本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是涉及千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法。
背景技術(shù)：
：造血干細(xì)胞是存在于造血組織中的一群原始造血細(xì)胞，是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能。它是研究歷史最長且最為深入的一類成體干細(xì)胞，對(duì)研究各類干細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，具有重要指導(dǎo)意義。造血干細(xì)胞是治療白血病、淋巴瘤等惡性腫瘤、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等嚴(yán)重危害人類健康疾病的有效方法，可以有效的減輕患者的痛苦。自1989年Gluckman等首次對(duì)1例5歲Fanconi貧血男孩進(jìn)行了HLA匹配臍血移植治療獲得成功以來，臍血移植在造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域中越來越突顯其優(yōu)勢(shì)。然而，單份臍血造血干細(xì)胞含量有限，不能滿足50kg以上成人的使用，因此，臍血造血干細(xì)胞的擴(kuò)增研究是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的途徑主要采用加入血清和多種細(xì)胞因子的液體培養(yǎng)基、或與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)等方法，但是上述方法仍不能獲得充足的、具有移植活性的造血干細(xì)胞用于臨床治療，而且容易造成造血干細(xì)胞的干性丟失、造成移植的失敗。中國專利CN105112374A公開了一種臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述體外擴(kuò)增培養(yǎng)基以IMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加血清、血小板生成素、干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、白介素-1、白介素-6、干細(xì)胞生長因子和小檗堿。用于臍血造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)，具有造血干細(xì)胞增殖率高的優(yōu)點(diǎn)，而且能顯著提高造血干細(xì)胞移植到受體內(nèi)的植入能力和造血系統(tǒng)的重建能力，能較好的保持造血干細(xì)胞的特性。但是，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，上述培養(yǎng)基對(duì)于造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖仍有所欠缺，有待于進(jìn)一步提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供千金藤堿在培養(yǎng)擴(kuò)增造血干細(xì)胞中的應(yīng)用，使其能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞，特別是臍血造血干細(xì)胞的增殖能力，顯著提高在數(shù)量和含量方面的增殖效果。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供包含千金藤堿的培養(yǎng)基，使得所述培養(yǎng)基能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞，特別是臍血造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種運(yùn)用包含千金藤堿的培養(yǎng)基體外擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞的方法，使得所述方法最終結(jié)果顯著提高了臍血造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖效果。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：千金藤堿在制備造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基和/或在體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述造血干細(xì)胞為臍血造血干細(xì)胞。千金藤堿，又名千金藤素，是一種從傳統(tǒng)中草藥防己科千金藤屬植物中提取分離出來的雙芐基異喹啉類生物堿，其具有多種生物功能，如抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫功能等，被廣泛地用于治療各種急慢性疾病，而且毒副作用低。在臨床上千金藤堿可使外周血白細(xì)胞增多，用于因腫瘤化療、放療引起的粒細(xì)胞缺乏癥和其他原因引起的白細(xì)胞減少癥。目前未見報(bào)道千金藤堿對(duì)臍血造血干細(xì)胞的體外增值作用。本發(fā)明將千金藤堿作為新的組分，添加到臍血造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，相對(duì)于普通擴(kuò)增培養(yǎng)基，其能夠顯著提高臍血造血干細(xì)胞在數(shù)量和含量上的增殖效果，使造血干細(xì)胞具有干性強(qiáng)、活性高的特點(diǎn)?；诖耍景l(fā)明提供了一種包含千金藤堿的臍血造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基根據(jù)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，千金藤堿在50-100μmol/mL范圍內(nèi)，不僅表現(xiàn)出對(duì)臍血造血干細(xì)胞低毒的優(yōu)點(diǎn)，而且還最大程度表現(xiàn)出其優(yōu)異的增殖促進(jìn)效果。同時(shí)，本發(fā)明針對(duì)千金藤堿的優(yōu)勢(shì)，還選擇其它適宜的組分共同作組成臍血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)基，這些適宜的組分包括：DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、血小板生成素、干細(xì)胞生長因子、人FMS樣酪氨酸激酶1配體、白介素-1、白介素-6。在具體的實(shí)施方式中，上述各組分以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加如下濃度的各成分：5％-10％的FBS、15-30ng/ml血小板生成素、100-200ng/ml干細(xì)胞生長因子、33-56ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.2-0.5ng/ml白介素-1、0.2-0.5ng/ml白介素-6、50-100μmol/ml千金藤堿。作為優(yōu)選地的方案，各成分濃度為8％的FBS、20ng/ml血小板生成素、150ng/ml干細(xì)胞生長因子、45ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.4ng/ml白介素-1、0.4ng/ml白介素-6、75μmol/ml千金藤堿。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，各成分濃度還可選擇如下：(1)5％的FBS、15ng/ml血小板生成素、100ng/ml干細(xì)胞生長因子、33ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.2ng/ml白介素-1、0.2ng/ml白介素-6、50μmol/ml千金藤堿。(2)10％的FBS、30ng/ml血小板生成素、200ng/ml干細(xì)胞生長因子、56ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.5ng/ml白介素-1、0.5ng/ml白介素-6、100μmol/ml千金藤堿。此外，本發(fā)明還提供了一種體外擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞的方法，將臍血造血干細(xì)胞接種到本發(fā)明上述任意一種技術(shù)方案提到的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中，所述臍血造血干細(xì)胞可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行提取獲得，在本發(fā)明具體實(shí)施過程中是通過免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)獲得的。具體方法可參照如下：步驟1、將臍血按1:1的體積比與PBS混勻，再按照4:1的體積比加入6％羥乙基淀粉溶液混勻，室溫靜置20-30分鐘，待紅細(xì)胞自然沉降至界限分明時(shí)，吸出上層溶液至50ml離心管中；步驟2、1500rpm離心5min，離心結(jié)束后取出離心管，收集下層單個(gè)核細(xì)胞，用3-5ml的PBS洗滌，重懸細(xì)胞備用；步驟3、將細(xì)胞用countstar計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為2×108/ml的細(xì)胞懸液，按照每毫升細(xì)胞懸液加入100μlCD34抗體的比例加入混合物，室溫孵育15-20分鐘；步驟4、按照每毫升細(xì)胞懸液中加入50μl磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混勻，室溫孵育10-20分鐘。嚴(yán)格按照免疫磁珠細(xì)胞分選試劑盒的步驟分選出CD34+造血干細(xì)胞細(xì)胞，備用。作為優(yōu)選，所述臍血造血干細(xì)胞接種的密度為1×105/mL，所述培養(yǎng)為在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，一般為3-7d。本發(fā)明選取包括CN105112374A實(shí)施例3擴(kuò)增培養(yǎng)基在內(nèi)的多組對(duì)照培養(yǎng)基為對(duì)比對(duì)象，在相同的臍血干細(xì)胞來源和培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3天和第7天收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和CD34細(xì)胞含量測(cè)定。結(jié)果顯示，經(jīng)過本發(fā)明所述體外擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)的造血干細(xì)胞，在第7天時(shí)擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到60倍左右，細(xì)胞含量達(dá)到98％左右，具有明顯的擴(kuò)增效果。由以上技術(shù)效果可知，本發(fā)明提供了千金藤堿在造血干細(xì)胞擴(kuò)增中的相關(guān)應(yīng)用，通過多種適宜組分與千金藤堿組成的培養(yǎng)基的作用，可顯著提高造血干細(xì)胞的擴(kuò)增效果，使其具有干性強(qiáng)、活性高的特點(diǎn)。附圖說明圖1所示為不同濃度的千金藤堿對(duì)臍血造血干細(xì)胞的活性影響曲線；其中，1為培養(yǎng)48h時(shí)的結(jié)果；2為培養(yǎng)72h時(shí)的結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開了千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用、培養(yǎng)基和方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述應(yīng)用、培養(yǎng)基和方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1：臍血造血干細(xì)胞的提取分離事先征得華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦同意，以自愿捐贈(zèng)方式，通過華僑醫(yī)院正規(guī)采集方法采集臍血。將臍血按1:1的體積比與PBS混勻，再按照4:1的體積比加入6％羥乙基淀粉溶液混勻，室溫靜置20-30分鐘，待紅細(xì)胞自然沉降至界限分明時(shí)，吸出上層溶液至50ml離心管中；1500rpm離心5min，離心結(jié)束后取出離心管，收集下層單個(gè)核細(xì)胞，用3-5ml的PBS洗滌，重懸細(xì)胞備用；將細(xì)胞用countstar計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為2×108/ml的細(xì)胞懸液，按照每毫升細(xì)胞懸液加入100μlCD34抗體的比例加入混合物，室溫孵育15-20分鐘；按照每毫升細(xì)胞懸液中加入50μl磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混勻，室溫孵育10-20分鐘。嚴(yán)格按照免疫磁珠細(xì)胞分選試劑盒的步驟分選出CD34+造血干細(xì)胞細(xì)胞，備用。實(shí)施例2：千金藤堿對(duì)臍血造血干細(xì)胞的安全性試驗(yàn)用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基將千金藤堿稀釋成0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/ml的藥物濃度。將實(shí)施例1中分離的細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板中，分別加入不同濃度千金藤堿，每孔100ul，以不加千金藤堿的臍血造血干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為正常細(xì)胞組，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48h和72h。按照MTT試劑盒說明書利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，無論是培養(yǎng)48h還是72h，當(dāng)千金藤堿的濃度50-100μmol/ml時(shí)，造血干細(xì)胞的存活率最高，因此以50-100μmol/ml作為本發(fā)明中千金藤堿的安全濃度。實(shí)施例3：不同擴(kuò)增培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果對(duì)比試驗(yàn)1、培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基1：DMEM/F12+10％FBS；對(duì)照培養(yǎng)基2：CN105112374A實(shí)施例3擴(kuò)增培養(yǎng)基；陽性對(duì)照培養(yǎng)基：DMEM/F12+10％FBS+15ng/ml血小板生成素+100ng/ml干細(xì)胞生長因子+33ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.2ng/ml白介素-1+0.2ng/ml白介素-6+1uMSR-1(注：SR-1是已經(jīng)通過篩選技術(shù)得到的一種嘌呤霉素衍生物，是目前為止已經(jīng)證實(shí)的能促進(jìn)人CD34+造血干細(xì)胞大量擴(kuò)增和自我更新的小分子，一般可使細(xì)胞數(shù)量增加50倍，因此可選作為陽性對(duì)照藥，但其成本相對(duì)較高，并且不易采購)；本發(fā)明培養(yǎng)基1：DMEM/F12培養(yǎng)基+8％FBS+20ng/ml血小板生成素+150ng/ml干細(xì)胞生長因子+45ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.4ng/ml白介素-1+0.4ng/ml白介素-6+75μmol/ml千金藤堿。本發(fā)明培養(yǎng)基2：DMEM/F12培養(yǎng)基+5％FBS+15ng/ml血小板生成素+100ng/ml干細(xì)胞生長因子+33ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.2ng/ml白介素-1+0.2ng/ml白介素-6+50μmol/ml千金藤堿。本發(fā)明培養(yǎng)基3：DMEM/F12培養(yǎng)基+10％FBS+30ng/ml血小板生成素、200ng/ml干細(xì)胞生長因子+56ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.5ng/ml白介素-1+0.5ng/ml白介素-6+100μmol/ml千金藤堿。2、試驗(yàn)方法將實(shí)施例1中分離的造血干細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于6孔板中，2ml/孔，分別加入各組擴(kuò)增培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)3天、7天后收獲細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和CD34細(xì)胞含量測(cè)定。利用countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見表1，利用流式細(xì)胞儀分析CD34+細(xì)胞的含量，結(jié)果見表2。表1造血干細(xì)胞數(shù)量增殖情況培養(yǎng)天數(shù)對(duì)照培養(yǎng)基1對(duì)照培養(yǎng)基2陽性對(duì)照組培養(yǎng)基0d2*1052*1052*1053d2.3*1054.5*1067.2*1067d2.1*1056.3*1061.1*107培養(yǎng)天數(shù)本發(fā)明培養(yǎng)基1本發(fā)明培養(yǎng)基2本發(fā)明培養(yǎng)基30d2*1052*1052*1053d7.12*1066.42*1077.05*1077d1.23*1071.19*1071.21*107由表1可知，對(duì)照培養(yǎng)基1的造血干細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化；而陽性對(duì)照組培養(yǎng)基和本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)造血干細(xì)胞都具有明顯的擴(kuò)增效果。在第7d時(shí)，陽性對(duì)照組培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到55倍，本發(fā)明培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到60倍；而現(xiàn)有專利的對(duì)照培養(yǎng)基2明顯低于本發(fā)明培養(yǎng)基和陽性對(duì)照培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)，說明千金藤堿和陽性藥SR-1的對(duì)造血干細(xì)胞增殖效果無明顯差異，擴(kuò)增倍數(shù)甚至高于陽性藥，可以在體外快速擴(kuò)增臍血造血干細(xì)胞。表2造血干細(xì)胞含量增殖情況培養(yǎng)天數(shù)對(duì)照培養(yǎng)基1對(duì)照培養(yǎng)基2陽性對(duì)照組培養(yǎng)基0d62.3％62.3％62.3％3d63.4％71.2％83.2％7d62.1％80.1％98.1％培養(yǎng)天數(shù)本發(fā)明培養(yǎng)基1本發(fā)明培養(yǎng)基2本發(fā)明培養(yǎng)基30d62.3％62.3％62.3％3d85.1％84.2％85.0％7d97.8％98.2％97.6％由表2可知，對(duì)照組培養(yǎng)基1的造血干細(xì)胞含量沒有明顯變化；而陽性對(duì)照組培養(yǎng)基和本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)造血干細(xì)胞的含量都具有明顯提高。在第7d時(shí)，陽性對(duì)照組培養(yǎng)基的CD34+細(xì)胞含量達(dá)到98.1％，本發(fā)明培養(yǎng)基的細(xì)胞含量達(dá)到98％左右，現(xiàn)有專利的對(duì)照培養(yǎng)基2明顯低于本發(fā)明培養(yǎng)基和陽性對(duì)照培養(yǎng)基的細(xì)胞含量，說明千金藤堿和陽性藥SR-1對(duì)造血干細(xì)胞的含量影響無明顯差異，可以在體外很好的保持造血干細(xì)胞的干性。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3