本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種改良的PPCs細(xì)胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：可編程的多能細(xì)胞(ProgrammablePluripotentCells，PPCs)是一種通過現(xiàn)代細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，開發(fā)成功的一種來源于外周血單核細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)，具有多能細(xì)胞特性的細(xì)胞。這種細(xì)胞的前身是外周血的單核細(xì)胞，經(jīng)過特殊的去分化和擴(kuò)增技術(shù)，使其生長為具有多能細(xì)胞的再生功能的新型細(xì)胞，然后回輸體內(nèi)，可以對組織結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行再生和修復(fù)，另外，還可以激活組織器官內(nèi)處于休眠或抑制狀態(tài)的前體細(xì)胞，取代并修復(fù)體內(nèi)因病變而受損和失去功能的組織細(xì)胞，重新恢復(fù)建立重要生命器官的生理功能，以達(dá)到治療各種慢性疾病和抗衰老及保健的目的。目前，PPCs的建立是基于德國Fandrich教授的技術(shù)。該技術(shù)存在許多缺陷，例如：1.一次性抽血量達(dá)500ml左右，對個體的影響比較大；2.培養(yǎng)基的選擇更傾向于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，而非類干細(xì)胞的培養(yǎng)；3.培養(yǎng)基內(nèi)添加了動物成份的血清。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的提供一種區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的人PPCs細(xì)胞的培養(yǎng)方法，低氧環(huán)境和成纖維細(xì)胞上清液使得PPCs細(xì)胞純度高，生長良好，細(xì)胞增殖快，細(xì)胞得率和存活率均大大提高同時能夠盡可能地避免動物成分對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，為多能細(xì)胞的培養(yǎng)提供一種新的思路和方法。為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：一種改良的PPCs細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1：使用0.1％的明膠稀釋液37℃培養(yǎng)箱中過夜包被培養(yǎng)容器；步驟2：分離單個核細(xì)胞，然后洗滌、離心并重懸；步驟3：將所述步驟1處理的培養(yǎng)容器內(nèi)的明膠吸除，并將步驟2獲得的單個核細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中，放置在氧濃度為1％-5％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)胞所使用的培養(yǎng)基中一半體積為成纖維細(xì)胞的細(xì)胞上清液，另一半體積為包含有10％knockout血清替代品、1％雙抗、0.007ul/mlb-巰基乙醇、10ng/mlSCF以及100U/mlIL-3的DMEM/F12培養(yǎng)基。優(yōu)選地，上述成纖維細(xì)胞的細(xì)胞上清液，是將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3天后的上清液用0.22μm濾膜過濾后獲得。優(yōu)選地，上述成纖維細(xì)胞以4×106/瓶接種于T75瓶中，培養(yǎng)基為10％knockout血清替代品的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃下，放置于5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。優(yōu)選地，上述培養(yǎng)容器為細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板。優(yōu)選地，上述步驟2中采集的細(xì)胞使用0.01MPBS洗滌3次，然后進(jìn)行離心，離心條件為200g離心10分鐘，然后進(jìn)行重懸。更優(yōu)選地，步驟2中人外周血中采集分離單個核細(xì)胞的使用美國泰爾茂比斯特醫(yī)療產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn)的血細(xì)胞單采機(jī)(SpectraOptia血液分離系統(tǒng))進(jìn)行單核細(xì)胞的采集(血漿和紅細(xì)胞回輸人體)：優(yōu)選地，上述步驟2中采集的細(xì)胞使用0.01MPBS洗滌3次，然后進(jìn)行離心，離心條件為200g離心10分鐘，然后進(jìn)行重懸。優(yōu)選地，上述培養(yǎng)容器為T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶使用3ml0.1％的明膠稀釋液包被。優(yōu)選地，上述單個核細(xì)胞接種密度為3×106/瓶，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換新的培養(yǎng)基，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，至細(xì)胞融合度達(dá)70％-80％，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的第二個方面還提供根據(jù)上述方法培養(yǎng)得到的PPCs細(xì)胞。本發(fā)明最后一方面還提供上述的PPCs細(xì)胞在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：(1)傳統(tǒng)的培養(yǎng)PPCs細(xì)胞的方法中，PPCs細(xì)胞活性低，生長慢。本發(fā)明中，發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境中培養(yǎng)PPCs細(xì)胞，能在一定程度上增加多能細(xì)胞的活性，影響多能細(xì)胞的細(xì)胞周期，顯著的促進(jìn)多能細(xì)胞的增殖，這為PPCs細(xì)胞的培養(yǎng)提供了一種新的思路和方向，對其臨床上的應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義；(2)成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，其上清液中包含成纖維細(xì)胞分泌的多種生長因子，為多能細(xì)胞提供更好的營養(yǎng)，更能模擬體內(nèi)環(huán)境，并且能夠調(diào)控多能細(xì)胞增殖的AKT信號通路，顯著的促進(jìn)多能細(xì)胞的增殖；(3)避免了傳統(tǒng)方法手采單核細(xì)胞過程中，需要一次性抽血500ml，采集單核細(xì)胞后，剩余的血液成份全部浪費，對機(jī)體造成極大影響，且不能在短時間內(nèi)多次實施，以致無法滿足對某些慢性疾病的治療需求的缺陷；(4)使用DMEM/F12培養(yǎng)基代替RMPI1640培養(yǎng)基，可以更好的促進(jìn)多能細(xì)胞的生長和增殖，因為RMPI1640培養(yǎng)基是淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并不能很好地滿足這種類干細(xì)胞的生長需要；(5)使用knockoutserumreplacement代替胎牛血清，既能滿足營養(yǎng)地需要，又能最大程度地避免血清中不明確的動物成份，對人體細(xì)胞的影響。附圖說明圖1為本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的PPCs細(xì)胞顯微鏡圖片。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1一、在1％氧濃度的條件下，本方法與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較本實施例中實驗組培養(yǎng)PPCs細(xì)胞的方法，具體步驟如下：1.培養(yǎng)瓶的包被將T75培養(yǎng)瓶用0.1％的明膠包被，在細(xì)胞培養(yǎng)的前一天，將3ml0.1％的明膠溶液均勻地鋪滿瓶底，37℃培養(yǎng)箱中過夜。2.細(xì)胞培養(yǎng)基配制細(xì)胞培養(yǎng)基為包含有10％knockoutserumreplacement(Gibco-BRL,Cat.No.10828)、1％雙抗、0.007ul/mlb-巰基乙醇(Sigma,Cat.No.M7522)、10ng/mlSCF以及100U/mlIL-3的DMEM/F12(1:1)(Gibco-BRL,Cat.No.11330)的培養(yǎng)基。3.人單核細(xì)胞的提取由于治療用多能細(xì)胞需要從約500ml外周血中進(jìn)行單核細(xì)胞的提取，因此，本實施例中選用美國泰爾茂比斯特醫(yī)療產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn)的血細(xì)胞單采機(jī)(SpectraOptia血液分離系統(tǒng))進(jìn)行單核細(xì)胞的采集。使用機(jī)器采集代替人工采集的優(yōu)勢是，只取我們需要的單核細(xì)胞，而不需要的其它成份，血漿和紅細(xì)胞等，直接回輸人體，從而將對個體造成的影響降低到最小。將機(jī)器采集的單核細(xì)胞用0.01MPBS進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次的離心條件為200g離心10分鐘。4.二維培養(yǎng)將預(yù)包被的T75培養(yǎng)瓶取出，吸棄多余的明膠溶液。將離心所得的單核細(xì)胞用上述細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。轉(zhuǎn)移到處理后的T75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為3×106/瓶。置于氧濃度為1％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。從接種時間開始計時，每3天更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，至細(xì)胞融合度為70％-80％時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞顯微鏡下的照片如附圖1所示。本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組。其中，實驗組培養(yǎng)細(xì)胞過程中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中氧濃度維持在1％。常規(guī)組按傳統(tǒng)的Fandrich教授的技術(shù)培養(yǎng)，在第12天分別從兩組中獲取培養(yǎng)細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，將計數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)(即第0天)，數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。結(jié)果如表1所示：在培養(yǎng)的第12天，本法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均顯著高于常規(guī)組，P<0.05。培養(yǎng)天數(shù)(天)012常規(guī)組130.57±2.76實驗組168.34±2.58表1本方法中氧濃度為1％與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較由表1的數(shù)據(jù)就可以分析得出，1％氧濃度下的低氧環(huán)境能在一定程度上增加多能細(xì)胞的活性，影響多能細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)而顯著的促進(jìn)多能細(xì)胞的增殖，多能細(xì)胞的細(xì)胞生長速度比常規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度更快。實施例2一、在5％氧濃度的條件下，本方法與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組。其中，實驗組按實施例1的培養(yǎng)方法培養(yǎng)PPCs細(xì)胞，唯一區(qū)別在于，細(xì)胞培養(yǎng)箱中氧濃度維持在5％。常規(guī)組按傳統(tǒng)的Fandrich教授的技術(shù)培養(yǎng)，在第12天從兩組取培養(yǎng)細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，將計數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)(即第0天)，數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。結(jié)果如表1所示：在培養(yǎng)的第12天，本法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均顯著高于常規(guī)組，P<0.05。培養(yǎng)天數(shù)(天)012常規(guī)組128.17±1.96實驗組157.14±2.13表2本方法中氧濃度為5％與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較由表2的數(shù)據(jù)就可以分析得出，5％氧濃度下的低氧環(huán)境能在一定程度上增加多能細(xì)胞的活性，影響多能細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)而顯著的促進(jìn)多能細(xì)胞的增殖，多能細(xì)胞的細(xì)胞生長速度比常規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度更快。實施例3一、成纖維細(xì)胞上清液對PPCs細(xì)胞增殖的影響本實施例中實驗組培養(yǎng)PPCs細(xì)胞的方法，具體步驟如下：1.培養(yǎng)瓶的包被將T75培養(yǎng)瓶用0.1％的明膠包被，在細(xì)胞培養(yǎng)的前一天，將3ml0.1％的明膠溶液均勻地鋪滿瓶底，37℃培養(yǎng)箱中過夜。2.成纖維細(xì)胞上清液的配制成纖維細(xì)胞以4×106/瓶接種于T75瓶中，培養(yǎng)基為10％knockout血清替代品的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃下，放置于5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三天后，收集培養(yǎng)瓶中的上清液，1000g下離心5分鐘，去除漂浮的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用0.22微米的無菌濾膜過濾，分裝保存在冰箱中。3.細(xì)胞培養(yǎng)基配制培養(yǎng)細(xì)胞所使用的培養(yǎng)基中一半體積為成纖維細(xì)胞的細(xì)胞上清液，另一半體積為包含有10％knockoutserumreplacement(Gibco-BRL,Cat.No.10828)、1％雙抗、0.007ul/mlb-巰基乙醇(Sigma,Cat.No.M7522)、10ng/mlSCF以及100U/mlIL-3的DMEM/F12(1:1)(Gibco-BRL,Cat.No.11330)的培養(yǎng)基。4.人單核細(xì)胞的提取由于治療用多能細(xì)胞需要從約500ml外周血中進(jìn)行單核細(xì)胞的提取，因此，本實施例中選用美國泰爾茂比斯特醫(yī)療產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn)的血細(xì)胞單采機(jī)(SpectraOptia血液分離系統(tǒng))進(jìn)行單核細(xì)胞的采集。使用機(jī)器采集代替人工采集的優(yōu)勢是，只取我們需要的單核細(xì)胞，而不需要的其它成份，血漿和紅細(xì)胞等，直接回輸人體，從而將對個體造成的影響降低到最小。將機(jī)器采集的單核細(xì)胞用0.01MPBS進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次的離心條件為200g離心10分鐘。5.二維培養(yǎng)將預(yù)包被的T75培養(yǎng)瓶取出，吸棄多余的明膠溶液。將離心所得的單核細(xì)胞用上述細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。轉(zhuǎn)移到處理后的T75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為3×106/瓶。置于氧濃度為1％-5％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。從接種時間開始計時，每3天更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，至細(xì)胞融合度為70％-80％時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實施例實驗對象分為實驗組和常規(guī)組兩組，其中，常規(guī)組與實驗組相比唯一區(qū)別是培養(yǎng)基中不含有成纖維細(xì)胞上清液，全部為包含有10％knockout血清替代品、1％雙抗、0.007ul/mlb-巰基乙醇、10ng/mlSCF以及100U/mlIL-3的DMEM/F12培養(yǎng)基。在第12天從兩組中取培養(yǎng)細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，將計數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)(即第0天)，數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。結(jié)果如表3所示：在培養(yǎng)的第12天，本法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均顯著高于常規(guī)組，P<0.05。表3本方法與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較由表3的數(shù)據(jù)就可以分析得出，成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，其上清液中包含成纖維細(xì)胞分泌的多種生長因子，為多能細(xì)胞提供更好的營養(yǎng)，更能模擬體內(nèi)環(huán)境，顯著的促進(jìn)多能細(xì)胞的增殖。以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3