大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法：1)取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞；2)以10-30萬細胞/ml培養(yǎng)基的比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)；3)間隔培養(yǎng)一天后，以4℃1000 rpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的新干細胞培養(yǎng)基；4)干細胞培養(yǎng)2-3天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)細胞碎片，繼續(xù)隔天半量換液；5)培養(yǎng)一周，可見狀態(tài)好的小細胞球出現(xiàn)；6)培養(yǎng)一周，待干細胞球初步形成，細胞增殖停滯；7)繼續(xù)培養(yǎng)二周，使干細胞球基本形成。本發(fā)明從大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出來腫瘤干細胞樣細胞，從而解決了腫瘤干細胞樣細胞來源少的問題，能大量提供用于進一步研究。
【專利說明】大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種大鼠垂體泌乳素腺 瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 垂體腺瘤為顱內(nèi)良性腫瘤，按照內(nèi)分泌激素水平分為：泌乳素腺瘤 (prolactinoma)，生長激素腺瘤（GH adenoma)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素腺瘤（ACTH adenoma)，促甲狀腺激素腺瘤（TSH adenoma)，促性腺激素腺瘤（LH/FSH adenoma)和無功能 腺瘤（NFPA)。
[0003] 腫瘤干細胞報道主要關(guān)注惡性腫瘤，對于良性腫瘤干細胞樣細胞（tumor stem-like cell)報道很少。
[0004] 目前SCI收錄論文關(guān)于垂體腺瘤干細胞樣細胞培養(yǎng)的報道有4篇，3篇從人垂體腺 瘤標本中分離培養(yǎng)，其中2篇為同一個課題組發(fā)表的類似結(jié)果，另一篇是從小鼠垂體腺瘤 中分離培養(yǎng)，但上述報道均未區(qū)分或考慮垂體腺瘤的類型。國內(nèi)論文報道有2篇，但按照目 前腫瘤干細胞鑒定標準來看并不完全符合規(guī)范，均未做裸鼠種植成瘤實驗。目前尚未有從 垂體腺瘤細胞株中成功分離培養(yǎng)腫瘤干細胞樣細胞的報道。
[0005] 垂體泌乳素腺瘤約占垂體瘤的30%，大部分首選藥物治療（國際垂體協(xié)會泌 乳素腺瘤診療指南，Guidelines of the Pituitary Society for the diagnosis and management of prolactinomas. Cl in Endocrinol (Oxf), 2006, 65:265-273.)，接受手術(shù)的 病例相對少，同時垂體泌乳素腺瘤為良性腫瘤，手術(shù)中獲取的標本體外培養(yǎng)，細胞生長緩 慢，且一般傳3-4代后就出現(xiàn)生長停滯，而垂體泌乳素腺瘤干細胞樣細胞需從腫瘤細胞分 離培養(yǎng)，這樣就出現(xiàn)標本來源少且培養(yǎng)困難的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明就是針對上述問題，提出一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細 胞的培養(yǎng)方法，該方法從垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出腫瘤干細胞樣細胞，從而為腫瘤 干細胞樣細胞的進一步大量研宄奠定基礎(chǔ)。
[0007] 為達到上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用了大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細 胞的培養(yǎng)方法，具體包含下列步驟：
[0008] 1)取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，用PBS洗滌2-3次，用上述干細胞培養(yǎng)基重懸；
[0009] 2)以10-30萬細胞/ml培養(yǎng)基的比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)，使用24孔板培養(yǎng)；
[0010] 3)間隔培養(yǎng)一天后，以4°C lOOOrpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的新 干細胞培養(yǎng)基；
[0011] 4)干細胞培養(yǎng)2-3天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)細胞碎片，繼續(xù)隔天半量換液；
[0012] 5)培養(yǎng)一周，使狀態(tài)好的小細胞球出現(xiàn)；
[0013] 6)繼續(xù)培養(yǎng)一周，等干細胞球初步形成，細胞增殖停滯；
[0014] 7)繼續(xù)培養(yǎng)二周，使干細胞球基本形成。
[0015] 在本發(fā)明的步驟2)中，以10-30萬細胞/ml培養(yǎng)基的比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)，使用 6孔板培養(yǎng)。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的培養(yǎng)基以去內(nèi)毒素型DMEM/F-12培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有無維生素A型B-27添加劑、青霉素-鏈霉素抗生素、堿性重組大鼠成纖 維細胞生長因子以及重組大鼠表皮細胞生長因子。
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方式中，其特征在于每500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入8-12mL無維生 素A型B-27添加劑、20000-3000U青霉素-鏈霉素抗生素、5000-15000ng堿性重組大鼠成 纖維細胞生長因子以及5000-15000ng重組大鼠表皮細胞生長因子。
[0018] 本發(fā)明從垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出來腫瘤干細胞樣細胞，解決了來源的問 題，能大量提供用于進一步研宄。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1 :大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)變化
[0020] (圖A)狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞；（圖B)細胞行干細胞培養(yǎng)2-3天后；（圖C) 細胞行干細胞培養(yǎng)1周后；（圖D)細胞行干細胞培養(yǎng)2周后；（圖E)細胞行干細胞培養(yǎng)4 周后。
[0021] 圖片2大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞鑒定
[0022] (圖A)細胞行干細胞培養(yǎng)后，流式鑒定結(jié)果顯示，-SC細胞⑶133干細胞標志物陽 性比例較細胞增加；（圖B)蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，-SC細胞⑶133以及NESTIN干細胞 標志物蛋白表達水平較細胞有所增加；（圖C)免疫熒光染色結(jié)果顯示，-SC細胞CD133蛋白 主要表達在細胞膜上，且表達量較細胞有所增加。
【具體實施方式】
[0023] 下面采用【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細地說明。
[0024] 實施例1
[0025] 1、干細胞培養(yǎng)基配方：
[0026]
【權(quán)利要求】
1. 一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括 如下步驟：1)取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞；2)以10-30萬細胞/ml培養(yǎng)基的比例接種于 培養(yǎng)板內(nèi)；3)間隔培養(yǎng)一天后，以4°C lOOOrpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的 新干細胞培養(yǎng)基；4)干細胞培養(yǎng)2-3天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)細胞碎片，繼續(xù)隔天半量換液；5)培 養(yǎng)一周，可見狀態(tài)好的小細胞球出現(xiàn)；6)培養(yǎng)一周，待干細胞球初步形成，細胞增殖停滯； 7)繼續(xù)培養(yǎng)二周，使干細胞球基本形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2)中，以10-30萬細胞/ml培養(yǎng) 基的比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)，使用6孔板培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基以去內(nèi)毒素型DMEM/ F-12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有無維生素 A型B-27添加劑、青霉素-鏈霉素抗生素、堿性重 組大鼠成纖維細胞生長因子以及重組大鼠表皮細胞生長因子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，每500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入8-12mL 無維生素 A型B-27添加劑、20000-3000U青霉素-鏈霉素抗生素、5000-15000ng堿性重組 大鼠成纖維細胞生長因子以及5000-15000ng重組大鼠表皮細胞生長因子。
【文檔編號】C12N5/095GK104450619SQ201410759556
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】蘇志鵬, 蔡霖, 陳賢斌, 陳健, 盧江龍, 王成德, 李群 申請人:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院