3)染色體為100條異倍染色體核型；(4)該細(xì)胞表達(dá)蛋白sca-1呈陽性，不表達(dá)α-SMA；(5)電鏡下可見殼膜小圓形促性腺激素分泌顆粒；(6)該細(xì)胞具有體內(nèi)裸鼠部分成瘤能力。該細(xì)胞在生長36h即進(jìn)入生長穩(wěn)定期。

人垂體腺瘤細(xì)胞株CGMCC No.12672的永生化細(xì)胞系的培養(yǎng)物或永生化單克隆。

一種細(xì)胞培養(yǎng)物，包含人垂體腺瘤細(xì)胞株CGMCC No.12672。

本發(fā)明細(xì)胞株的用途包括但不限于以下用途：

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株用于制備腫瘤細(xì)胞模型的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株用于制備腫瘤動物模型的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株用于篩選和/或評價(jià)/制備腫瘤治療藥物的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株用于用于開發(fā)腫瘤藥物靶點(diǎn)的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株用于用于制備腫瘤診斷試劑的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株在篩選腫瘤生物治療藥物/試劑中的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株在開發(fā)腫瘤治療新技術(shù)中的用途。

所述的人垂體腺瘤細(xì)胞株在開發(fā)檢測腫瘤相關(guān)生物工程產(chǎn)品中的用途。

本發(fā)明細(xì)胞株具備多種用途：可用于研究腦垂體腺瘤發(fā)病及相關(guān)分子作用機(jī)制、研發(fā)篩選和評價(jià)腦垂體腺瘤治療藥物、垂體腺瘤相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)評價(jià)、生物治療新技術(shù)及檢測相關(guān)生物工程產(chǎn)品等提供必要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)工具。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明細(xì)胞株在體外可長期培養(yǎng)并保持細(xì)胞特性不變，是垂體瘤相關(guān)藥物研究的有力工具。

生物保藏信息：

生物材料名稱：HPA1446

分類命名：人垂體腺瘤細(xì)胞株

保藏日期：2016年6月24日

保藏號：CGMCC No.12672

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

附圖說明

圖1為原代細(xì)胞與永生化細(xì)胞的生長曲線圖。

圖2為培養(yǎng)的第20代垂體瘤細(xì)胞，大多呈圓梭形，部分為三角形或多角形。

圖3為透射電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

圖4為免疫熒光染色檢測sca-1蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞為紅色熒光的細(xì)胞， sca-1的表達(dá)率>80％。

圖5為免疫熒光染色檢測α-SMA蛋白的表達(dá)，無紅色熒光細(xì)胞，α-SMA表達(dá)為陰性，表示無成纖維細(xì)胞污染。

圖6為油鏡觀察并染色體計(jì)數(shù)，見染色體為100條異倍染色體核型。

圖7為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。

圖8-1和圖8-2為裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：人垂體腺瘤細(xì)胞株的獲得與培養(yǎng)

一、HPA1446原代細(xì)胞培養(yǎng)

1、生物材料來源

本發(fā)明所述細(xì)胞系是從無功能型垂體瘤手術(shù)病人垂體瘤組織組織分離培養(yǎng)獲得。腫瘤組織取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科中心的一位患者手術(shù)標(biāo)本，病理診斷為無功能型垂體腺瘤，顯微鏡下瘤細(xì)胞密集分布，胞膜界限不清，細(xì)胞核大小形態(tài)不甚一致，可見核仁及雙核瘤細(xì)胞。

2、分離培養(yǎng)方法

無菌超凈臺內(nèi)用含破紅液(購于Gibco公司)的PBS溶液(1∶1)將組織塊洗2次，去除血管和壞死組織，用組織剪將組織塊剪成約1mm³大小，加入3ml 0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶，37℃水浴消化10分鐘，顯微鏡下觀察，待消化成單細(xì)胞后，加入3ml含胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用200目的金屬篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織。過濾后的細(xì)胞懸液在PBS溶液中通過離心(1000rpm/分，10分鐘)洗滌2次，收集離心管底部的沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于含有生長因子的培養(yǎng)液中，接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

含有生長因子的培養(yǎng)液的配制：90％DMEM/F12(購于Gibco公司)，10％FBS(購于Gibco公司)，終濃度為10ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF，購于inventrogen公司)，終濃度為20ng/ml的表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF，購于inventrogen公司)。

3、細(xì)胞純化

細(xì)胞培養(yǎng)24h后棄懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞換含20％胎牛血清的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長接近90％匯合時，PBS溶液洗2次，加入0.4ml 0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶消化3分鐘，加上述培養(yǎng)液吹打分瓶，37℃培養(yǎng)30分鐘，收集懸浮細(xì)胞，棄貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞37℃培養(yǎng)30分鐘，待細(xì)胞再次貼壁后，收集懸浮細(xì)胞，棄貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞再37℃培養(yǎng)30分鐘，通過反復(fù)貼壁法，最終去除成纖維細(xì)胞。

4、傳代培養(yǎng)

純化后的細(xì)胞生長達(dá)90％匯合時，加入0.4ml 0.04％EDTA/0.5％胰蛋白酶消化2分鐘，加上述培養(yǎng)液吹打、分瓶，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。重復(fù)上述過程，直至傳20代，得到原代垂體腺瘤細(xì)胞，進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

二、永生化的垂體腺瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

1、細(xì)胞永生化處理方法

原代垂體腺瘤細(xì)胞經(jīng)過端粒酶轉(zhuǎn)染、細(xì)胞純化、單克隆篩選出具有較強(qiáng)增殖能力的細(xì)胞株傳代至20代經(jīng)微衛(wèi)星分析細(xì)胞特有位點(diǎn)無突變及P53和ras基因測序無位點(diǎn)突變鑒定后獲得永生化細(xì)胞株。

2、永生化細(xì)胞培養(yǎng)方法

(1)培養(yǎng)基類型：DMEM-高糖培養(yǎng)基(購于Gibco公司)

(2)添加因子：10％FBS,1％Penicillin,1％Streptomycin。

(3)凍存條件：90％FBS+10％DMSO。

(4)培養(yǎng)條件：待細(xì)胞達(dá)到70-80％匯合時準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

(5)細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法：

a)吸出25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

b)添加0.25％胰蛋白酶消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴2-3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；

c)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5ml，放入37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)得到永生化的垂體瘤細(xì)胞，并進(jìn)行生物材料保藏，保藏號：CGMCC No.12672。

實(shí)施例2：細(xì)胞生長曲線測定

一、方法：

將實(shí)施例1的原代垂體腺瘤細(xì)胞和永生化的垂體腺瘤細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴cells/mL，將原代的垂體瘤細(xì)胞和永生化的垂體瘤細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、72h后在每孔加入10μl的MTT，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)避光孵育3-4h；吸凈孔內(nèi)的液體，加入200μl的DMSO，室溫于搖床震蕩10min；酶標(biāo)儀492nm波長測出同一時間點(diǎn)OD值，用測得的OD值進(jìn)行分析。

二、結(jié)果：

如圖1所示，永生化的垂體瘤細(xì)胞在36h進(jìn)入生長穩(wěn)定期。增殖能力較原代細(xì)胞強(qiáng)。

實(shí)施例3：細(xì)胞形態(tài)檢測

一、方法：

1、采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞株CGMCC No.12672。

2、采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞株CGMCC No.12672的超微結(jié)構(gòu)：

待細(xì)胞生長達(dá)90％匯合時，棄培養(yǎng)液，加入3ml 0.1MPBS(pH值7.4)，用橡皮細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心(1000rpm/分，10分鐘)，棄上清，戊二醛/四氧化鋨前固定2小時，0.1M PBS(pH值7.4)洗3次，10分鐘/次。然后行標(biāo)本的后固定、脫水、浸透、包埋、切超薄切片和重金屬染色(北京市神經(jīng)外科研究所電鏡室完成)。

二、結(jié)果：

1、相差顯微鏡下細(xì)胞株CGMCC No.12672生長特性：大多呈梭形，部分為三角形或多角形，有較好的折光性，核膜完整，核仁清晰。(見圖2)

2、透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞株CGMCC No.12672的超微結(jié)構(gòu)：(見圖3)。

腫瘤細(xì)胞密集分布，胞核形態(tài)不規(guī)則，核仁大、明顯，胞漿及突起內(nèi)可見殼膜小圓形促性腺激素分泌顆粒。

結(jié)果提示：該細(xì)胞為無功能垂體細(xì)胞來源。

實(shí)施例4：免疫熒光檢測永生化細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況

一、方法

細(xì)胞株CGMCC No.12672，將細(xì)胞爬片，PBS漂洗3次之后，4％多聚甲醛固定10min。PBS漂洗5min，重復(fù)三次。3％H₂O₂/PBS室溫孵育10min，PBS漂洗5min，重復(fù)三次。5％FBS封閉，室溫15min。分別孵育sca-1抗體(購于santa cruz公司)和α-SMA抗體(購于abcam公司)，4℃孵育過夜，PBS漂洗5min，重復(fù)三次。將cy3標(biāo)記二抗(購于inventrogen公司)滴至切片上，每片1滴，37℃孵育30min。PBS漂洗5min，重復(fù)三次。封片，熒光顯微鏡下觀察。

二、結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察，>80％的細(xì)胞呈現(xiàn)出紅色熒光，sca-1蛋白表達(dá)陽性(圖4)。α-SMA抗體的沒有細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，α-SMA蛋白表達(dá)陰性(圖5)。

結(jié)果提示：該細(xì)胞無成纖維細(xì)胞污染。

實(shí)施例5：HPA1446細(xì)胞的腫瘤特性分析

一、方法

1、染色體核型分析：

細(xì)胞株CGMCC No.12672，待細(xì)胞生長達(dá)90％匯合后，換液并加入終濃度為0.5ug/ml的秋水仙素工作液使細(xì)胞停止在分裂中取對數(shù)生長期細(xì)胞，加秋水仙素至濃度0.4μg/mL，培養(yǎng)3小時；加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，1500rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞；75mmol/L KCl低滲30min,37℃；加入一滴甲醇/冰醋酸(3:1)固定液混勻后4℃離心，棄上清；加1mL固定液，4℃放置30min，混勻后4℃離心，棄上清；繼續(xù)加入固定液，混勻離心；滴片，空氣干燥，80℃烤片2h；吉姆薩染色。油鏡下觀察。

2、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期細(xì)胞(細(xì)胞株CGMCC No.12672)，棄培養(yǎng)液，胰酶消化細(xì)胞，加培養(yǎng)液，離心(1000rpm/分，14分鐘)，去上清。PBS洗2次，0.5mlPBS吹打，用5ml注射器吸取細(xì)胞，然后用力打入5ml 70％(預(yù)冷)乙醇中，封口膜封口，4℃固定過夜。離心(800rpm/分，14分鐘)，收集固定細(xì)胞，PBS洗2次， 0.4ml PBS重懸細(xì)胞并輕輕吹打(防止細(xì)胞破碎)。加RNase-A約3μl(終濃度為50μg/ml)，37℃水浴消化30分鐘，加50μl PI(終濃度為65μg/ml)，冰浴中避光染色30分鐘，300目(孔徑40～50微米)尼龍網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測(圖7)。

3、成瘤能力檢測

為了檢測細(xì)胞的成瘤能力，將1.0*10⁷個HPA1446細(xì)胞(細(xì)胞株CGMCC No.12672)接種于NOD/SCID裸鼠(購于維通利華公司)腋下皮下，接種后每天觀察腫瘤的生長情況，記錄成瘤潛伏期和腫瘤大小。

二、結(jié)果

1、染色體核型分析：油鏡觀察并染色體計(jì)數(shù)，見染色體為100條異倍染色體核型(圖6)。

2、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：HPA1446細(xì)胞周期各時相的細(xì)胞百分率為：G1期66.6％、S期24.4％、G2-M期9.02％。(圖7)

3、成瘤能力檢測：在第14天時裸鼠腋下有腫瘤出現(xiàn)，第4周時腫瘤大小達(dá)1厘米(圖8-1、圖8-2)。