本發(fā)明涉及一種骨髓蛋白質(zhì)的制備方法及其應(yīng)用，是利用新疆資源豐富的骨骼為原料制備的具有抗菌活性蛋白質(zhì)，具有抗細(xì)菌、抗真菌等生物活性，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)：

畜牧業(yè)是新疆最具特色的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，是新疆農(nóng)業(yè)的重要組成部分，是新疆農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，也是各族人民賴以生存和發(fā)展的重要基礎(chǔ)。新疆擁有可利用草場面積0.48億hm²，占全國可利用天然草場總面積的23％；擁有耕地412.46萬hm²，農(nóng)作物飼草料資源豐富；各族群眾具有從事畜牧業(yè)生產(chǎn)的悠久傳統(tǒng)和豐富經(jīng)驗(yàn)；具有發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)的良好資源條件和物質(zhì)基礎(chǔ)，是我國重要的良種畜和畜產(chǎn)品生產(chǎn)基地。

2009年我區(qū)畜牧業(yè)總產(chǎn)值達(dá)到318.37億元，占農(nóng)業(yè)產(chǎn)值的24.5％(受棉花等經(jīng)濟(jì)作物效益高的影響)，低于全國平均水平。主要畜產(chǎn)品產(chǎn)量快速增長，2009年畜產(chǎn)品總量達(dá)到305.15萬t。肉類總產(chǎn)量達(dá)到115.4萬t，占到畜產(chǎn)品總量的43.7％，肉類人均占有量居全國第17位，其中羊肉人均占有量居全國第3位，牛肉人均占有量居全國第3位。奶類產(chǎn)量125.24萬t，占到畜產(chǎn)品總量的47.5％，人均占有量居全國第6位。蛋類產(chǎn)量23.2萬t，占到畜產(chǎn)品總量的8.8％。禽肉產(chǎn)量8.1萬t，占到畜產(chǎn)品總量的3.0％。反應(yīng)出新疆羊肉、牛肉和奶業(yè)依然是畜產(chǎn)品中競爭力比較強(qiáng)的主要產(chǎn)品。

將新疆、內(nèi)蒙古、西藏、青海、甘肅五大牧業(yè)省區(qū)主要畜產(chǎn)品產(chǎn)量數(shù)據(jù)經(jīng)過計(jì)算取得相關(guān)比較參數(shù)，即可得到各省區(qū)主要畜產(chǎn)品競爭力的比較值。新疆主要畜產(chǎn)品競爭力(參數(shù))由強(qiáng)到弱的排序?yàn)椋貉蛉?5.93176)—牛肉(2.12851)—奶類(1.76865)—禽肉(0.26783)—豬肉(0.23718)—禽蛋(0.12540)。

我國是個畜禽消費(fèi)大國，但多集中于畜禽肉類的消費(fèi)，大量的畜禽骨骼得不到充分利用，既浪費(fèi)了這種營養(yǎng)成分豐富且比例合理的資源，又在骨處理的問題上污染了環(huán)境，造成一定的環(huán)境壓力。

畜禽骨骼中蛋白質(zhì)的利用方面，骨蛋白較為重要。骨中的蛋白質(zhì)含量很高，且屬較為全價(jià)的可溶性蛋白質(zhì)，生物活性較高。我國的蛋白質(zhì)資源一直比較緊張，這種資廢棄物資源的開發(fā)利用對緩解蛋白資源短缺的有效途徑。畜禽骨骼由骨膜，骨質(zhì)，骨髓構(gòu)成，是蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)“再構(gòu)成管狀”管內(nèi)充滿了含多種營養(yǎng)物質(zhì)的骨髓，如構(gòu)成腦組織的磷脂及防止老化的骨膠原，軟骨素等，鮮骨中含有蛋白質(zhì)，脂肪，礦物質(zhì)，如鈣，磷，鐵等，骨膠原，軟骨素以及維生素等，尤其是的鈣磷比非常接近人體鈣吸收的最佳比例，是理想的天然鈣源，

骨髓是動物器官中十分重要的一個部分，造血干細(xì)胞就由骨髓供應(yīng)，俗話說骨髓補(bǔ)血，骨髓不僅味道好，營養(yǎng)價(jià)值確實(shí)不錯。尤其是骨髓化到湯里后變白的湯最有營養(yǎng)，最香,是動物當(dāng)中最有營養(yǎng)的動物的骨頭中含有多種對人體有營養(yǎng)、滋補(bǔ)和保健功能的物質(zhì)，具有添骨髓、增血液、減緩衰老、延年益壽的保健功效。

動物骨髓中富含有利于智力發(fā)育的磷脂質(zhì)、磷蛋白等，骨頭中含有豐富的鈣質(zhì)，都是很有營養(yǎng)的食物，一般人都可以食用，骨髓中脂肪含量較高，肥胖、高脂血癥等病人不宜過多食用。骨頭中的鈣需要長時間的熬制，使鈣質(zhì)充分溶出，才容易被人體利用。

化學(xué)成份：牛髓每100g含水3g，蛋白質(zhì)0.5g，脂肪95.8g，灰分0.3g，硫胺素微量，核黃素0.01mg，煙酸0.05mg。其脂肪酸含率如次：月桂酸0.1％，肉豆蔻酸2.6％，棕櫚酸32.3％，硬脂酸15.5％，十四(碳)烯酸0.7％，十六(碳)烯酸3.0％，油酸43.2％，亞油酸2.6％，不皂化物0.5-0.6％。

我國的蛋白質(zhì)資源緊張有重要意義，在骨蛋白的利用上，國外許多研究者致力于應(yīng)用酶解技術(shù)：如采用豬的胃蛋白酶進(jìn)行了酶解雞頭骨蛋白的研究，并測定了酶解物氨基酸成分含量，而國內(nèi)的研究人員也做了不懈的工作，趙勝年等進(jìn)行了酶法水解鮮牛骨的研究“采用胰酶進(jìn)行水解反應(yīng)”確定了最適酶解條件，何建軍以小雜魚和鏈魚下腳料為原料“加酶分解蛋白質(zhì)”并進(jìn)行恒溫發(fā)酵，研制了淡水魚露周濤等運(yùn)用木瓜蛋白酶酶解鮐魚頭骨等加工廢棄物，并運(yùn)用不同顆粒大小的活性炭對水解液進(jìn)行脫色制得營養(yǎng)價(jià)值高水溶性好的蛋白水解物，余杰、陳美珍運(yùn)用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對酶解鰻魚頭的最適工藝條件進(jìn)行了詳細(xì)研究，采用粉末狀活性炭進(jìn)行脫苦脫色，并研制出一種味道鮮美的高級海鮮風(fēng)味調(diào)料王朝旭等，采用了胰蛋白酶對鮮豬骨進(jìn)行了酶法水解的研究，趙霞、馬麗珍介紹了酶解利用骨蛋白的主要工藝以及蛋白水解物的脫苦方法牛骨蛋白的水解研究過去多集中在純酶生產(chǎn)上鐘秋平等另辟蹊徑，利用固體曲法結(jié)合低度鹽稀醪對牛骨蛋白進(jìn)行了水解，由于食鹽的防腐作用，防止了水解液在水解過程中的腐敗，通過研究確定了固體曲法水解牛骨蛋白的最佳方法也探索出一條能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的最佳工藝途徑，骨蛋白食品用于美容保健品，還可滿足生長期兒童，恢復(fù)期病人老年人及高體能消耗的運(yùn)動員等特殊人群的營養(yǎng)需求，王顯倫楊桂蘋"等分別進(jìn)行了骨蛋白水解研究，測定了水解液中的氨基酸含量，李泰等人開發(fā)了骨參飲料這一動植物蛋白復(fù)合的營養(yǎng)型飲料用畜禽骨生產(chǎn)小肽為了更好的利用骨蛋白，研究者的研究方向?yàn)榈鞍姿馕锒嚯?，研究表明，多肽類食品比蛋白質(zhì)類食品具有更為優(yōu)越的理化特性，營養(yǎng)特性和功能特性，將蛋白質(zhì)水解為多肽，其意義不僅在于提高蛋白質(zhì)類食品的價(jià)值，而且使一些從前難以開發(fā)的蛋白質(zhì)資源以多肽類食品的形式得以利用，白恩俠，張衛(wèi)柱進(jìn)行了動物骨生產(chǎn)水肽的工藝研究，利用牛骨為原料，采用溫和的提取，水解方法，在保持其原有效成分的同時，對其所含蛋白質(zhì)制備成小肽的工藝進(jìn)行研究，采用高壓蒸煮及酶水解方法來制備易被人吸收的小肽及氨基酸#用毛皮動物骨及禽類骨時只需將水解條件進(jìn)行試驗(yàn)調(diào)整即可對畜禽骨資源的開發(fā)利用具有普遍意義。

對于新疆這樣的畜牧大區(qū)來說這個方面的研究領(lǐng)處于空白，這不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，因此本發(fā)明在已有的工作基礎(chǔ)上對于新疆骨髓中活性多肽進(jìn)行了系統(tǒng)的提取分離和活性評價(jià)研究，通過幾十種提取方法的比較總結(jié)出了三種得率高、高純度和具有廣泛抗微生物活性的方法，并保證多肽的本性，提取率高，成本低的制備方法，為新疆骨髓資源的充分利用和提供附加值了提供了科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于，提供一種骨髓蛋白質(zhì)的制備方法及其應(yīng)用，該方法中的原料為動物屠宰后骨骼中的骨髓，采用緩沖液或無機(jī)鹽溶劑提取，將處理之后的新鮮骨髓蛋白質(zhì)分別利用緩沖液三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液Tris–HCl(0.1mol/L,8.4)和氯化鈉溶液攪拌提取，其中的脂質(zhì)成分由石油醚或正己烷脫脂，其后水提取物部分濃縮、透析脫鹽、再利用冷凍干燥精制而成的骨髓蛋白質(zhì)。該骨髓蛋白質(zhì)被驗(yàn)證其抗細(xì)菌和真菌活性，具有廣泛的抗微生物活性，同時具有增強(qiáng)體液免疫及全身免疫的功能，富含人體易消化和吸收的純天然來源多肽。該多肽既保留了骨髓蛋白質(zhì)營養(yǎng)的同時還實(shí)現(xiàn)變廢為寶和資源充分利用的目的；該骨髓多肽粉作為天然抗菌劑、食品添劑或藥物，可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

本發(fā)明所述的一種骨髓蛋白質(zhì)的制備方法，該方法中的原料為動物屠宰后骨骼中的骨髓，采用緩沖液或無機(jī)鹽溶劑提取，具體操作按下列步驟進(jìn)行：

緩沖液提?。?/p>

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取將步驟a中得到骨髓粉碎粉100g，加入重量比為1:10的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液0.1mol/L，pH＝8.4，在溫度40℃條件下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取2-3次至未見沉淀物為止，得到總提取液；

c、將步驟b得到的總提取按料液比為1:6的石油醚或正己烷脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c得到的下層提取液在12000轉(zhuǎn)/分，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提液，濃縮至2-5倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析24-48小時；

f、將步驟e中透析后的多肽提取液，用硫酸銨飽和溶液沉淀，先用濃度為30％飽和硫酸銨沉淀，再依次用濃度為60％-90％飽和硫酸銨沉淀，溫度4℃，過夜，離心，透析48h，噴霧干燥或冷凍干燥，即得到1.14g骨髓蛋白質(zhì)；

無機(jī)鹽溶劑提取：

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取步驟a中3等份100g的已粉碎好骨髓樣品，每份樣品中按料液比為1:5，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％、2.5％和5％的氯化鈉溶液提取，在溫度40℃下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取2-3次至未平底下未見沉淀物為止，回流時間為3-4h，將提取液過濾，未過濾部分再加氯化鈉溶液提取，過濾，合并濾液；

c、將步驟b得到的合并濾液用料液比為1:4石油醚或正己烷脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c中下層液體12000轉(zhuǎn)/分下，溫度4℃，離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提取液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提取液，濃縮至5/10-2/10倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析48-72小時，冷凍干燥，得到骨髓蛋白質(zhì)，分別為0.5％氯化鈉1.1g、2.5％氯化鈉0.925g和5％氯化鈉0.52g。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提取工藝流程圖；

圖2為本發(fā)明BCA法測定骨髓蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中方程式為：y＝197.34x2+432.11x-110.2，相關(guān)系數(shù)為0.9991；

圖3為本發(fā)明骨髓蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果對比圖，其中系列1為不同飽和度硫酸沉淀的多肽，從左到右依次為30％硫酸銨沉淀部位、60％硫酸銨沉淀部位、90％硫酸沉淀部位；其中系列2為不同濃度氯化鈉提取的骨髓蛋白質(zhì)，從左到右依次為0.5％氯化鈉部分，2.5％氯化鈉部分，5％氯化鈉部分；

圖4為本發(fā)明骨髓蛋白質(zhì)得率與純度結(jié)果對比圖，其中系列1為不同飽和度硫酸沉淀的多肽，從左到右依次為30％硫酸銨沉淀部位、60％硫酸銨沉淀部位、90％硫酸沉淀部位；其中系列2為不同濃度氯化鈉提取的骨髓蛋白質(zhì)，從左到右依次為0.5％氯化鈉部分，2.5％氯化鈉部分，5％氯化鈉部分；

圖5為本發(fā)明十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；-考馬斯亮藍(lán)染色圖，其中1為30％硫酸銨沉淀部位，2為60％硫酸銨沉淀部位；3為90％硫酸沉淀部位；4為0.5％氯化鈉部分，5為2.5％氯化鈉部分；6為5％氯化鈉部分；

圖6為本發(fā)明提取的六種蛋白質(zhì)抑菌活性和平板抑菌圈尺對比圖，其中1為30％硫酸銨沉淀部位，2為60％硫酸銨沉淀部位；3為90％硫酸沉淀部位；4為0.5％氯化鈉部分，5為2.5％氯化鈉部分；6為5％氯化鈉部分。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1

緩沖液提?。?/p>

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎3次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取將步驟a中得到骨髓粉碎粉100g，加入重量比為1:10的三羥甲基氨基甲烷鹽酸0.1mol/L，pH＝8.4緩沖溶液，在溫度40℃條件下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取2次至未見沉淀物為止，得到總提取液；

c、將步驟b得到的總提取按料液比為1:6的石油醚脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c得到的下層提取液在12000轉(zhuǎn)/分，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提液，濃縮至2倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析24小時；

f、將步驟e中透析后的多肽提取液，用硫酸銨飽和溶液沉淀，先用濃度為30％飽和硫酸銨沉淀，再依次用濃度為60％和90％飽和硫酸銨沉淀，溫度4℃，過夜，離心，透析48h，噴霧干燥或冷凍干燥，即得到1.14g骨髓蛋白質(zhì)，總提取率為57％。

實(shí)施例2

無機(jī)鹽溶劑提?。?/p>

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎3次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取步驟a中3等份100g的已粉碎好骨髓樣品，每份樣品中按料液比為1:5，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％、2.5％和5％的氯化鈉溶液提取，在溫度40℃下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取2次至未平底下未見沉淀物為止，回流時間為3h，將提取液過濾，未過濾部分再加氯化鈉溶液提取，過濾，合并濾液；

c、將步驟b得到的合并濾液用料液比為1:4石油醚脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c中下層液體12000轉(zhuǎn)/分下，溫度4℃，離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提液，濃縮至5/10倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析48小時，冷凍干燥，得到骨髓蛋白質(zhì)，分別為0.5％氯化鈉1.1g、2.5％氯化鈉0.925g和5％氯化鈉0.52g，總提取率為分別為57％，46.25％，26％

實(shí)施例3

緩沖液提?。?/p>

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取將步驟a中得到骨髓粉碎粉100g加入重量比為1:10三羥甲基氨基甲烷鹽酸，0.1mol/L，pH＝8.4緩沖溶液，在溫度40℃條件下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取3次至未見沉淀物為止，得到總提取液；

c、將步驟b得到的總提取按料液比為1:6的正己烷脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c得到的下層提取液在12000轉(zhuǎn)/分，溫度4℃離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提液，濃縮至5倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析48小時；

f、將步驟e中透析后的多肽提取液，用硫酸銨飽和溶液沉淀，先用濃度為30％飽和硫酸銨沉淀，再依次用濃度為60％和90％飽和硫酸銨沉淀，溫度4℃，過夜，離心，透析48h，噴霧干燥或冷凍干燥，即得到1.14g骨髓蛋白質(zhì)。

實(shí)施例4

無機(jī)鹽溶劑提?。?/p>

a、取新鮮骨髓，清洗3次，去掉骨頭和血跡，切成小塊，按重量比為1∶5加入液氮粉碎，反復(fù)粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

b、取步驟a中3等份100g的已粉碎好骨髓樣品，每份樣品中按料液比為1:5，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％、2.5％和5％的氯化鈉溶液提取，在溫度40℃下置集約式恒溫加熱磁力攪拌機(jī)上回流反復(fù)提取2次至未平底下未見沉淀物為止，回流時間為4h，將提取液過濾，未過濾部分再加氯化鈉溶液提取，過濾，合并濾液；

c、將步驟b得到的合并濾液用料液比為1:4石油醚或正己烷脫脂，反復(fù)2-3次，收集下層提取液；

d、將步驟c中下層液體12000轉(zhuǎn)/分下，溫度4℃，離心10min，取上清液，得到骨髓蛋白質(zhì)粗提液；

e、將步驟d中得到的蛋白質(zhì)粗提液，濃縮至2/10倍，并利用1000Da透析帶在蒸餾水循環(huán)透析72小時，冷凍干燥，得到骨髓多肽，分別為0.5％氯化鈉1.1g、2.5％氯化鈉0.925g和5％氯化鈉0.52g。

實(shí)施例5：

骨髓蛋白質(zhì)濃度的測定：

利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定實(shí)施1-4所得骨髓蛋白質(zhì)濃度：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)BCA蛋白測量試劑盒說明書操作配制工作液，每50倍體積的BCA試劑A溶液加1倍體積的BCA試劑B溶液，充分混勻備用，根據(jù)表1吸取試劑盒中蛋白標(biāo)準(zhǔn)品牛血清蛋白，用水稀釋，搖勻，各管分別取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，輕微振蕩，混勻，于溫度37℃恒溫箱中溫育30min，取出96孔板，用酶標(biāo)儀測定吸光度，測定波長為562nm，每個做三組平行，以吸光度為縱坐標(biāo)，多肽濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算；

表1系列稀釋牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品

樣品的測定：

精確稱取2.5mg樣品，加入1mL蒸餾水溶解，10000轉(zhuǎn)/分離心2min，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，取25μL樣品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，輕微振蕩，混勻，于溫度37℃恒溫箱中溫育30min，取出96孔板，用酶標(biāo)儀測定吸光度，測定波長為562nm，每個樣品做三組平行；按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖2及表2可知，利用液氮研磨處理后Tris-鹽酸提取，其中50％硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)濃度可達(dá)1856μg/mL，占提取物的52.36％；2.5％氯化鈉提取蛋白質(zhì)濃度1944μg/mL，占提取物的57.40％。

表2有效成分及蛋白質(zhì)提取率

實(shí)施例6

蛋白質(zhì)種類的確定：

試劑配制及樣品處理：

樣品緩沖液：0.5mL的0.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(pH＝6.8)、2mL的10％十二烷基硫酸鈉、1mL甘油、0.5mL的β-巰基乙醇、1mL的水、微量的溴酚藍(lán)；

樣品的處理：精密稱取樣品3mg溶于1mL蒸餾水中，搖勻，與樣品緩沖液等體積混合，隔水煮沸10min，10000轉(zhuǎn)/分，離心5min；

電極緩沖液：將15.1g三羥甲基氨基甲烷94g甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸鈉溶解并定容至4L；

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液：30％(W/V)超純級丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N-亞甲雙丙烯酰胺；

10％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制：2.3mL的H₂O、5mL的30％(V/V)SDS-PAGE儲存液、2.5mL的1.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸鈉、0.1mL的10％(W/V)過硫酸銨、0.004mL的四甲基乙二胺；5％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠配制：3.4mL的H₂O、0.83mL的30％(V/V)

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儲存液、0.63mL的1.5moL/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液(pH＝8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基硫酸鈉、0.05mL的10％(W/V)過硫酸銨、0.005mL的四甲基乙二胺；

電泳條件：恒壓75伏，30min，然后恒壓150伏，90min；

考馬斯亮藍(lán)固定液：25％異丙醇、10％的冰醋酸、65％水；

考馬斯亮藍(lán)染色液：將0.6g的考馬斯亮藍(lán)R-250溶解在300mL的固定液中，過濾，棕色瓶儲存；

考馬斯亮藍(lán)脫色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

電泳結(jié)束后將凝膠片置于固定液中固定2h，然后放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，置于搖床上染色2h，再用脫色液浸泡至背景色褪色完全為止。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖3中可以看出，三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液提取并用不同飽和度硫酸銨沉淀中，30％硫酸按飽和部位出現(xiàn)了6.5KD以下的多肽條帶，又出現(xiàn)4.1KD以下多肽條帶，一般用有機(jī)或者其他緩沖溶液提取原生多肽是罕見的，這可能由于三羥甲基氨基甲烷緩沖液被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，很高的緩沖能力，在水中溶解度高,對很多酶反應(yīng)是惰性的,使三羥甲基氨基甲烷成為用于許多生化目的非常滿意的緩沖液.一般用于穩(wěn)定反應(yīng)體系的pH，在pH7.5-9.0之間有較強(qiáng)的緩沖能力，這個實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明采用是0.1mol/L，pH＝8，三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液，硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì).用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度,使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)，故本發(fā)明采用3種不同的飽和度溶液分別處理多肽。60％硫酸銨沉淀部位的多肽分子量在9.5KD左右，因本身蛋白含量高，故條帶較粗一些。90％硫酸銨沉淀部位沉淀部位條帶也66KD和9.5KD處出現(xiàn)。

由圖3中可以看出，氯化鈉是骨髓蛋白、多肽提取有效的溶劑之一，其中0.5％氯化鈉提取部分在4.1KD-6.5KD處，9.5KD-14.4KD處有多肽和蛋白條帶，還有66KD處也出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，說明0.5％氯化鈉是提取骨髓小分子量多肽的有效方法之一；2.5％氯化鈉部位蛋白含量高，未出現(xiàn)多肽條帶；5％氯化鈉部位在9.5KD-14.4KD處，66KD上下部位出現(xiàn)明顯的條帶，說明濃度高低會影響蛋白質(zhì)提取率和條帶出現(xiàn)位置。

實(shí)施例7

融化瓊脂培養(yǎng)基，待其溫度降至46±0.5℃，加入已培養(yǎng)好的菌液，使試驗(yàn)菌懸液濃度為5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；

用瓊脂打孔器打孔，直徑為5-6mm，4-5孔/皿，均勻分布，各樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上；

樣品濃度為100mg/ml(100mM)；每孔加樣品溶液20μl，蓋好平皿，置于溫度37℃培養(yǎng)箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培養(yǎng)16h-18h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑并記錄；

評價(jià)：

(1)抑菌作用的判斷：

抑菌環(huán)直徑大于7mm者，判為有抑菌作用；

抑菌環(huán)直徑小于或等于7mm者，判為無抑菌作用；

試驗(yàn)結(jié)果：

由表3和圖4、圖5中可以看出兩種提取方法所得的六種蛋白質(zhì)對白色念球菌具有不同程度的抑菌活性，可大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑制活性，故沒列表和放相關(guān)圖片。其中2.5％氯化鈉部位抑菌活性最強(qiáng)，可達(dá)10；這與蛋白質(zhì)含量高低也有一定的劑量關(guān)系。

表3兩種法提取蛋白質(zhì)抗菌效果對比圖

當(dāng)抑制區(qū)直徑≤7mm時，認(rèn)為樣品沒有效果抗菌(水腫)：白色念珠菌ATCC10231；大腸桿菌ATCC11229；金黃色葡萄球菌ATCC6538。