本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法與應用。
背景技術(shù)：
基于干細胞移植技術(shù)的再生醫(yī)學為人類戰(zhàn)勝難治性退行性疾病帶來了巨大的希望。誘導多能干細胞由于突破了胚胎干細胞的倫理障礙，曾被認為是再生醫(yī)學的新希望。然而，其誘導效率的低下，批次間的不穩(wěn)定性及高致瘤性使其很難直接用于疾病治療。
自2010年以來，國內(nèi)外一些科學家通過表達特定轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)了將一種類型的成體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的成體細胞或成體干細胞。這一方法被稱為“轉(zhuǎn)分化”。通過過量表達譜系特異性調(diào)控因子，人們不僅能使成體細胞去分化為胚胎干細胞，還能實現(xiàn)不同世系成體細胞之間的轉(zhuǎn)分化過程。目前，通過在體細胞中強制表達特定重編程因子，介導體細胞直接轉(zhuǎn)分化為某些珍貴的或者不可再生的細胞，為解決上述細胞來源不足的問題提供了新的途徑。
然而，外源基因過量表達的方法技術(shù)壁壘較高，表達載體可能插入基因組，導入系統(tǒng)安全性存在隱患，效率也有待提高。除了特異性基因的誘導手段，一些小分子化合物也被證實能夠促進細胞重編程過程。最近的幾項研究發(fā)現(xiàn)，重編程過程中的所有轉(zhuǎn)錄因子都可以用小分子替代。小分子化合物不僅具有滲透入細胞膜、易操控和成本低等優(yōu)勢，并且小分子能實現(xiàn)沒有任何外源基因介入的體細胞重編程過程，這無疑為人們獲得多能性干細胞提供了新的方法和思路。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是利用來源廣泛、成本低廉的人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法，及所得神經(jīng)細胞的應用。
本發(fā)明提出的一種人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法，包括如下步驟：將人皮膚成纖維細胞以5000細胞/孔接種于含有神經(jīng)細胞培養(yǎng)液的24孔板中培養(yǎng)28天，每3天換液。
優(yōu)選地，神經(jīng)細胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、E61542、苯環(huán)丙胺、毛喉素、福思科林、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B-27添加劑。
E61541是TGF-β信號通路中ALK5位點的抑制劑。
苯環(huán)丙胺是單胺氧化酶的抑制劑。
毛喉素是腺苷酸環(huán)化酶的激活劑。
福思科林(Forskolin)是一種分離自印度植物(Coleus forskohlii)的天然二萜產(chǎn)物，細胞生理學實驗研究中Forskolin通常用來提高環(huán)腺苷酸(cAMP)水平。
腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達。一種小分子二聚體蛋白質(zhì)BDNF結(jié)構(gòu)、分布及信號轉(zhuǎn)導BDNF分子單體是由119個氨基酸殘基組成的分泌型成熟多肽，蛋白等電點為9.99,相對分子質(zhì)量為3.5×103,主要由β折疊和無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)組成，含有3個二硫鍵，為一種堿性蛋白質(zhì)。
B-27添加劑用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長和保持其短期或長期活性。
優(yōu)選地，神經(jīng)細胞培養(yǎng)液中，E61542的濃度為4～6μmol/L，苯環(huán)丙胺的濃度為4～6μmol/L，毛喉素的濃度為8～12μmol/L，福思科林的濃度為4～6μmol/L，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度為0.1～1μg/L，B-27添加劑的濃度為20～40mg/L。
優(yōu)選地，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
本發(fā)明還提出的一種神經(jīng)細胞，采用上述人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法制得。
本發(fā)明還提出的上述神經(jīng)細胞用于制備預防或治療神經(jīng)細胞功能障礙疾病的藥物組合物。
本發(fā)明能夠?qū)⒊扇似つw成纖維細胞誘導轉(zhuǎn)分化為心肌細胞，所得神經(jīng)細胞具有正常神經(jīng)細胞特異性分子標簽，并且具有正常的神經(jīng)功能，為再生醫(yī)學的細胞來源問題提供一種新的途徑，同時人皮膚成纖維細胞來源廣泛，價格低廉。
具體實施方式
下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
實施例1
一種人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法，包括如下步驟：將人皮膚成纖維細胞以5000細胞/孔接種于含有神經(jīng)細胞培養(yǎng)液的24孔板中培養(yǎng)28天，每3天換液，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
神經(jīng)細胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、E61542、苯環(huán)丙胺、毛喉素、福思科林、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B-27添加劑；其中E61542的濃度為4μmol/L，苯環(huán)丙胺的濃度為6μmol/L，毛喉素的濃度為8μmol/L，福思科林的濃度為6μmol/L，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度為0.1μg/L，B-27添加劑的濃度為40mg/L。
實施例2
一種人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法，包括如下步驟：將人皮膚成纖維細胞以5000細胞/孔接種于含有神經(jīng)細胞培養(yǎng)液的24孔板中培養(yǎng)28天，每3天換液，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
神經(jīng)細胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、E61542、苯環(huán)丙胺、毛喉素、福思科林、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B-27添加劑；其中E61542的濃度為6μmol/L，苯環(huán)丙胺的濃度為4μmol/L，毛喉素的濃度為12μmol/L，福思科林的濃度為4μmol/L，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度為1μg/L，B-27添加劑的濃度為20mg/L。
實施例3
一種人皮膚成纖維細胞誘導為神經(jīng)細胞的方法，包括如下步驟：將人皮膚成纖維細胞以5000細胞/孔接種于含有神經(jīng)細胞培養(yǎng)液的24孔板中培養(yǎng)28天，每3天換液，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
神經(jīng)細胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、E61542、苯環(huán)丙胺、毛喉素、福思科林、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B-27添加劑；其中E61542的濃度為5μmol/L，苯環(huán)丙胺的濃度為5μmol/L，毛喉素的濃度為10μmol/L，福思科林的濃度為5μmol/L，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度為5μg/L，B-27添加劑的濃度為30mg/L。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。