專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的人工體外制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的人工體外制備方法。本發(fā)明還涉及所 述寡聚體在制備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉樣肽寡聚體(亦稱(chēng)為Αβ寡聚體)被認(rèn)為是阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)早期病理改變的始動(dòng)因素。最新研究表明，只有低分子量A β寡聚體才是引 起AD神經(jīng)元損傷的毒性物質(zhì)，高分子量聚集物和纖維成分不具有這種作用。在人體外人工 制備該淀粉樣肽寡聚體，有助于研究阿爾茨海默病的致病機(jī)理和治療方法。淀粉樣肽在體外容易形成包含纖維和不具有纖維形態(tài)的高分子量或低分子量聚 集物在內(nèi)的混合物。這種組分不均一的混合物影響研究的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，獲得穩(wěn) 定均一的低分子量Αβ寡聚體對(duì)科研工作非常重要。眾多學(xué)者曾采用多種方法制備Αβ寡聚體，但收率和效果比較低，并且所得Αβ寡 聚體的成分不均一，含有較多成分的高分子量聚集物和纖維狀成分，難以進(jìn)一步提純。如， 利用化學(xué)交聯(lián)法制備的寡聚體在成分上有差異，不能真實(shí)反應(yīng)低分子量A β寡聚體的作用 特點(diǎn)。而且各制備方法的條件不穩(wěn)定，所得結(jié)果難以比較。有些方法和材料具有較大的不 良反應(yīng)，影響試驗(yàn)者和應(yīng)用者的健康。因此，研制一種新型人工體外淀粉樣肽寡聚體制備方法，獲得均一可溶性低分子 量的淀粉樣肽寡聚體，確有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的制備方法，直接目的是提供 均一分子量的淀粉樣肽寡聚體，具有特征性的超微形態(tài)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，可用于制備阿爾茨海 默病的診斷試劑和治療藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的人工體外制備方法，其特征是將A β多肽的單 體用無(wú)水二甲基亞砜溶解后，于4°C置于緩沖體系中反應(yīng)22 26小時(shí)，使其自然聚合形 成寡聚體；所述緩沖體系組成是NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L, NaHC0326mmol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, MgS04 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L。所述淀粉樣肽特指由其前體蛋白APP(amyloid precourcer protein)經(jīng)過(guò)蛋白酶 降解形成的表觀分子量為4kD的多肽；本發(fā)明所用的緩沖體系是改良的人工腦脊液，在傳統(tǒng)人工腦脊液的基礎(chǔ)上調(diào)整了 葡萄糖和氨基酸含量，其改良后的組成接近于正常腦脊液，有利于模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件。最佳反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。所得寡聚體是在透射電鏡下觀察為直徑IOOnm以下的球形顆粒物，分子量為16 40kD。
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所述Αβ多肽的單體可以用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法制備，如，以Αβ 42為原料，通過(guò) 六氟異丙醇(l，l，l，3，3，3-hexafluoro-2-propannol，HFIP)的作用使其單體化。所述A β 42基因序列是已知的，Genebank登錄號(hào)BC065529 ；本發(fā)明提供了一種用基因重組的方法得到淀粉樣肽單體，更為經(jīng)濟(jì)和環(huán)保，所得 到的淀粉樣肽單體質(zhì)量更好，方法是在N端加組氨酸標(biāo)簽(6XHis)，C端加終止子序列 TGA,構(gòu)建A β 42單體表達(dá)載體，按照常規(guī)方法在大腸桿菌表達(dá)體系內(nèi)表達(dá)，用Ni柱純化目 的多肽。然后于室溫下將A β 42單體溶于冰預(yù)冷1 2h的六氟異丙醇，通過(guò)送風(fēng)揮發(fā)，完 全除去六氟異丙醇，形成肽膜。本發(fā)明所制備的人工體外淀粉樣肽寡聚體在電子顯微鏡下分析，可以看到納米級(jí) 的微粒。利用圓二色譜(Circular dichroism,⑶)法分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以檢測(cè)到特征性 的寡聚體負(fù)峰。利用蛋白免疫印跡的方法可以驗(yàn)證制備出分子量在16. 5kD范圍內(nèi)的Αβ寡聚體。本研究首先構(gòu)建了 Αβ單體的原核表達(dá)雜載體，誘導(dǎo)表達(dá)并且純化后，通過(guò)HFIP 將其單體化，用蛋白免疫印跡的方法驗(yàn)證獲得了所需的單體。本發(fā)明對(duì)制備的人工體外淀粉樣肽寡聚體進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)1、免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證所得寡聚體是成分均一的，并且具有免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示所得寡聚體能夠被抗人Αβ單克隆抗體6Ε10特異性識(shí)別，并且在 16. 5kD左右的范圍內(nèi)有均一條帶(見(jiàn)實(shí)施例3)。說(shuō)明所得寡聚體是低分子量的均一成分， 并且具有免疫反應(yīng)性。用于蛋白質(zhì)免疫印跡的最佳淀粉樣肽寡聚體樣品質(zhì)量為5 μ g/孔。2、透射電鏡檢測(cè)目的驗(yàn)證所得寡聚體是納米級(jí)的均一微粒。結(jié)果顯示在透射電鏡下觀察到5nm到IOnm左右的球形寡聚體，隨著聚集過(guò)程，出 現(xiàn)顆粒狀以及20-30nm的卷曲結(jié)構(gòu)和絲狀或分枝狀的纖維(見(jiàn)實(shí)施例4)。說(shuō)明所得寡聚體 具有特征性的超微結(jié)構(gòu)。3、圓二色譜檢測(cè)目的驗(yàn)證所得寡聚體具有特征性的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示聚集過(guò)程中α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)變(見(jiàn)實(shí)施例5)。說(shuō)明所得寡聚體獲 得了特征性的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用本發(fā)明獲得的淀粉樣肽寡聚體可以制備出診斷、預(yù)防和治療阿爾茨海默病的藥 物、試劑等。例如，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和/或表達(dá)多種小分子基因工程疫苗、多肽疫 苗，以便用于AD預(yù)防和早期治療的基礎(chǔ)與臨床研究和應(yīng)用。本發(fā)明人以所獲得的淀粉樣肽寡聚體作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用夾心ELISA法(酶聯(lián)免疫 吸附試驗(yàn))^Western blot實(shí)驗(yàn)、透射電鏡和CD等實(shí)驗(yàn)方法，分別制備出了四種不同方法的 檢測(cè)阿爾茨海默病的試劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)首先，本發(fā)明模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，以Αβ為原料在體外組裝淀粉樣肽寡聚體，所得
4產(chǎn)物穩(wěn)定均一。這一點(diǎn)優(yōu)于其它“化學(xué)交聯(lián)”法的效果。其次，本發(fā)明優(yōu)化了制備中的關(guān)鍵參數(shù)，所得產(chǎn)物可以作為多種AD檢測(cè)和治療研 究的標(biāo)準(zhǔn)參照物。確定了獲得Αβ單體的最佳方法、改良人工腦脊液組成、確定關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn) 為 24h。第三，用基因重組方法得到單體的好處是，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、基因能夠在體外擴(kuò)增和表 達(dá)，可再生性強(qiáng)。


圖1為Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證單體的獲得。單體條帶位于6. 5kD下方附近約4kD 的位置。圖2為Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證淀粉樣肽寡聚體形成的結(jié)果。圖中1為淀粉樣肽 的單體；圖中2為淀粉樣肽的寡聚體，條帶位于16. 5kD下方位置。圖3為透射電鏡下淀粉樣肽寡聚體的形態(tài)特征。A.只有寡聚體形成，沒(méi)有纖維狀 或分枝狀的結(jié)構(gòu)；B.有大量纖維形成。圖4圓二色譜檢測(cè)淀粉樣肽寡聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)特征(于24h時(shí)可見(jiàn)明顯的負(fù)峰)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1淀粉樣肽單體的獲得1、基因重組法Αβ 42基因(Genebank登錄號(hào)BC065529)委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司合成，并安裝在帶有6XHis標(biāo)簽的原核表達(dá)載體上組成NAbeB-pET30a表達(dá)質(zhì)粒。然 后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取NAbeB-pET30a-BL21凍存菌液，在Kana抗性的 LB培養(yǎng)板上劃線(xiàn)，37°C培養(yǎng)12 16h ；挑取生長(zhǎng)良好的單菌落到7ml具有Kana抗性的LB 培養(yǎng)液中，260rpm，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；大約培養(yǎng)4h后菌液OD值達(dá)到0. 6，此時(shí)加入終濃度為 lmmol/1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，6h后12000rpm，4°C離心15min收集菌體；用PBS洗滌菌體兩次， 12000rpm，4°C離心15min收集菌體；每500ml菌液收集的菌體中加入30ml裂解液重懸細(xì) 菌，充分混和，300w，工作10s，間歇15s超聲破碎菌體90分鐘；12000rpm，4°C離心15min，將 上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-80°C保存。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。平衡Ni柱子，每個(gè)15ml離心管中取0.6ml Ni-NTA Agarose (QIAGEN公司產(chǎn)品)，分別加入2ml裂解緩沖液(QIAGEN公司產(chǎn)品)，混勻，室 溫5440g離心Imin棄上清，重復(fù)3次；將菌液上清30ml于Ni-NTAAgarose混合后，室溫 200rpm搖動(dòng)IOmin ；5440g離心lmin，上清轉(zhuǎn)入一新的離心管中，標(biāo)記為FL ；每個(gè)離心管 中的Ni-NTAAgarose用5ml的洗滌緩沖液(washing buffer) (QIAGEN公司產(chǎn)品)洗滌兩 次，5440g，離心lmin，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，標(biāo)記為Wl和W2 ；每管用2ml的洗脫緩沖液 (elution buffer) (QIAGEN公司產(chǎn)品)洗脫三次，5440g，離心lmin，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中 標(biāo)記為El ；將上述得到的上清取少量行SDS-PAGE電泳，其余_80°C保存。El即為Aβ 42多 肽。對(duì)淀粉樣肽進(jìn)行單體化處理。將其Img溶于冰預(yù)冷的六氟異丙醇(1，1，1，3，3， 3-hexaf luoro-2-propannol, HFIP) (Sigma)，室溫，風(fēng)速 4. 5m/s，2. 5h 后使 HFIP 揮發(fā)殆盡。這時(shí)，在微量離心管的底部管壁形成薄薄的一層肽膜。2、化學(xué)合成法A β 42肽(Genebank登錄號(hào)BC065529)也可以由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司合成。單體化的方法同“基因重組法”的處理所獲得的單體溶解后取樣，通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證，詳細(xì)步驟見(jiàn)實(shí)施例3，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例2淀粉樣肽寡聚體的組裝將實(shí)施例1所得的肽膜用無(wú)水二甲基亞砜(DMSO) (Sigma) 20 μ 1溶解，最后將其 置于改良的人工腦脊液緩沖體系(體積相應(yīng)補(bǔ)足至1ml)、置4°C，24h，使其自然聚合，用 Western blot檢測(cè)寡聚體的制備情況。改良的人工腦脊液緩沖體系的組成NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L，NaHCO3 26mmol/L, CaCl2 2. 5mmol/L, MgSO4 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L.在肽膜剛剛被DMSO溶解加入到改良的人工腦脊液緩沖體系時(shí)，也就是組裝過(guò)程 中的Os取樣品5 μ L，以備Western blot檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證單體的獲得。在組裝過(guò)程中的24h取 樣品，以備Western blot檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證寡聚體的獲得。詳細(xì)步驟見(jiàn)實(shí)施例3。實(shí)施例3免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)分子量和免疫反應(yīng)性驗(yàn)證單體和寡聚體的獲得2、實(shí)驗(yàn)方法取組裝過(guò)程中Os和24h留取的5 μ g樣品，加上1/4體積的5X樣品緩沖液，混 勻后上樣，先以100V電壓使蛋白通過(guò)濃縮膠。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓使其恒定在 120V。當(dāng)溴酚藍(lán)泳動(dòng)至凝膠底部時(shí)，結(jié)束電泳，取下凝膠，常規(guī)用考馬斯亮藍(lán)R-250染色法 染色；將凝膠和硝酸纖維素膜分別放入裝有印跡緩沖液的容器里平衡lOmin，依次在放入 濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，成“三明治”狀，倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液，膠面朝負(fù)極，NC膜面朝向正極，小 心避免并趕去氣泡。接通電源，使恒流80mA連續(xù)轉(zhuǎn)移2h，切斷電源。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用麗春紅S染色液(10X麗春紅S貯存液配制方法為稱(chēng)取麗春紅S 2g，三氯乙酸30g，璜基水楊酸30g，加水至100ml;用時(shí)按照1 10的比例用用去離子水稀 釋)確定蛋白條帶位置，做相應(yīng)的標(biāo)記。用封閉液封閉硝酸纖維素膜(稱(chēng)取脫脂奶粉5g， 溶于 0. lmol/LPBST (NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4. 1. 44g, KH2PO4. 0. 44g, Tween-200. 05ml，補(bǔ) ddH20至1L，pH7. 2 7. 4) 100ml)，4°C封閉過(guò)夜。用封閉液稀釋單抗6E10 (Sigma)，濃度一 般為0. 2 1 μ g/ml，于4°C孵育12 14h，或于20 37°C孵育2h。用0. lmol/L PBST洗 滌硝酸纖維素膜4次，每次5 lOmin。用PBS稀釋HRP標(biāo)記的二抗，稀釋度為1 1000， 室溫孵育lh。用0. lmol/L PBST洗滌硝酸纖維素膜4次，每次5min。按照PIERCE化學(xué)發(fā) 光試劑盒說(shuō)明，將A液和B液等體積混合，加在硝酸纖維素膜上，2 5min后，用X光片曝光 顯影，觀察結(jié)果。用Quantity One software (BIO-RAD)軟件進(jìn)行條帶半定量。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果組裝Os時(shí)樣品內(nèi)的蛋白條帶位于6. 5kD下方附近約4kD的位置，這是對(duì)A β 42單 體化以后的結(jié)果，見(jiàn)圖1和圖2的第1泳道。組裝24h時(shí)樣品內(nèi)的蛋白條帶位于16. 5kD下 方附近約15kD的位置，這是對(duì)A β 42寡聚體的位置，可能是3 4聚體的位置，見(jiàn)圖2的第2泳道。4、結(jié)論通過(guò)基因重組的方法獲得了 A β 42單體，約4kD左右，分子量大小符合。在體外組 裝后獲得了 A β 42寡聚體，約15kD左右。并別這些蛋白能夠被抗人A β單抗6Ε10特異性 識(shí)別，說(shuō)明其具有正確的免疫反應(yīng)性。實(shí)施例4透射電鏡檢測(cè)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹男螒B(tài)上驗(yàn)證獲得了 A β 42寡聚體。2、實(shí)驗(yàn)方法以銅網(wǎng)正面吸附樣品1.5min，吸去銅網(wǎng)上過(guò)量的樣品。將銅網(wǎng)正面貼附于 PH6.8的磷鎢酸lmin，然后吸去銅網(wǎng)上多余的磷鎢酸，將銅網(wǎng)置室溫干燥。利用透射電鏡 TECNAI12 (FEI，Eindhoven, Netherlands)在加速電壓100KV，放大倍數(shù)為5-11萬(wàn)倍的條件 下觀察。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，體外組裝24h時(shí)，寡聚體最穩(wěn)定。在透射電鏡下，觀察到從5nm到IOnm 左右的球形、顆粒狀無(wú)定形結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3A。此外，可以觀察到這種小顆粒進(jìn)一步聚集，形成直 徑約5-lOnm，長(zhǎng)約20-30nm的卷曲分支樣結(jié)構(gòu)。未觀察到絲狀、棒狀長(zhǎng)短不同的纖維狀結(jié) 構(gòu)。但是，24h之后，就進(jìn)入快速纖維化的過(guò)程。在透射電鏡下，觀察到絲狀和分枝狀的纖維 結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3B。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本方法制備的Αβ 42寡聚體具有正確的超微形態(tài)特征。實(shí)施例5圓二色譜檢測(cè)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹姆肿佣?jí)結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證獲得了 A β 42寡聚體。2、實(shí)驗(yàn)方法取體外組裝的Aβ 42寡聚體，進(jìn)行圓二色譜(Circular dichroism, CD)檢測(cè)。CD 色譜儀為JASC0-J700SpectrOpOlarimeter(中科院生物物理研究所大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室)。掃描條件范圍240 190nm，石英杯徑1mm，靈敏度5m° /cm，分辨率0. 5nm，狹縫lnm， 時(shí)間常數(shù)8sec，掃描速度5mm/min，每個(gè)樣品累計(jì)3次。測(cè)定溫度為室溫，以同種離子條件 的緩沖液作為參比。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本研究的實(shí)驗(yàn)體系中，在0s、8h、和12h抽取的樣品檢測(cè)到正峰，代表 其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主；從24h的樣品中檢測(cè)到明顯的負(fù)峰，提示形成了 β-折 疊，見(jiàn)圖4。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本方法制備的A β 42寡聚體具有正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。
權(quán)利要求
一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的人工體外制備方法，其特征是將Aβ多肽的單體用無(wú)水二甲基亞砜溶解后，于4℃置于緩沖體系中反應(yīng)22～26小時(shí)，使其自然聚合形成寡聚體；所述緩沖體系組成是NaCl 125mmol/L，KCl 3.3mmol/L，KH2PO4 1.2mmol/L，NaHCO3 26mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，MgSO4 2.4mmol/L，葡萄糖5mmol/L，氨基酸0.3g/L。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述Aβ多肽的單體是用基因重組的方法得到淀粉樣肽單體。
3.權(quán)利要求1所述的方法，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，所得的寡聚體是在透射電鏡下觀察直徑IOOnm以下的 球形顆粒物，分子量為16 40kD。
5.一種基因重組制備Αβ多肽的單體的方法，在N端加組氨酸標(biāo)簽組6XHis，C端加 終止子序列TGA，構(gòu)建A β 42單體表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)體系內(nèi)表達(dá)，用Ni柱純化目的 多肽；然后于室溫下將A β 42單體溶于冰預(yù)冷1 2h的六氟異丙醇，通過(guò)送風(fēng)揮發(fā)，完全除 去六氟異丙醇，形成肽膜。
6.一種人工腦脊液，其組成是NaCl 125mmol/L, KCl 3. 3mmol/L, KH2PO4 1. 2mmol/L, NaHCO3 26mmol/L, CaC12 2. 5mmol/L, MgS04 2. 4mmol/L，葡萄糖 5mmol/L，氨基酸 0. 3g/L。
7.權(quán)利要求1所得到的低分子量淀粉樣肽寡聚體在制備診斷、預(yù)防和治療阿爾茨海默 病的藥物、試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是將權(quán)利要求1所得到的低分子量淀粉樣肽寡聚體 作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)、透射電鏡或CD實(shí)驗(yàn)方法，分 別制備檢測(cè)阿爾茨海默病的試劑。
全文摘要
一種低分子量淀粉樣肽寡聚體的人工體外制備方法和用途，其特征是將基因重組方法得到的Aβ多肽的單體用無(wú)水二甲基亞砜溶解后，置于緩沖體系中反應(yīng)，使其自然聚合形成寡聚體。本發(fā)明提供的基因重組得到單體的方法經(jīng)濟(jì)、環(huán)保；以Aβ為原料在體外組裝淀粉樣肽寡聚體時(shí)，通過(guò)模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，改良人工腦脊液組成，所得產(chǎn)物穩(wěn)定均一。本方法制備的寡聚體可以作為多種阿爾茨海默病檢測(cè)和治療研究的標(biāo)準(zhǔn)參照物，在制備阿爾茨海默病診斷試劑和治療藥物中獲得應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101948523SQ20101026425
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者張瑩, 彭向雷, 洪濤 申請(qǐng)人:北京交通大學(xué)