胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽es61編碼基因的克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下：（1）提取人絨毛組織總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；（2）設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物將目標(biāo)基因擴(kuò)增出來；（3）PCR產(chǎn)物的回收和純化；（4）基因酶切連接轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的能夠有效克隆該ES61編碼基因，方便了以后ES61多肽基因的定量檢測，為以后研究ES61多肽基因功能奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cell, ES細(xì)胞)是在胚胎發(fā)育早期存在的一類細(xì)胞，具有全能性，能分化成為生物體的各個(gè)組織器官；RP4-792G4.2 (NCBI登陸號HG492132.1)基因是目前發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)于ES細(xì)胞等多能干細(xì)胞中的一類不能翻譯蛋白質(zhì)的ncRNA (non-coding RNA, ncRNA),研究發(fā)現(xiàn),RP4-792G4.2基因可以編碼一種有61個(gè)氛基酸組成的多肽，命名為ES61多肽，編碼ES61多肽的核苷酸序列由183個(gè)堿基組成，編碼61個(gè)氨基酸，此氨基酸經(jīng)過生物信息學(xué)分析存在典型分泌信號肽序列。
[0003]目前尚沒有人報(bào)道針對該多肽ES61編碼基因的克隆方法，因此難以完成對該ES61多肽基因的定量檢測，以進(jìn)一步研究該多肽的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種有效的針對胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明公開了一種胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下:
[0006](I)提取人絨毛組織總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0007](2 )設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物將目標(biāo)基因擴(kuò)增出來；
[0008](3) PCR產(chǎn)物的回收和純化；
[0009](4)基因酶切連接轉(zhuǎn)化。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(2)的具體操作為:在ES61后面添加HA標(biāo)簽序列，上下游引物兩端分別添加XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶序列，引物擴(kuò)增片段總長度為234bp ;將目標(biāo)片段克隆連接到PLEGFP-N1真核生物表達(dá)載體中，引物序列如下:
[0011]ES61-F:5’-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，
[0012]
【權(quán)利要求】
1.一種胚胎干細(xì)胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下: (I)提取人絨毛組織總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ； (2 )設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物將目標(biāo)基因擴(kuò)增出來； (3)PCR產(chǎn)物的回收和純化； (4)基因酶切、連接、轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)的具體操作為:在ES61后面添加HA標(biāo)簽序列，上下游引物兩端分別添加XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶序列，引物擴(kuò)增片段總長度為234bp ;將目標(biāo)片段克隆連接到PLEGFP-N1真核生物表達(dá)載體中，引物序列如下:
ES61-F:5，-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，ES61 -R: St -CCCMGCTTAGCC/mATCTGGAACATCGTATGGGT+ACATGGCGGCCTTGCACTCCGCGT-1f 用上述引物配合如下反應(yīng)體系=PCR為50 μ I總體系，具體是5XPhusion HFBufferlOy 1,2.5mM dNTPmix5 μ 1，IOmM 的上下游引物各 2 μ l,2U/y I 的 Phusion DNA聚合酶0.8 μ I，人絨毛組織cDNA模板2 μ I，用滅菌水補(bǔ)足50 μ I體系，反應(yīng)條件為“降落PCR”:95 0C 5min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)98°C IOs變性，從68°C每個(gè)循環(huán)降1°C退火，72°C延伸20s, 10個(gè)循環(huán)；在60°C退火，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，然后16°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，用XhoI和HindIII酶對上述PCR產(chǎn)物和PLEGFP-N載體進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下:10X Buffer4 μ I，DNA約2 μ g，內(nèi)切酶(?ου/μ I)各1μ 1，滅菌去離子水補(bǔ)足到40μ 1，反應(yīng)條件37°C、lhr。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，連接反應(yīng)體系如下:目的片段DNA2y 1，PLEGFP-N1載體0.5μ 1，了4連接酶1“ I, IOX T4Bufferl μ I滅菌去離子水補(bǔ)足到10 μ 1，22。。連接30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，轉(zhuǎn)化步驟如下:取連接產(chǎn)物加到100 μ 1DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30分鐘；將上述轉(zhuǎn)化液置于42°C水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分鐘；向其中加入900μ 137°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，150rpm、37°C振蕩培養(yǎng)45分鐘；2500rpm離心5min，將上清液吸走，留100 μ I混勻菌液，加到含Kana抗生素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開；待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。
【文檔編號】C12N15/10GK103865920SQ201310753802
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】張茂雷, 陳杰 申請人:廣州達(dá)恩基因科技有限公司