本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：自然殺傷細(xì)胞(Naturalkillercells,NK細(xì)胞)，作為與T細(xì)胞、B細(xì)胞并列的一大類(lèi)淋巴細(xì)胞群體，是天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細(xì)胞除了參與先天性免疫應(yīng)答之外，還在適應(yīng)性免疫的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的調(diào)控作用。NK細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞(包括部分細(xì)胞系)、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞(如血細(xì)胞)、寄生蟲(chóng)等，因此，NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。綜上，NK細(xì)胞的離體擴(kuò)增和激活時(shí)促進(jìn)臨床頻繁應(yīng)用的關(guān)鍵，而目前NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法主要包括在培養(yǎng)前分離NK前體或CD56以及使用飼養(yǎng)細(xì)胞等步驟，不僅需要飼養(yǎng)細(xì)胞、操作較繁瑣，而且NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果不明顯，且所獲得的NK細(xì)胞殺傷活性較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)擴(kuò)增NK細(xì)胞存在NK細(xì)胞擴(kuò)增率低且殺傷活性差等缺陷，提供一種能夠提高NK細(xì)胞擴(kuò)增率及殺傷活性的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：獲取NK細(xì)胞；在含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-l的培養(yǎng)基中對(duì)所述NK細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述培養(yǎng)基中，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的濃度為50-150ng/ml。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，獲取NK細(xì)胞的過(guò)程，包括以下步驟：獲取CD34+造血干細(xì)胞于含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行刺激分化成NK細(xì)胞。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體和白介素-15。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中，干細(xì)胞因子的濃度為10-50ng/ml、FMS樣酪氨酸激酶3配體的濃度為20-80ng/ml，以及白介素-15的濃度為20-80ng/mI。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，對(duì)所述NK細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)的步驟為：將所述胰島素樣生長(zhǎng)因子-l加入所述含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)20-50天。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述CD34+造血干細(xì)胞的獲取過(guò)程，包括以下步驟：從血細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)磁珠分選出CD34+造血干細(xì)胞。在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述血細(xì)胞采集自外周血、臍帶血、蛻膜組織和/或淋巴結(jié)。實(shí)施本發(fā)明提供的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效果：本發(fā)明通過(guò)采用胰島素樣生長(zhǎng)因子-l代替飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，不僅簡(jiǎn)化了NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的步驟，而且通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子-l能夠提高NK細(xì)胞的細(xì)胞活性和擴(kuò)增率以及NK細(xì)胞的殺傷活性，同時(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子-l還能夠刺激NK細(xì)胞分泌內(nèi)源性的胰島素樣生長(zhǎng)因子-l，以進(jìn)一步提高NK細(xì)胞的殺傷活性，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中，通過(guò)飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)存在NK細(xì)胞擴(kuò)增率低、殺傷活性差等缺陷。具體實(shí)施方式為解決現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方式存在擴(kuò)增率低、NK細(xì)胞殺傷活性差等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種NK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方式，通過(guò)采用胰島素樣生長(zhǎng)因子-1使得NK細(xì)胞能夠一直處于增殖狀態(tài)，并能夠提高其細(xì)胞活性及功能特性，提高NK細(xì)胞的殺傷活性等，而無(wú)需采用飼養(yǎng)細(xì)胞即可達(dá)到NK細(xì)胞的擴(kuò)增，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)NK細(xì)胞存在的操作復(fù)雜、NK細(xì)胞擴(kuò)增率低且殺傷活性差等缺陷。具體地，本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：S1、獲取NK細(xì)胞；S2、將NK細(xì)胞接種于含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。進(jìn)一步地，在步驟S1中，NK細(xì)胞可來(lái)自于外周血、臍帶血、蛻膜組織和/或淋巴結(jié)。NK細(xì)胞表面表達(dá)CD56抗原，不表達(dá)CD3抗原，根據(jù)CD56抗原的不同表達(dá)，NK細(xì)胞可分為CD56dimCD16bright和CD56brightCD16dim/neg兩大亞群；CD56brightCD16dim/negNK細(xì)胞則主要存在于淋巴結(jié)以及蛻膜組織中，以分泌細(xì)胞因子如干擾素-γ為主要功能，殺傷功能較弱；而CD56dimCD16brightNK細(xì)胞則主要存在于外周血中，有豐富的胞內(nèi)穿孔素，殺傷功能較強(qiáng)，因此，在本發(fā)明中，優(yōu)先采用從外周血中獲取NK細(xì)胞。NK細(xì)胞主要是由CD34+造血干細(xì)胞在造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激下分化發(fā)育為成熟的NK細(xì)胞，NK細(xì)胞的發(fā)育階段為：從CD34+造血干細(xì)胞先分化為共同淋巴樣前提細(xì)胞，共同淋巴樣前提細(xì)胞再生成NK前體細(xì)胞，NK前體細(xì)胞發(fā)育為不成熟NK細(xì)胞，最后，不成熟NK細(xì)胞獲得活化性和抑制性受體，并獲得功能發(fā)育為成熟的NK細(xì)胞。進(jìn)一步地，獲取NK細(xì)胞的過(guò)程，包括以下步驟：獲取CD34+造血干細(xì)胞于含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中，用于將CD34+造血干細(xì)胞分化發(fā)育成NK細(xì)胞的造血干細(xì)胞生長(zhǎng) 因子，包括干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體和白介素-15；且優(yōu)選地，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中，干細(xì)胞因子的濃度為10-50ng/ml、FMS樣酪氨酸激酶3配體的濃度為20-80ng/ml、白介素-15的濃度為20-80ng/mL。干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF)是一種通過(guò)錨定并表達(dá)于所有造血干細(xì)胞表面的酪氨酸受體c-Kit而發(fā)揮作用的因子，避免c-Kit表達(dá)缺陷導(dǎo)致造血干細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量的減少。FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt-3L)作用于CD34+造血干細(xì)胞，通過(guò)在細(xì)胞表面與TKR結(jié)合而發(fā)揮造血調(diào)控作用，對(duì)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增有明顯的促進(jìn)作用。SCF與Flt-3L同屬于酪氨酸激酶受體TKR家族，具有擴(kuò)增原始造血干細(xì)胞的協(xié)同作用，通過(guò)與特異性TKR結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，啟動(dòng)早期造血干細(xì)胞的分裂和增殖，使細(xì)胞走出G0期，開(kāi)始擴(kuò)增，抑制凋亡。白介素-15不僅能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化，而且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞NKG2D這一活化性受體的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷相關(guān)性基因如穿孔素的表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能。在這些生長(zhǎng)因子的刺激下，造血干細(xì)胞數(shù)量增加，并且造血干細(xì)胞隨著分化其表型也發(fā)生變化，發(fā)育早期階段，干細(xì)胞上的IL-2/IL-15R-β細(xì)胞因子受體，即CD122的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，干細(xì)胞隨之分化為NK前體細(xì)胞，NK前體細(xì)胞具有定向發(fā)育為成熟NK細(xì)胞的能力，但NK前體細(xì)胞表面不表達(dá)CD56抗原；同時(shí)，NK前體細(xì)胞因表達(dá)CD122分子即IL-2/IL-15受體β上調(diào)，所以對(duì)白介素-15的刺激增強(qiáng)非常敏感，白介素-15可以促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育，白介素-15主要來(lái)自于骨髓微環(huán)境中；此外，IL-15可以使NK細(xì)胞前體擴(kuò)增并分化為表達(dá)各種抑制性受體和活化性受體的成熟NK細(xì)胞。進(jìn)一步地，步驟S1中還包括獲取CD34+造血干細(xì)胞的過(guò)程，而CD34+造血干細(xì)胞則是從外周血血細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞后，經(jīng)磁珠分選出的。步驟S2中，培養(yǎng)基為干細(xì)胞培養(yǎng)基，可以與培養(yǎng)CD34+造血干細(xì)胞所采用的干細(xì)胞培養(yǎng)基保持一致；優(yōu)選地，培養(yǎng)基為SCGM(GMPSerum-freeStem CellGrowthMedium)培養(yǎng)基，購(gòu)自于德國(guó)CellGenix公司。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-likegrowthfactors-1,簡(jiǎn)稱(chēng)IGF-1)能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育及擴(kuò)增，并且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷活性，且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞本身分泌IGF-1，這種內(nèi)源性的IGF-1對(duì)NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要；優(yōu)選地，培養(yǎng)基中IGF-1的濃度為50-150ng/ml。進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，更為簡(jiǎn)化的過(guò)程步驟為：從外周血中分離出CD34+造血干細(xì)胞，然后接種于添加有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和IGF-1的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)20-50天，即可收獲擴(kuò)增后的NK細(xì)胞；其中，造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括干細(xì)胞因子、FLT-3配體和白介素-15。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。具體實(shí)施方式為：實(shí)施例1本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：S1a、獲取NK細(xì)胞；S11a、單個(gè)核細(xì)胞的分離；采集100ml人外周血的血樣，或80mL新生兒臍帶血的血樣，用1-2倍體積的PBS溶液稀釋血樣，充分混勻后，得到PBS血樣混合液，然后在每個(gè)50ml離心管中先加入15ml的Ficoll分離液，F(xiàn)icoll分離液的密度為1.077g/mL；再緩慢加入20-30ml的PBS血樣混合液，室溫離心，離心機(jī)升降速均調(diào)為0，于20℃、400g，離心30min，中間層為單個(gè)核細(xì)胞；用巴斯德吸管小心吸取，之后用1×PBS加滿(mǎn)離心管，充分離心洗滌單個(gè)核細(xì)胞(400g，離心l0min)，重懸細(xì)胞，備用。S12a、CD34+造血干細(xì)胞的分選；將步驟S11a中獲得的單個(gè)核細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞后調(diào)為2×108 個(gè)/m1的細(xì)胞懸液，按每毫升細(xì)胞懸液加入100μL抗體的比例，加入CD34抗體混合物，用移液器上下吹打充分混勻，室溫孵育15分鐘；然后按每毫升細(xì)胞懸液加入50μL磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混勻，室溫孵育10分鐘后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入聚苯乙烯試管(12×75rnm)，加PBS洗滌液(含2％FBS、0.01％EDTA)至2.5ml，在試管內(nèi)用移液器上下輕輕吹打2～3次，混勻細(xì)胞。再將試管插入磁極中，靜置五分鐘；然后將磁極連試管一起拿起，以連續(xù)緩慢的動(dòng)作傾倒磁極至倒置狀態(tài)，倒出上清部分。磁性標(biāo)記的細(xì)胞由于磁極磁場(chǎng)的吸引，仍然留在試管內(nèi)。保持磁極及試管倒置2～3秒，然后使試管口恢復(fù)向上的位置。從磁極中取出試管，加入2.5ml洗滌液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液2～3次，混勻細(xì)胞，再將試管放回磁極中，靜置五分鐘。重復(fù)洗滌4次后，試管中保留的為CD34+造血干細(xì)胞，備用。S2a、將CD34+造血干細(xì)胞接種于含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子及IGF-1的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；調(diào)整CD34+造血干細(xì)胞的細(xì)胞懸液密度為1×105個(gè)/ml，并接種于含有SCGM干細(xì)胞培養(yǎng)基(購(gòu)自于德國(guó)CellGenix公司)的24孔板中，接種前做流式分析檢測(cè)接種前CD34+造血干細(xì)胞含量，并保證CD34+造血干細(xì)胞在95％以上；再分別添加干細(xì)胞因子、FLT-3L和白介素-15以及IGF-1，并使得干細(xì)胞培養(yǎng)基中，干細(xì)胞因子的濃度為30ng/ml、FLT-3L的濃度為50ng/ml和白介素-15的濃度為50ng/mL以及IGF-1的濃度為100ng/mL；于37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)28天。實(shí)施例2與實(shí)施例1的不同之處在于，該實(shí)施例中所添加的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子及IGF-1在干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度分別為：干細(xì)胞因子的濃度為10ng/ml、FLT-3L的濃度為20ng/ml和白介素-15的濃度為20ng/mL以及IGF-1的濃度為50ng/mL。實(shí)施例3與實(shí)施例1的不同之處在于，該實(shí)施例中所添加的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子及IGF-1在干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度分別為：干細(xì)胞因子的濃度為50ng/ml、FLT-3L的濃度為80ng/ml和白介素-15的濃度為80ng/mL以及IGF-1的濃度為150ng/mL。為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提供的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法的顯著效果，通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。檢測(cè)對(duì)象：對(duì)照組：與本發(fā)明實(shí)施例1不同之處在于，該組所采用角化細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2以及飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞；檢測(cè)組1-3：分別為本發(fā)明實(shí)施例1-3所獲得的細(xì)胞。1、NK細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用BectonDickinson型流式細(xì)胞儀對(duì)擴(kuò)增后的NK細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測(cè)結(jié)果如下表1。表1由以上結(jié)果可以看出，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，檢測(cè)組1-3中的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，且均遠(yuǎn)高于對(duì)照組中的細(xì)胞數(shù)量；由此可知，通過(guò)本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法所獲得的NK細(xì)胞數(shù)量較多，提高了NK細(xì)胞的擴(kuò)增率。2、NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞(人紅白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，購(gòu)得)，重懸于0.5ml的含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，按100μCi/L×106細(xì)胞加入51Cr。于37°℃、5％CO2孵箱中孵育2h，每隔15min搖勻一次，標(biāo)記完畢后洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL加入圓底96孔板中，100μL/孔，作為殺傷實(shí)驗(yàn)中的靶細(xì)胞。按10:1、5:1和2.5:1等效IE比加入相應(yīng)量的NK細(xì)胞，在37℃、5％CO2孵箱中孵育4h，每孔收集100μL上清，測(cè)γ射線cpm值，按以下公式計(jì)算殺傷率：殺傷率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組cpm值-自然釋放cpm值)/(最大釋放cpm值-自然釋放cpm值)×l00％，檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)下表2：表2效靶比E/T對(duì)照組檢測(cè)組1檢測(cè)組2檢測(cè)組310∶127.7±1.950.2±2.948.5±2.152.5±2.75∶115.4±3.129.6±3.527.4±3.731.9±3.22.5∶19.3±1.817.3±3.115.7±3.619.6±3.3檢測(cè)結(jié)果：由表2中數(shù)據(jù)可知，檢測(cè)組1-3的細(xì)胞殺傷率均大于對(duì)照組，由此說(shuō)明，本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法提高了NK細(xì)胞的殺傷活性。綜上所述，本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，采用胰島素樣生長(zhǎng)因子-l進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞，不僅能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育及擴(kuò)增，提高NK細(xì)胞的細(xì)胞活性及擴(kuò)增率，而且還能夠促進(jìn)NK細(xì)胞自身分泌IGF-1，以提高NK細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)于NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用具有重要的意義，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，通過(guò)飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞存在的操作流程復(fù)雜、NK細(xì)胞擴(kuò)增率低，殺傷活性差等問(wèn)題。以上結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，上述的具體實(shí)施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保 護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3