鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有兩對特異性引物。本發(fā)明具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優(yōu)點，應用本發(fā)明可建立鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重PCR的檢測方法，實現(xiàn)同時檢測和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體，用于鴨黃病毒感染造成的免疫力減低導致的鴨圓環(huán)病毒的混合感染，既可以節(jié)約時間的成本，又可以減少污染。
【專利說明】鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]鴨黃病毒(Bai yang dian virus, BYD)又名鴨坦布蘇病毒，主要引起種鴨和蛋鴨食欲急劇減退、產(chǎn)蛋急劇下降，卵泡變性，卵泡膜出血為主要特征。2010年以來，我國福建、浙江、江蘇、山東、安徽、河南、河北、廣東等地相繼報道爆發(fā)了一種引起鴨產(chǎn)蛋大幅下降的疾病，給蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。鴨圓環(huán)病毒(Duck Circovirus, DuCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的一成員，首次在德國報道。近年來，相繼有匈牙利、美國、中國臺灣及我國山東、遼寧、福建、廣東和廣西等地發(fā)現(xiàn)有鴨圓環(huán)病毒造成鴨感染或發(fā)病的報道。DuCV造成鴨發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育不良、體重下降及羽毛凌亂等，病理組織表現(xiàn)為法氏囊出現(xiàn)壞死淋巴細胞減少和組織細胞增多。組織細胞增生現(xiàn)象感染動物的淋巴組織逐漸萎縮導致免疫功能下降或免疫反應抑制進而提高了二重或多重感染的幾率是圓環(huán)病毒感染的特征。鴨圓環(huán)病毒與其它病原菌或病毒的混合感染情形非常復雜。柴同杰對山東的櫻桃谷鴨群鴨圓環(huán)病毒及混合感染的調(diào)查表明，鴨圓環(huán)病毒與鴨I型肝炎、鴨疫里默氏桿菌及大腸桿菌的混合感染率較高。屈素潔等對廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況進行調(diào)查，結果表明存在與鴨疫里氏桿菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鴨肝炎病毒等病原混合感染現(xiàn)象。水禽圓環(huán)病毒不能在細胞和禽胚上生長，而且該病毒多以亞臨床感染形式出現(xiàn)，所以用傳統(tǒng)的分離病毒、動物試驗方法無法進行診斷。 最初診斷圓環(huán)病毒主要靠病理組織和電鏡觀察，但這兩種方法都需要專業(yè)的技能，并且敏感性不高。
[0003]由于BYD與DuCV均為嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病，特別是有混合感染時，更增加了臨床診斷工作的難度。因此迫切需要建立快速敏感的鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒檢測技術，在感染早期就能檢測出這些病毒，從而為這些病的控制爭取寶貴的時間。目前，上述兩種病毒的傳統(tǒng)檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等，但這些檢測存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性。
[0004]PCR技術實現(xiàn)了對模板的定量，而且具有敏感、特異、準確可靠、能實現(xiàn)多重反應等特點。在實際應用中，當樣品量非常大時，單重PCR在成本和時間方面就存在一定的劣勢，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來進行批量的快速檢測。多重熒光PCR采用多對引物擴增檢測多個模板，克服了單重PCR的不足。但是，建立二重或多重PCR方法比單重的要復雜得多，其對試劑和引物要求更高，同時需要保證不同引物間無相互干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種操作簡便、敏感性高、特異性強、重復性好的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，以實現(xiàn)同時檢測和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體。[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組，包括兩對特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為0.5-1: 0.5_1:1:1。
[0008]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1:1:1。
[0009]上述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組在二重PCR擴增方面的應用，二重PCR擴增的退火溫度為50-60°C。
[0010]二重PCR擴增的退火溫度為60°C。
[0011]鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑:
[0012]A液:PCR反應液，含2XTaq PCR Mix (購自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20, BYD上下游引物分別是引物I和2，DuCV上下游引物分別是引物3和4，引物I至4分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列；
[0013]B液:BYD+DuCV模板，作為陽性對照；
[0014]C液:ddH20，作為陰性對照。
[0015]PCR反應液含2XTaq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物濃度均為50 μ mol/mL ;B液含BYD+DuCV模板各I μ L，C 液為 2 μ L ddH20。`
[0016]上述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒在二重PCR擴增方面的應用，二重PCR擴增的退火溫度為50-60°C。
[0017]二重PCR擴增的退火溫度為60°C。
[0018]針對目前缺乏對鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒同時進行檢測和診斷的有效可靠的技術，發(fā)明人研究設計了兩對特異性引物，據(jù)此建立了鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重PCR的檢測方法，并制備了相應的檢測試劑盒。本發(fā)明具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優(yōu)點，應用本發(fā)明可同時檢測和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體，用于鴨黃病毒感染造成的免疫力減低導致的鴨圓環(huán)病毒的混合感染，既可以節(jié)約時間的成本，又可以減少污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是二重PCR溫度優(yōu)化試驗結果電泳圖，圖中:M:1OObp DNA ladder ;1_5:BYD引物 0.2μ L、0.4μ L、0.5μ L、0.6μ L、0.8μ L ；l-5:DuCV 引物 0.8 μ L、0.6 μ L、0.5 μ L、
0.4μ L、0.2μ L ;Ν:陰性對照。
[0020]圖2 是二重 PCR 的優(yōu)化結果電泳圖，圖中:Μ:1OObp DNA ladder ；1:50.0°C ；2:50.4°C ；3:51.5°C ；4:53.0°C ；5:54.8°C ；6:56.6°C ；7:58.4°C ；8:60.(TC。
[0021]圖3是二重PCR特異性試驗結果電泳圖，圖中:M:1OObp DNA ladder ;N:陰性對照CddH2O); 1:鴨黃病毒的cDNA+鴨圓環(huán)病毒的DNA (等體積混合)；2:鴨黃病毒的cDNA ;3:鴨圓環(huán)病毒的DNA ；4:新城疫病毒的cDNA ；5:鴨瘟病毒的DNA ；6:鴨肝炎病毒的cDNA ；7:番鴨細小病毒的DNA ；8:番鴨呼腸孤病毒的cDNA ；9:H9亞型流感病毒的cDNA ；10:減蛋綜合癥病毒的DNA。
[0022]圖4是二重PCR方法檢測BYD和DuCV的敏感性結果電泳圖，圖中:M:1OObp DNAladder ； I:10ng鴨新黃病毒cDNA和IOng鴨圓環(huán)病毒DNA ；2: Ing鴨黃病毒cDNA和Ing鴨圓環(huán)病毒DNA ；3:100pg鴨黃病毒cDNA和IOOpg鴨圓環(huán)病毒DNA ；4:10pg鴨黃病毒cDNA和IOpg鴨圓環(huán)病毒DNA ；5:Ipg鴨黃病毒cDNA和Ipg鴨鴨圓環(huán)病毒DNA ；6:IOOfg鴨黃病毒cDNA和IOOfg鴨圓環(huán)病毒DNA ；7:1Ofg鴨黃病毒cDNA和IOfg鴨圓環(huán)病毒DNA ；8:1fg鴨黃病毒cDNA和Ifg鴨圓環(huán)病毒DNA。
[0023]圖5是二重PCR部分臨床樣品檢測結果電泳圖，圖中:M為IOObp DNA ladder ；N為陰性對照(ddH20) ;1為陽性對照(鴨黃病毒cDNA+鴨圓環(huán)病毒DNA) ;2_22分別為編號為部分有目的條帶的鴨病料檢測結果。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下:
[0025]鴨黃病毒記載在“4株廣西鴨源坦布蘇病毒分離及初步鑒定”，中國動物檢疫，2013，30 (6): 31-35，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0026]鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國畜牧獸醫(yī)，2010,37 (11): 156-158，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0027]新城疫病毒記載在“新城疫植物油乳劑苗的研究”，中國預防獸醫(yī)學報，2000，
(04): 23-27，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0028]鴨瘟病毒AV1221株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0029]鴨肝炎病毒AV2111株(以下簡稱為DHV I)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0030]番鴨細小病毒記載在“廣西番鴨細小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)，2002，18 (6): 5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0031]番鴨呼腸孤病毒記載在“番鴨花肝病的病原研究”，中國獸醫(yī)科技，2003，33
(5): 7-9，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0032]H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉錄聚合酶鏈反應快速檢測鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學報，2006，(09):858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0033]減蛋綜合癥病毒記載在“減蛋綜合癥植物油乳劑苗的研究”，中國預防獸醫(yī)學報，2000，(04):23-27,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0034]試劑:IOObpMarker ladder、2XTaq PCR Mix、DNA/RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑均購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；PMD18-T試劑盒購自大連寶生物公司。
[0035]實施例1、引物的設計與合成
[0036]根據(jù)GenBank中BYD的E基因與DuCV的REP基因的保守序列，利用DNAStar軟件進行多序列比對，在保守區(qū)用Primer Premier5.0設計引物。引物(見表1)由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0037]表1引物信息
[0038]
【權利要求】
1.鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組，其特征在于包括兩對特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為0.5-1: 0.5-1: I: I。
3.根據(jù)權利要求2所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1:1:1。
4.權利要求1所述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測引物組在二重PCR擴增方面的應用，其特征在于:所述二重PCR擴增的退火溫度為50-60°C。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于:所述二重PCR擴增的退火溫度為60°C。
6.一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑:
A液:PCR反應液，含2XTaq PCR Mix(購自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20，BYD上下游引物分別是引物I和2，DuCV上下游引物分別是引物3和4，引物I至4分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列； B液:BYD+DuCV模板，作為陽性對照； C液:ddH20，作為陰性對照。
7.根據(jù)權利要求6所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述PCR反應液含2X Taq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物濃度均為50 μ mol/mL ;所述B液含BYD+DuCV模板各IyL,所述 C 液為 2 μ L ddH20。
8.權利要求7所述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測試劑盒在二重PCR擴增方面的應用，其特征在于:所述二重PCR擴增的退火溫度為50-60°C。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于:所述二重PCR擴增的退火溫度為60°C。
【文檔編號】C12R1/93GK103725801SQ201410019738
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權日:2014年1月16日
【發(fā)明者】謝芝勛, 張艷芳, 謝麗基, 劉加波, 龐耀珊, 范晴, 羅思思, 鄧顯文, 謝志勤 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所