本發(fā)明涉及一種細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，特別涉及一種中華鱉肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

中華鱉，又名水魚(yú)、甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú)，是常見(jiàn)的養(yǎng)殖龜種。中華鱉生活于江河、湖沼、池塘、水庫(kù)等水流平緩、魚(yú)蝦繁生的淡水水域，也常出沒(méi)于大山溪中。在安靜、清潔、陽(yáng)光充足的水岸邊活動(dòng)較頻繁，有時(shí)上岸但不能離水源太遠(yuǎn)。能在陸地上爬行、攀登，也能在水中自由游泳。喜曬太陽(yáng)或乘涼風(fēng)。民間諺語(yǔ)形容鱉的活動(dòng)是“春天發(fā)水走上灘，夏日炎炎柳蔭棲，秋天涼了入水底，冬季嚴(yán)寒鉆泥潭”。夏季有曬甲習(xí)慣，寒冷的冬季會(huì)冬眠，翌年開(kāi)始蘇醒尋食。喜食魚(yú)蝦、昆蟲(chóng)等，也食水草、谷類等植物性食物，并特別嗜食臭魚(yú)、爛蝦等腐食，耐饑餓，但貪食且殘忍，如食餌缺乏還會(huì)互相殘食。性怯懦怕聲響，白天潛伏水中或淤泥中，夜間出水覓食。

中華鱉是國(guó)內(nèi)主要的淡水名優(yōu)特色養(yǎng)殖品種，國(guó)內(nèi)第一個(gè)淡水魚(yú)類細(xì)胞系ZC-7901由張念慈楊廣智(1981)發(fā)表在水產(chǎn)學(xué)報(bào)上。以后有不少淡水魚(yú)類細(xì)胞系的建立。而中華鱉細(xì)胞體外培養(yǎng)也有報(bào)道。其中吳康，薛明強(qiáng)等(2000)發(fā)表在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，中華鱉胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究；李曉莉，曾令兵等(2010)發(fā)表在水生態(tài)學(xué)雜志上的中華鱉5種組織細(xì)胞的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；付建平，聶品等建立中華鱉主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系STA(soft-shelled turtle artery)，于2013年發(fā)表在Fish Pathology上。上述方法存在操作復(fù)雜，條件較苛刻，培養(yǎng)成功率較低的不足。中華鱉肺巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)方法也未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種中華鱉肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方便，培養(yǎng)成功率高，特別是沖洗離體肺組織，使得肺組織原代細(xì)胞分離培養(yǎng)容易方便，為中華鱉病毒研究提供有效的細(xì)胞介質(zhì)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種中華鱉肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

一、中華鱉完整肺巨噬細(xì)胞的分離：

(1)取100-500g重的中華鱉，體表消毒，采用斷頸法處死，解剖取出完整肺部組織；

(2)肺部組織置于預(yù)冷的加雙抗的PBS液中，去除多余的其它組織，洗滌3次，然后放入預(yù)冷的HBSS平衡鹽溶液中；

(3)采用含有3％胎牛血清的M199液體培養(yǎng)基為洗滌液注入肺部，沖洗兩次，合并兩次所得的沖洗液；

(4)沖洗液過(guò)100μm濾網(wǎng)，一次離心，去上清，沉淀加紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞5-8min，100μm濾網(wǎng)過(guò)濾，二次離心，二次離心所得細(xì)胞沉淀待用；

二、肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)：

二次離心所得細(xì)胞沉淀用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，按1×10⁶～5×10⁶個(gè)/ml細(xì)胞分裝至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，28～30℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，體表消毒采用0.1％高錳酸鉀浸泡20-30min。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，加雙抗的PBS液pH為7.4，雙抗為500μg/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，沖洗操作為將洗滌液注入肺部，保持洗滌液在肺內(nèi)并晃動(dòng)1-3分鐘，從氣管處倒出洗滌液得到?jīng)_洗液。

作為優(yōu)選，步驟(4)中，一次離心參數(shù)為800r/min離心5min，二次離心參數(shù)為800r/min離心5min。

作為優(yōu)選，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含有20-30％胎牛血清、100μg/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的M199液體培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)瓶使用前，先用1％明膠鋪板，置于37℃孵育2～4h，再去除明膠。這樣操作有利于肺巨噬細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。

作為優(yōu)選，28～30℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)3～4h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液以去除未貼壁的紅細(xì)胞和死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12～16h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)一步除去殘留紅細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明建立了中華鱉肺巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方便，無(wú)需特定的細(xì)胞分離液。用直接沖洗法即可有效獲得貼壁生長(zhǎng)的肺巨噬細(xì)胞，能在本發(fā)明中描述的培養(yǎng)條件下維持正常形態(tài)12-20d，可滿足后續(xù)較多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)用性非常高?？赏茝V應(yīng)用于其他爬行類水生動(dòng)物肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

附圖說(shuō)明

圖1是中華鱉離體肺組織。

圖2是貼壁生長(zhǎng)的肺巨噬細(xì)胞。

圖3是肺巨噬細(xì)胞的ACP染色鑒定。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

一種中華鱉肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

一、中華鱉完整肺巨噬細(xì)胞的分離：

(1)取100-500g重的中華鱉，采用0.1％高錳酸鉀浸泡20-30min進(jìn)行體表消毒，采用斷頸法處死，并盡量擠出血后，解剖取出完整肺部組織(帶部分氣管，見(jiàn)圖1)；

(2)肺部組織置于預(yù)冷的加雙抗的PBS液(pH 7.4，雙抗為500μg/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素)中，去除脂肪和結(jié)締組織等多余的其它組織，洗滌3次，然后放入預(yù)冷的HBSS平衡鹽溶液(市售)中；

(3)用無(wú)菌鑷子提起與肺部相連的氣管，將含有3％胎牛血清的M199液體培養(yǎng)基為洗滌液注入肺部，此時(shí)肺部膨脹，用另一把鑷子提起肺底部，兩端輕輕晃動(dòng)約1-3min，從氣管處倒出洗滌液完成一次沖洗，重復(fù)沖洗1次，合并兩次所得的沖洗液；

(4)沖洗液100μm濾網(wǎng)過(guò)濾，一次離心(800r/min離心5min)，去上清，沉淀加紅細(xì)胞裂解液(市售)裂解紅細(xì)胞5-8min，100μm濾網(wǎng)過(guò)濾，二次離心(800r/min離心5min)，二次離心所得細(xì)胞沉淀待用；

二、肺巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)：

二次離心所得細(xì)胞沉淀用細(xì)胞培養(yǎng)液(含有20-30％胎牛血清、100μg/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的M199液體培養(yǎng)基)重懸，按1×10⁶～5×10⁶個(gè)/ml細(xì)胞分裝至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，28～30℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)3～4h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液以去除未貼壁的紅細(xì)胞和死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12～16h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)一步除去殘留紅細(xì)胞，余下大部分為肺巨噬細(xì)胞，純度可達(dá)75-90％，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶使用前，先用1％明膠鋪板(即明膠覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，置于37℃孵育2～4h，再去除明膠。

細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定：在100×和400×相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞呈大多易于聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，表面粗糙；有少量紅細(xì)胞呈橢圓形，表面較為光滑(圖2)。巨噬細(xì)胞因酸性磷酸酶活性較高，經(jīng)ACP染色試劑盒染色后，細(xì)胞呈紅色(圖3)。分離培養(yǎng)后的細(xì)胞大多可被ACP染色試劑染成紅色，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞多為肺巨噬細(xì)胞?？捎糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

目前中華鱉肺巨噬細(xì)胞細(xì)胞可在體外培養(yǎng)12-20天，細(xì)胞仍維持良好狀態(tài)。本發(fā)明可獲得純度達(dá)75-90％肺巨噬細(xì)胞，可用于中華鱉病毒感染等實(shí)驗(yàn)研究。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。