本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術領域：
，且特別涉及一種抑制病毒感染的多肽及其基因、藥物及應用。
背景技術：
：黃病毒屬(Flavivirus)是黃病毒科(Flaviviridae)家族成員，包括70多種病毒，這些病毒分布廣泛。經(jīng)過蚊子叮咬傳播的黃病毒(即蚊媒病毒)，例如黃熱病毒(yellowfevervirus,YFV)、登革病毒(Denguevirus,DENV)1-4型、流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)、西尼羅病毒(WestNilevirus，WNV)和寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)在所流行的區(qū)域引起人較高的發(fā)病率和死亡率。近年來的全球氣候變化影響到黃病毒傳播媒介的地理分布，以及病毒基因某些位點的突變使其適應新的傳播媒介，因此黃病毒感染呈現(xiàn)出進一步蔓延的趨勢。因此對于黃病毒的流行病學調(diào)查和預防控制顯得尤為迫切。乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)感染人體引起流行性乙型腦炎，主要分布在亞洲，西太平洋國家，以及澳大利亞北部。乙型腦炎病毒是一種蟲媒病毒，每年約有六萬多感染病例報道，幸存者中的50％左右會有永久的神經(jīng)后遺癥例如記憶喪失、認知障礙、行為障礙、抽搐等。乙型腦炎病毒對人類的健康造成了嚴重的威脅，因此采取有效的措施防治疾病的發(fā)生十分必要。目前該病的治療還是以預防為主，并沒有有效的治療藥物，因此研制安全有效的抗病毒藥物是治療JEV的關鍵。寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)最先在烏干達ZIKV森林一只發(fā)熱的猴子體內(nèi)分離，并以該森林的名字命名。該病毒自分離至2007年很少出現(xiàn)感染人的現(xiàn)象，最初該病的流行具有明顯的區(qū)域限制，僅在非洲和東南亞地區(qū)流行。2015年該病毒入侵巴西，并通過埃及伊蚊傳播，迅速在南美洲大規(guī)模流行，至今全球62個國家已出現(xiàn)ZIKV的流行。該病毒的傳播流行與傳染媒介活動區(qū)域和季節(jié)相一致，目前認為蚊子是ZIKV病毒最主要的傳播媒介，因而夏季是ZIKV病毒暴發(fā)流行最為嚴重的季節(jié)。ZIKV病毒流行范圍較廣，已先后于非洲、亞洲和環(huán)太平洋地區(qū)暴發(fā)和流行。流行病學和血清學研究表明，只有大約20％的ZIKV感染者表現(xiàn)出臨床癥狀，臨床癥狀比較輕微并且通常自愈，表現(xiàn)為體溫稍升高、關節(jié)疼、皮疹、結(jié)膜炎、頭疼、肌肉疼。目前尚無有效的疫苗和藥物能夠用于ZIKV病毒感染的預防和治療。目前，針對治療乙腦病毒感染和寨卡病毒感染的藥物等都有效果不佳的問題，更沒有同時專門針對乙腦病毒感染和寨卡病毒感染的藥物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種抑制病毒感染的多肽。本發(fā)明的第二目的在于提供編碼上述多肽的基因。本發(fā)明的第三目的在于提供含有上述基因的表達載體。本發(fā)明的第四目的在于提供含有上述基因的宿主菌。本發(fā)明的第五目的在于提供上述的多肽在制備抑制病毒感染的藥物中的應用。本發(fā)明的第六目的在于提供一種抑制病毒感染的藥物。本發(fā)明的第七目的在于提供上述的多肽在制備抑制病毒感染的抗體中的應用。本發(fā)明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。一種抑制病毒感染的多肽，該多肽是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一種或多種；第一多肽的序列如SEQIDNo.1所示，第二多肽的序列如SEQIDNo.2所示，第三多肽的序列如SEQIDNo.3所示，第四多肽的序列如SEQIDNo.4所示，第五多肽的序列如SEQIDNo.5所示。編碼上述多肽的基因。含有上述基因的表達載體。含有上述基因的宿主菌。上的多肽在制備抑制病毒感染的藥物中的應用。一種抑制病毒感染的藥物，該藥物的活性成分為上述多肽。上述的多肽在制備抑制病毒感染的抗體中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：一種抑制病毒感染的多肽，能安全、高效的、便捷的抑制乙腦病毒或寨卡病毒的感染；通過表達載體連接目的基因在宿主菌種表達目的蛋白，可以大量的快速的獲得目的蛋白；抑制病毒感染的藥物的活性成分包含上述多肽，方便藥物的推廣使用，通過多肽制備抗體，可以避免感染的風險，提高實驗的安全性；并且具有相同的效果；制備抗體能長期作用，避免多肽被降解或者分解，效果更顯著，也更有利于保藏。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發(fā)明實驗例1提供的多肽毒性實驗結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實驗例2提供的噬斑實驗的結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實驗例3提供的westernblot實驗的結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實驗例4提供的qRT-PCR實驗的結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明實驗例5提供的噬斑實驗的結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明實驗例5提供的qRT-PCR實驗的結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明實驗例6提供的第五多肽體內(nèi)抑制乙腦病毒的結(jié)果圖。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。HindⅢ和BamHI內(nèi)切酶及反應緩沖液購自TAKARA公司，T4連接酶及反應緩沖液購自TAKARA公司。下面對本發(fā)明實施例的一種抑制病毒感染的多肽及應用進行具體說明。包膜病毒通過病毒膜和宿主細胞膜的融合感染細胞，融合后釋放病毒的基因組到細胞質(zhì)中。黃病毒科病毒在受體介導的內(nèi)吞作用下進入細胞，在內(nèi)體中發(fā)生膜融合。膜融合的發(fā)生是由融合蛋白介導的。黃病毒科包膜蛋白envelope(E)蛋白在適當?shù)臈l件誘導下，融合蛋白暴露并插入宿主細胞膜，E蛋白發(fā)生構象變化最終介導整個膜融合過程。根據(jù)膜融合蛋白結(jié)構的不同，可將其分為ClassI,ClassⅡ和ClassⅢ三種。而黃病毒科的E蛋白屬于ClassⅡ型膜融合蛋白，富含β折疊。乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)的E蛋白有三個結(jié)構域，黃病毒膜融合始于酸性pH引起E蛋白的二體發(fā)生解離，E蛋白向外翻轉(zhuǎn)，暴露出融合肽并插入到內(nèi)體膜中，之后形成E蛋白三體，其核心部位為：中心三聚體(coretrimer)，結(jié)構域Ⅲ向三聚體中間體發(fā)生回折，與E蛋白頂端形成37°的夾角并且嵌入到兩個相鄰E蛋白單體形成的凹槽中，同時拉動莖區(qū)折向中間三聚體，最終導致與宿主細胞發(fā)生膜融合，莖區(qū)從結(jié)構域Ⅲ的羧基端開始，沿著結(jié)構域II像拉鏈一樣嵌入中間體中，直到與融合肽重合。不同黃病毒的莖區(qū)氨基酸序列具有高度保守性。因此，莖區(qū)對膜融合時E蛋白三體的變構十分重要，拉動DⅢ發(fā)生回折，驅(qū)動膜融合。常規(guī)的預防或治療方法是用干擾素、預防疫苗或藥物治療。而干擾素的長期使用容易導致耐藥性；疫苗的研制一般周期較長，需要進行有效性、安全性的評價，耗時比較長；對一些突發(fā)性的傳染病的治療就缺乏時效性；針對性治療的藥物的研發(fā)周期更長，耗時以及需要大量的資金，同樣缺乏時效性。本發(fā)明通過設計短的多肽，通過原核表達獲得多肽片段，多肽片段能競爭性的結(jié)合到宿主細胞的靶位點，從而達到抑制乙腦病毒和寨卡病毒感染的效果。一種抑制病毒感染的多肽，該多肽是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一種或多種；第一多肽的序列如SEQIDNo.1所示，第二多肽的序列如SEQIDNo.2所示，第三多肽的序列如SEQIDNo.3所示，第四多肽的序列如SEQIDNo.4所示，第五多肽的序列如SEQIDNo.5所示。以乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)的莖區(qū)序列為設計基礎，用合成多肽競爭性阻止病毒E蛋白莖區(qū)回折與結(jié)構域II的結(jié)合，從而抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)和寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)的感染。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)進一步研究發(fā)現(xiàn)第五多肽在體內(nèi)能有效抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)感染，還能有效的抑制寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)的感染。發(fā)明人巧妙的通過病毒自身能夠與感染的宿主的細胞膜的相關接合位點發(fā)生識別的蛋白序列，該蛋白序列與病毒本身產(chǎn)生競爭性結(jié)合，擠占病毒的結(jié)合位點，使病毒無從結(jié)合，也就沒有辦法感染宿主，從而達到預防或治療感染的目的。并且，蛋白序列沒有感染或傳染能力，并不會導致感染，所以是一種安全、有效、便捷的預防或治療手段。當然，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽等五條多肽既可以通過原核表達獲得多肽序列，也可以通過人工合成來獲得多肽。編碼上述多肽的基因。由于蛋白合成的時候，存在密碼子的簡并性；所以編碼同一條多肽的基因序列有可能會有很多條；真核生物或者病毒等基因做原核表達的時候，由于不同物種的基因表達，由于密碼子的偏好性，容易導致部分轉(zhuǎn)運RNA的耗盡，導致蛋白的翻譯失敗等，所以允許對基因序列的密碼子優(yōu)化?；谝陨显颍粭l蛋白的序列確定的情況下，所以會有不同的編碼基因，而且這些編碼序列也是可以預見。進一步地，上述基因含有SEQIDNo.6-10所示序列中的一種或多種；SEQIDNo.6所示的基因編碼第一多肽，SEQIDNo.7所示的基因編碼第二多肽，SEQIDNo.8所示的基因編碼第三多肽，SEQIDNo.9所示的基因編碼第四多肽，SEQIDNo.10所示的基因編碼第五多肽。含有上述基因的表達載體。通過表達載體連接能表達上述多肽的基因序列，可以通過原核表達的方法，大量表達目的蛋白；通過大量表達目的蛋白，然后可以大規(guī)模的應用。上述表達載體可以是連接單一目的蛋白的編碼基因的表達載體，也可以是一個表達載體連接同時連接兩個或以上的目的蛋白的編碼序列進行原核表達。含有上述基因的宿主菌。通過宿主菌，可以將目的蛋白大量表達。宿主菌通常是選用生長繁殖快，細胞周期短的菌類，通常選用大腸桿菌作為表達的宿主菌，比如BL21(DE3)、Rosetta等；當然，宿主菌也可以是其他類型的菌株。上述的多肽在制備抑制病毒感染的藥物中的應用。上述多肽通過研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白序列與病毒本身產(chǎn)生競爭性結(jié)合，擠占病毒的結(jié)合位點，使病毒無從結(jié)合，也就沒有辦法感染宿主，從而達到預防或治療感染的目的。所以，在藥物中應用也是可行的和安全的。一種抑制病毒感染的藥物，該藥物的活性成分為上述的多肽。進一步地，病毒是乙腦病毒和/或寨卡病毒。多肽為是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一種或多種時，多肽都能抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)；尤其是多肽為第五多肽是還具有抑制寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)的功能。進一步地，藥物的劑型為片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋劑、控釋劑或注射劑中的任意一種。藥物制成不同劑型，可以適用不同的人群、病癥；也方便用藥和給藥。上述的多肽在制備抑制病毒感染的抗體中的應用。由于上述的多肽能與病毒競爭性抑制，說明多肽具有與病毒相似的識別位點和空間取向、空間結(jié)構；通過多肽制備抗體，就可以避免使用減毒的病毒用于制備抗體，可以避免感染的風險，提高實驗的安全性；并且具有相同的效果；制備抗體能長期作用，避免多肽被降解或者分解，效果更顯著，也更有利于保藏。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供一種抑制病毒感染的多肽，該多肽是第五多肽；第五多肽的序列如SEQIDNo.5所示，第五多肽的編碼序列如SEQIDNo.10所示。實施例2本實施例提供一種抑制病毒感染的多肽，該多肽包括第一多肽、第二多肽；第一多肽的序列如SEQIDNo.1所示，第二多肽的序列如SEQIDNo.2所示；第一多肽的編碼序列如SEQIDNo.6所示，第二多肽的編碼序列如SEQIDNo.7所示。實施例3本實施例提供一種抑制病毒感染的多肽，該多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽，共五條多肽；第一多肽的序列如SEQIDNo.1所示，第二多肽的序列如SEQIDNo.2所示，第三多肽的序列如SEQIDNo.3所示，第四多肽的序列如SEQIDNo.4所示，第五多肽的序列如SEQIDNo.5所示；第一多肽的編碼序列如SEQIDNo.6所示，第二多肽的編碼序列如SEQIDNo.7所示，第三多肽的編碼序列如SEQIDNo.8所示，第四多肽的編碼序列如SEQIDNo.9所示，第五多肽的編碼序列如SEQIDNo.10所示。實施例4本實施例提供含有編碼實施例1提供的第五多肽的表達載體和宿主菌。本實施例中優(yōu)選以pET-28a作為主要表達載體，當然也可以用其他的載體作為第五多肽的表達載體。經(jīng)過對第五多肽的編碼基因的堿基序列以及結(jié)合pET-28a載體的多克隆位點的分析，選用多克隆位點HindⅢ和BamHI作為第五多肽的編碼基因在pET-28a載體上插入位點。第五多肽的表達載體的構建1.1人工合成第五多肽的編碼基因全長序列并在5’端加上BamHI，在3’端加上終止密碼和HindⅢ酶切序列，命名為PP5，序列為：GGATCCGCCTGGGACTTTGGCTCCATTGGAGGGGTCTTCAACTCCATAGGAAAAGCCGTTCACCAAGTGTTTTGAAAGCTT；1.2雙酶切pET-28a載體質(zhì)粒和PP5序列，酶切反應體系：HindⅢ和BamHI酶1μL，10×內(nèi)切酶反應緩沖液5μL，pET-28a載體質(zhì)粒/PP5序列15μL，ddH2O28μL；1.3瓊脂糖凝膠電泳回收pET-28a載體質(zhì)粒和PP5序列的雙酶切片段；1.4用T4連接酶連接回收的pET-28a載體質(zhì)粒和PP5序列的雙酶切片段，得到第五多肽的表達載體pET-28a-PP5載體質(zhì)粒；連接反應體系：pET-28a片段2μL，PP5序列片段6μL，T4ligasebuffer2μL，T4ligase1μL，ddH2O4μL；1.5將pET-28a-PP5載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliRosetta大腸桿菌感受態(tài)細胞，得到表達第五多肽的宿主菌?？梢灶A見的，第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽參考上述方法，也可以得到相應的表達載體和宿主菌。同樣地，如果將第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中任意兩條多肽或多條多肽的編碼基因串聯(lián)，或者第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中任意一條多肽的編碼基因串聯(lián)重復兩次或兩次以上，串聯(lián)的基因然后參考上述表達載體的構建方法和轉(zhuǎn)化宿主菌的方法，同樣也可以得到相應的多肽串聯(lián)表達載體和宿主菌。實施例5本實施例提供一種抑制病毒感染的藥物，將實施例1提供的第五多肽應用于制備抑制乙腦病毒或寨卡病毒感染的藥物中，能有效的抑制病毒的感染；當然，第五多肽也能同時的抑制乙腦病毒和寨卡病毒感染。將藥物制成注射劑的劑型，直接通過注射靜脈給藥，能快速的達到病灶，并發(fā)揮作用。當然，第五多肽制成抑制病毒感染的藥物的劑型還可以是片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋劑或控釋劑中的任意一種。實施例6本實施例提供了實施例1提供的第五多肽在制備抑制病毒感染的抗體中的應用。由于第五多肽能與乙腦病毒和寨卡病毒形成競爭性的抑制，與宿主的識別位點結(jié)合，說明第五多肽具有與病毒相似的識別位點和空間取向、空間結(jié)構；通過第五多肽制備的抗體，抗體能有效的識別第五多肽，抗體就能特異的識別出乙腦病毒和寨卡病毒，達到預防和抑制病毒感染的目的。實驗例1本實驗例提供細胞存活實驗，驗證第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽的毒性；本實驗例通過MTT法檢測細胞存活率，來驗證多肽的毒性。第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽分別設定5個濃度，分別是10μM，1μM，100nM，10nM，1nM。具體操作如下：1.1將細胞鋪到96孔板中，細胞密度為1.0×105個/mL；1.2將梯度稀釋的多肽(稀釋在含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入到細胞中)，培養(yǎng)24小時；1.3吸棄細胞上清，每孔加入25μL的MTT溶液(終濃度5mg/mL),并繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4小時；1.4孵育完畢后，吸棄殘余MTT溶液，并每孔加入50μLDMSO。1.5在室溫下充分溶液15分鐘后，通過酶聯(lián)免疫檢測儀492nm波長檢測每孔吸光度；1.6計算各孔吸光度與對照組吸光度的比值，計算各個濃度下對細胞活性的影響；細胞存活率(％)＝(實驗組OD492/對照組OD492)×100％結(jié)果如圖1所示，可以看出，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽以及sP5多肽在10μM的情況下，對細胞均表現(xiàn)出一定的抑制情況，說明不是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽本身毒性的影響，有可能是因為多肽的濃度高，影響滲透壓等因素導致的細胞被抑制；當濃度進一步降低后，基本上第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽以及sP5多肽基本上未表現(xiàn)出細胞毒性，可以認為第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽是安全沒有細胞毒性的。實驗例2本實驗例提供噬斑實驗驗證第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽體外抗乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)的情況。將乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)分別與不同濃度的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五種多肽37℃孵育1h，然后感染細胞，24h之后進行噬斑減少實驗。具體的操作方法如下：多肽抗病毒感染體外實驗：在BHK-21上面檢測多肽的抗病毒效果，將BHK-21細胞鋪板于24孔板細胞中，每孔約8×104個細胞，具體步驟如下：1.1按照感染復數(shù)為1(MOI＝1)用無血清的DMEM分別稀釋乙腦病毒JEV；1.2用稀釋好的病毒液稀釋五種多肽，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽均設置五個梯度，分別為10μM、1μM、100nM、10nM、1nM。五條多肽和病毒混合液37℃混合孵育1h；1.3吸棄培養(yǎng)板上舊的培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，并將不同濃度的病毒與多肽混合液加入到細胞板上，對照組設置為不加多肽但加入相同濃度的DMSO，感染等量的乙型腦炎病毒JEV；放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h；1.4吸棄多肽病毒混合液，用PBS洗一遍，加入10％的DMEM培養(yǎng)基；1.5在感染細胞24h的時候，計算第一到第五多肽的半數(shù)有效濃度，在感染細胞24h之后收樣。噬斑減少實驗檢測多肽抗病毒實驗：在多肽抗病毒感染實驗培養(yǎng)24h之后，收集上清至離心管中，-80℃保存。仍用BHK-21細胞測滴度，步驟如下：2.1準備96孔板，排槍，無血清DMEM，槍頭；2.2用排槍取180μL的無血清DMEM，取待測病毒樣20μL到第一個180μL的孔里，200μL混勻，依次稀釋做梯度；2.3將鋪好的BHK-21細胞取出，棄上清，加入不同滴度的病毒液，從低濃度向高濃度加；2.437℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。PBS洗，洗完后加上甲基纖維上層覆蓋物；2.5三天后，棄甲基纖維上層覆蓋物，加甲醛固定過夜。結(jié)晶紫染色15min。用水沖洗掉上層覆蓋物，在烘箱里烘干。多肽抑制病毒感染的計算公式為：抑制率％＝[1-(樣品噬斑數(shù)量/對照噬斑數(shù)量)]×100。實驗結(jié)果如圖2所示，(圖中：P1-P5分別代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的亂序多肽)，當乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)分別與不同濃度的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽混合后的噬斑實驗可以看出；第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽均有抑制病毒感染的效果，而且隨著多肽的濃度的升高，抑制效果明顯加強；通過對比發(fā)現(xiàn)，第五多肽的抑制效果相對優(yōu)于其余的多肽。表1多肽半數(shù)有效濃度多肽半數(shù)有效濃度IC50(nM)第一多肽3790.71第二多肽94.10第三多肽58.07第四多肽7.66第五多肽3.93通過計算第一多肽到第五多肽的半數(shù)有效濃度，其結(jié)果如表1所示，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽對乙腦病毒JEV的半數(shù)有效濃度IC50分別為3790.71nM、94.10nM、58.07nM、7.66nM和3.93nM；從表1中可以看出，除了第一多肽的半數(shù)有效濃度為3790.71nM，第一多肽的半數(shù)有效濃度的值較大；而第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的半數(shù)有效濃度均小于100nM，說明第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽在低濃度的條件下就能達到抑制乙腦病毒JEV的效果；尤其是第四多肽和第五多肽，在低于10nM濃度的條件下，就能達到效果，說明第四多肽和第五多肽抑制乙腦病毒JEV感染的效果最佳，是抑制乙腦病毒JEV感染的藥物等的最佳選擇。實驗例3本實驗例通過Westernblot的方法檢驗第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽體外抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)的情況。由于乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)具有感染宿主細胞的能力；如果存在感染，會導致病毒的核酸進入宿主細胞表達出病毒的包膜蛋白；如果有第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等多肽抑制劑的存在，病毒無法感染宿主，所以就不能堅持到目的條帶。Westernblot實驗的具體操作如下：參考實驗例2中收集的細胞樣品的方法收集樣品，然后進行樣品處理，將樣品定量并調(diào)整到統(tǒng)一的濃度。1.1配制10％的SDS-PAGE凝膠；1.2上樣15μL并電泳，上樣完成后，先60V電壓電泳，再以120電壓電泳；1.3轉(zhuǎn)膜，PVDF轉(zhuǎn)移目的蛋白，0.35A穩(wěn)流電泳2小時；1.45％脫脂奶粉(TBST配制)封閉PVDF膜1小時；1.5分別加第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽對應的一抗抗體(1:5000稀釋)，4℃孵育12h，水平搖床低速搖動；然后用TBST洗膜，每次15分鐘，洗三次；1.6將對應的辣根過氧化物酶標記的二抗抗體(1:5000)，水平搖床低轉(zhuǎn)速搖晃孵育2小時；用TBST洗膜，每次15分鐘，洗三次；1.7加入ECL發(fā)光液，并凝膠成像儀分析。實驗結(jié)果圖3所示，(圖中：P1-P5分別代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的亂序多肽)，從結(jié)果可以看出，相對于內(nèi)參GAPDH，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中，除了第一多肽有一條較淺的條帶，說明第一多肽的抑制效果不如其余多肽的效果；而且蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果也與實驗例1中的半數(shù)有效濃度結(jié)果吻合，由于第一多肽的抑制效果不如其余多肽，導致微量的目的條帶表達；其余多肽基本上都沒有明顯的目的條帶；說明第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽有抑制乙腦病毒的能力，且第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽具有較好的抑制乙腦病毒JEV作用。實驗例4本實施例通過qRT-PCR的方法驗證細胞是否感染乙腦病毒，進一步驗證第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽有抑制乙腦病毒的能力。參考實驗例2中1.1-1.5的實驗操作方法進行實驗并獲得細胞樣本。用Trizolti法提取細胞中的DNA樣本，進行qRT-PCR實驗。實驗結(jié)果如圖4所示，(圖中：P1-P5分別代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的亂序多肽)，實驗結(jié)果與噬斑實驗和westernblot實驗的結(jié)果一致，基本吻合；在高濃度(10μM)的多肽存在的情況下，對乙腦病毒JEV的抑制效果最高；隨著濃度的降低，抑制率也逐漸降低；第一多肽的抑制效果相對略低，而第五多肽的抑制效果最好。實驗例5本實驗例提供第五多肽體外抑制寨卡病毒ZIKV的實驗。本實驗例通過噬斑實驗和qRT-PCR實驗驗證第五多肽對寨卡病毒的抑制效果。噬斑實驗的操作方法參考實驗例2。qRT-PCR實驗操作方法參考實驗例4。結(jié)果如圖5和圖6所示，(圖中，JP5表示第五多肽)，從噬斑實驗和qRT-PCR實驗可以發(fā)現(xiàn)，第五多肽對寨卡病毒也表現(xiàn)出抑制的效果。實驗例6本實驗例提供驗證第五多肽在體內(nèi)抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)感染的能力。第五多肽體內(nèi)抑制乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)感染：將1μM的第五多肽和病毒(PFU為1×106、100μL的體積)在37℃孵育1h之后，腹腔注射到小鼠體內(nèi)，每天稱量體重以及觀察臨床癥狀。具體操作如下：4周齡BALB/c雌鼠分為三組，每組15只：PBS組(空白對照組)、JEV組(AT31株感染組)、JEV+P5組(感染治療組)。制備感染小鼠樣品。將第五多肽稀釋在病毒液中，最終每只小鼠用腹腔注射的方法感染1×106PFU的AT31(體積100μl)，感染治療組第五多肽的終濃度為1μM，感染組不加入多肽，但加入對應濃度的DMSO(濃度小于1％)。觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)與死亡數(shù)量。感染第7天收樣，每組各6只取腦組織勻漿，各3只進行石蠟包埋。每組仍各留6只小鼠，每天稱重并觀察臨床癥狀。結(jié)果如圖7所示，感染到5-9天左右，感染組明顯有小鼠體重減輕、毛發(fā)零亂，精神不振、四肢僵硬，而治療組小鼠體重減輕的個數(shù)和程度明顯低于感染組(圖7A)。感染至第10天，感染組小鼠死亡5只，死亡率高達83％，幸存的一只小鼠體重逐漸恢復并增長。而治療組感染到第10天死亡2只，小鼠死亡的數(shù)量、死亡出現(xiàn)的時間明顯少于或短于感染組，最終死亡率為33％(圖7B)，兩者差異顯著(P<0.01)。感染7天之后取各組小鼠的腦組織勻漿測病毒滴度，在感染組出現(xiàn)噬斑，滴度約103PFU，而在治療組的檢測結(jié)果中沒有噬斑的形成。實驗結(jié)果說明第五多肽可緩解乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)感染引起的臨床癥狀并降低死亡率。綜上所述，本發(fā)明實施例的提供的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽五條多肽能有效的抑制乙腦病毒的感染，而且第五多肽還有抑制在卡病毒的效果，在10μM的濃度條件下，效果較好；通過第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽能制備成相關的藥物和抗體同樣能有效的抑制病毒的感染。以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國科學院武漢病毒研究所<120>一種抑制病毒感染的多肽及其基因、藥物及應用<130>PA16031581SC<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>28<212>PRT<213>Flaviviridae<400>1SerThrLeuGlyLysAlaPheSerThrThrLeuLysGlyAlaGlnArg151015LeuAlaAlaLeuGlyAspThrAlaTrpAspPheGly2025<210>2<211>25<212>PRT<213>Flaviviridae<400>2GlySerIleGlyGlyValPheAsnSerIleGlyLysAlaValHisGln151015ValPheGlyGlyAlaPheArgThrLeu2025<210>3<211>35<212>PRT<213>Flaviviridae<400>3AlaAlaLeuGlyAspThrAlaTrpAspPheGlySerIleGlyGlyVal151015PheAsnSerIleGlyLysAlaValHisGlnValPheGlyGlyAlaPhe202530ArgThrLeu35<210>4<211>29<212>PRT<213>Flaviviridae<400>4AlaTrpAspPheGlySerIleGlyGlyValPheAsnSerIleGlyLys151015AlaValHisGlnValPheGlyGlyAlaPheArgThrLeu2025<210>5<211>22<212>PRT<213>Flaviviridae<400>5AlaTrpAspPheGlySerIleGlyGlyValPheAsnSerIleGlyLys151015AlaValHisGlnValPhe20<210>6<211>84<212>DNA<213>Flaviviridae<400>6agcacgctgggcaaagccttttcaacaactttgaagggagctcagagactggcagcgttg60ggtgacacagcctgggactttggc84<210>7<211>75<212>DNA<213>Flaviviridae<400>7ggctccattggaggggtcttcaactccataggaaaagccgttcaccaagtgtttggtggt60gccttcagaacactc75<210>8<211>105<212>DNA<213>Flaviviridae<400>8gcagcgttgggtgacacagcctgggactttggctccattggaggggtcttcaactccata60ggaaaagccgttcaccaagtgtttggtggtgccttcagaacactc105<210>9<211>87<212>DNA<213>Flaviviridae<400>9gcctgggactttggctccattggaggggtcttcaactccataggaaaagccgttcaccaa60gtgtttggtggtgccttcagaacactc87<210>10<211>66<212>DNA<213>Flaviviridae<400>10gcctgggactttggctccattggaggggtcttcaactccataggaaaagccgttcaccaa60gtgttt66當前第1頁1 2 3