專利名稱：一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
與簡單的無機(jī)分子或是由微生物產(chǎn)生的抗生素類不同，抗菌肽是由基因編碼的，因而高等生物可以根據(jù)其表面的微生物對這些肽類抗生素的敏感性的變化來靈活調(diào)節(jié)其自身的分子結(jié)構(gòu)，有廣譜、高效的殺菌活性。目前抗菌肽的潛在應(yīng)用價(jià)值受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。迄今發(fā)現(xiàn)的抗菌肽中，主要是小分子抗微生物肽(一般小于100個(gè)氨基酸)，這些內(nèi)源性的短肽分子能夠破壞微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或功能。在過去的20年里，在植物以及軟體動(dòng)物和人等一系列多細(xì)胞動(dòng)物的細(xì)胞和體液中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)這類抗微生物肽。大體上，可以粗略地將這些短肽分類為Cecropin樣抗菌肽、富含脯氨酸殘基的抗菌肽、含甘氨酸殘基的抗菌肽和富含半胱氨酸殘基的抗菌肽，其中富含半胱氨酸殘基的堿性抗菌肽被命名為防御素(defensin)。防御素具有廣譜及強(qiáng)力的抗微生物(細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等)特性，是人粘膜、皮膚以及上皮細(xì)胞的重要免疫作用分子。人防御素包括α、β和Θ三個(gè)家族，分子大小為29-45個(gè)氨基酸，含有六個(gè)半胱氨酸殘基，從而形成三對二硫鍵。其中，防御素家族在人基因組上約有40個(gè)成員，人β-防御素I (hBD-Ι)于1995年被發(fā)現(xiàn)，隨后在2000年左右hBD-2、hBD-3和hBD-4也相繼被發(fā)現(xiàn)。防御素具有廣譜的抗微生物活性。在體外，防御素在毫摩爾濃度下對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰 性菌均具有殺滅作用。其中，微克級水平的hBD-3對金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌等革蘭氏陽性致病菌，綠膿桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，以及酵母，都具有強(qiáng)烈的殺傷作用，并且對多重抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬古霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發(fā)揮殺傷作用。hBD-4可以抑制革蘭氏陽性菌(如葡萄球菌)和革蘭陰性菌(如大腸埃希菌)的生長，同時(shí)抗綠膿桿菌的活性也很強(qiáng)。此外，β -防御素對病毒、真菌(如酵母等)等微生物也有抑制作用。β -防御素的直接殺菌作用是由于β -防御素分子呈陽性、帶正電荷，能夠與帶負(fù)電荷、呈陰性的細(xì)菌表面結(jié)合，結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細(xì)菌的胞膜，而其帶電區(qū)(帶正點(diǎn)荷)則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用。在細(xì)胞膜上多個(gè)β -防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi)，而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等則泄漏到胞外，最終導(dǎo)致不可逆性的菌體死亡。β -防御素在細(xì)胞膜上的通道形成過程與膜的磷脂組成成分和所處的溫度環(huán)境等因素有關(guān)。然而，一旦β -防御素在膜上形成了通道，上述因素便不會對其通道的活動(dòng)構(gòu)成本質(zhì)的影響。防御素的表達(dá)水平和活力受作用環(huán)境的鹽濃度和離子種類的影響。過高的鹽濃度(如IOOmM以上PBS緩沖液)會導(dǎo)致防御素活性水平急劇下降。一價(jià)離子對防御素活性影響較小，二價(jià)離子(如鈣、鎂離子)則可顯著降低防御素的活性。分析認(rèn)為較高的鹽濃度(>50mM)可能會影響防御素的帶電量，進(jìn)而降低其抗菌效果，而人體生理環(huán)境鹽濃度約為150mM，一定程度限制了防御素的臨床應(yīng)用。因此，提升防御素的活性和耐鹽能力可推動(dòng)防御素的實(shí)際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽，如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)(包括將所述多肽進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白質(zhì)，也包括將所述多肽與其他標(biāo)簽蛋白或功能蛋白進(jìn)行融合得到的融合蛋白)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在制備抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產(chǎn)品，其活性成分為所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，除了所述有效成分外，可以添加藥學(xué)上允許的稀釋劑、賦形齊 、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、增效劑、添加劑等。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，可為片劑、散劑、顆粒劑、液劑、乳劑或懸濁劑等，亦可為粉劑、
水劑、油劑、軟膏、硬膏、噴霧劑等。
本發(fā)明還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在抑制微生物生長和/或殺滅微生物中的應(yīng)用。以上任一所述的微生物可為細(xì)菌，具體可為革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌，更具體可為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌或表皮葡萄球菌。本發(fā)明通過改變現(xiàn)有防御素的氨基酸組成和部分序列，設(shè)計(jì)新的抗菌肽，通過影響多肽或其部分區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)、帶電荷量、疏水性等特性，從而保持或提高其抗微生物活性，并具有更好的耐鹽能力。本發(fā)明對于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。PBS緩沖液的制備方法:將8mmol Na2HPO4和2moI NaH2PO4溶于水并用水定容至IL0LB培養(yǎng)基的制備方法:取胰化蛋白胨(0X0ID，批號804054) 10g、酵母提取物(0X0ID,批號1173143)5g、NaCl (西隴化工股份有限公司，批號1207032) 10g，用蒸餾水定容至 1L，pH7.4。
MH培養(yǎng)基(水解酪蛋白培養(yǎng)基):青島海博生物技術(shù)有限公司，批號20121105。實(shí)施例1、抗菌肽的設(shè)計(jì)已報(bào)道的β -防御素3 (hBD-3)和β -防御素4 (hBD-4)的序列如下:β防御素3、4的氨基酸序列為:hBD-3:GI INTLQKYYCRVRGGRCAVLSC !LPKHHQI(；k| CSTRGRKCCRRKKhBD-4:EFELDRICGYGTARCRKKC jRSQEYR IGR CPNTYACCLRKffDESLLNRTKP根據(jù)已報(bào)道的β -防御素3和β -防御素4，設(shè)計(jì)新的抗菌肽如下:Η4 (序列表的序列 2):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSC bSQR￥Rlfiw| CSTRGRKCCRRKK。H4中，用hBD-4中的方框部分取代了 hBD_3中的方框部分。3N4I (序列表的序列 I):QKYYCRVRGGRCAVLSCRSQEYRIGRCSTRGRKCCRRKK。3N4I中，刪除了 H4中的下劃線部分。MIX-M (序列表 的序列 3):GIIAVLAKWCRVRKKRCAVLSCPRRAKRIGKCSTRGRKCCRRKK。MIX-M中，對H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變，見粗體字母。HBD3-M (序列表的序列 4):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEESISKCSTRGRKCCRRKK。HBD3-M中，對H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變，見粗體字母。實(shí)施例2、抗菌肽的合成委托上海波泰生物技術(shù)有限公司，采用9-芴甲氧羰基法(Fmoc固相合成法)分別合成 hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M 和 HBD3-M。合成工藝簡述如下:1、NovaSyn TGA樹脂(0.25mmol/g)作為固相載體；將10份的首個(gè)氨基酸以N，N- 二異丙基碳二亞胺(DIC) /4- 二甲氨基吡啶(DMAP)法加入到樹脂中(10份的Fmoc-氨基酸，5份的DIC，0.1份的DMAP);后續(xù)的氨基酸，以四倍于固相載體的量，同時(shí)加入 I 份的 Fmoc-氨基酸，I 份的 2- (lH-benzotriazole-1-yl) I, I, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate,I 份的 N-hydroxybenzotriazole,以及 2 份的N, N-diisopropylethylamine。2、Fmoc基團(tuán)用30%的哌唳/NMP洗脫，合成后的多肽用含5%thioanisole,3%ethandithiol及2%anisole的三氟乙酸(TFA)去保護(hù)并從樹脂上分離；洗脫下的多肽用冰冷的乙醚沉淀，過濾后溶于水中，凍干，并用DTT還原。3、合成的多肽用反向高效液相層析(RP-HPLC)進(jìn)行純化,樣品注入PhenomenexC18層析柱(25cm，內(nèi)徑5mm)，用含0.1%TFA的蒸餾水(A液)和0.1%TFA的乙腈(B液)洗脫，收集下的組分凍干干燥并進(jìn)行RP-HPLC分析。實(shí)施例3、抗菌肽的對微生物的抑制活性實(shí)驗(yàn)菌株如下:大腸桿菌(Escherichiacoli):ATCC 編號為 25922 ；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia):ATCC 編號為 700603 ；銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosa):ATCC 編號為 1δ442 ；福氏志賀菌(ShigellafIexneri):CICC 編號為 21534 ;宋氏志賀菌(Shigellasonnei):CICC 編號為 21535 ;
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium):CICC 編號為 21484 ；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus):ATCC 編號為 29213 ;幾腸球菌(Enterococcusfaecalis):ATCC 編號為 29212 ;屎腸球菌(Enterococcusfaecium):ATCC 編號為 6057 ；表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis):ATCC 編號為 12228。CICC即中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，網(wǎng)址為:http://www.china-cicc.0rg/οATCC即美國模式培養(yǎng)物集存庫，網(wǎng)址為:http://www.atcc.0rg/0實(shí)驗(yàn)方法:(I)用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)待測菌株至OD6tltol約為0.6，然后用PBS緩沖液稀釋，得到濃度為106CFU/ml的菌液；(2)在步驟(I)得到的菌液中加入待測多肽(即實(shí)施例2制備得到的hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M或HBD3-M ；H4即序列表的序列2所示的多肽，3N4I即序列表的序列I所示的多肽，MIX-M即序列表的序列3所示的多肽，HBD3-M即序列表的序列4所示的多肽)，37°C孵育3h ；(3)將步驟(2)得到的混合液用PBS緩沖液稀釋至1000倍體積后取100 μ I均勻涂布在固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，觀察細(xì)菌生長與存活狀況，對活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用Logit回歸模型計(jì)算LD90數(shù)值(即90%細(xì)菌死亡時(shí)對應(yīng)的多肽濃度)。采用LB培養(yǎng)基(包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基)的實(shí)驗(yàn)菌株為:大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌和鼠傷寒沙門氏菌。采用MH培養(yǎng)基(包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基)的實(shí)驗(yàn)菌株為:金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌。各個(gè)多肽對各個(gè)細(xì)菌的LD90數(shù)值見表I。表I各個(gè)多肽對各個(gè)細(xì)菌的LD90數(shù)值(μ g/ml)
權(quán)利要求
1.多肽，如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。
2.具有權(quán)利要求1所述多肽的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求1所述多肽的衍生物或含有權(quán)利要求1所述多肽的組合物。
3.權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物，在制備抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。
6.一種抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。
9.權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物，在抑制微生物生長和/或殺滅微生物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的 應(yīng)用，其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發(fā)明對于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。
文檔編號C07K14/47GK103193877SQ201310135178
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者王慧, 李濤, 劉雄, 郭峰, 郭通 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所