本發(fā)明屬于生物細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種用于魚類單核/吞噬細胞分離、培養(yǎng)及功能驗證方法。

背景技術(shù)：

隨著近年來養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，由鰻弧菌等有害細菌引起的病害問題嚴重阻礙了高經(jīng)濟價值魚類（如半滑舌鰨）養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前尚無有效的免疫防治技術(shù)和方法，仍然采用化學藥物和抗生素等傳統(tǒng)的方式來控制病害的發(fā)生。外周血單核細胞（吞噬細胞的前體），是魚類體液免疫的重要組成部分，在魚類特異性免疫和非特異性免疫過程中起著重要作用。目前對于半滑舌鰨等魚類單核細胞的免疫功能研究尚屬起步階段，尚不清楚其作用機制，而且目前為止未獲得能連續(xù)培養(yǎng)用于細胞功能研究的半滑舌鰨吞噬細胞。

吞噬細胞的前體是單核細胞，細胞呈球形、圓梨形或不規(guī)則形，表面有細長的偽足樣胞突。單核細胞的核較小，呈腎形或馬蹄形，常偏于一側(cè)，核質(zhì)比<1。在Giemsa染色中，單核細胞的細胞核呈網(wǎng)格狀。透射電鏡下，其胞質(zhì)內(nèi)有較多的線粒體，有時還有高爾基體、粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體以及被吞噬的衰老細胞或其細胞核等。

單核細胞具有較強的吞噬能力，在魚類機體中發(fā)揮著重要的非特異性吞噬功能。它可通過偽足樣胞突捕捉并融合外來物質(zhì)以及自身的衰老細胞，并能產(chǎn)生活躍的變形運動。另外，單核細胞對環(huán)境變化也十分敏感，在生活于嚴重污染水域的魚類中，單核細胞的含量可比正常情況高近50倍。在魚類被寄生蟲感染或被人為地注入膠碳顆粒等物質(zhì)后，也可引起單核細胞數(shù)量的驟增。因此，通過測定魚類單核細胞的數(shù)量，可以初步了解魚類的健康狀況及其生活水域的環(huán)境質(zhì)量。

單核細胞以及單核細胞轉(zhuǎn)化后的吞噬細胞在抵抗和防御病原體感染中發(fā)揮重要作用，尤其是在細胞內(nèi)的病原體防御中發(fā)揮了巨大的作用。另外，吞噬細胞還存在于被吞噬細胞吞噬后的碎片中，它們在天然免疫和獲得性免疫中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。根據(jù)組織內(nèi)環(huán)境以及它們自身所處的不同分化及活性階段，它們都表現(xiàn)出不同的機能、形態(tài)和代謝作用。單核細胞來源于骨髓中的造血前驅(qū)細胞，它經(jīng)過2-3 d的血液循環(huán)便移行到各個組織當中，從而分化形成組織中的吞噬細胞。

獲得能在體外長期存活并可傳代培養(yǎng)的細胞，是進行細胞免疫學等研究的基礎(chǔ)。常見單核細胞分離方法包括：血漿凝膠法，標準 Ficoll 法和Percoll-paque 法。但是這些方法單獨利用容易產(chǎn)生淋巴細胞、粒性白細胞、血小板和各種紅細胞的混合懸液。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，為了解決上述問題，本發(fā)明提出一種用于魚類單核細胞的分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化及功能驗證方法。具體的方案如下：

一種用于魚類單核/吞噬細胞分離、培養(yǎng)方法，其包括以下的步驟：

步驟一：單核細胞的分離與培養(yǎng)；

步驟二：單核細胞誘導為吞噬細胞的體外培養(yǎng)；

進一步，步驟一中，具體步驟如下：

S1:抽取魚類外周血，以全血與Hank’s緩沖液1:2.5-1:3稀釋混勻得稀釋血液；

S2:取稀釋血液1.5倍量、比重1.05-1.09之間的淋巴細胞分離液與釋釋血液于離心管中；

S2:水平離心機1800-2100rpm離心18-21分鐘，收集單個核細胞層；

S4:加入4-5倍體積的Hank’s緩沖液洗2次，900-1100rpm 離心5min收集細胞沉淀；

S5:重懸于DMEM完全培養(yǎng)基，接種在培養(yǎng)瓶置于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h；

S6:Hank’s緩沖液洗去上清，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞；

S7:離心獲得單核細胞層，即包括淋巴細胞和單核細胞；

S8:將分離后的單個核細胞重懸于添加促貼壁生長因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基中；

S9:培養(yǎng)2-4h后洗去懸浮淋巴細胞，獲得貼壁的單核細胞。

進一步，步驟二中，具體步驟如下：

S1:在含有單核細胞、15%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)集中加入10-15%的淋巴細胞；

S2:隔天半量換取新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-12天。

一種單核/吞噬細胞的功能驗證方法，其包括以下的步驟：

S1:將分離得到的單核細胞加佛波酯（PMA）刺激劑50ul，在23-25℃下孵育15min；

S2:加二氫若丹明25ul，在24℃下避光孵育5min；

S3:采用PBS緩沖液洗滌2次；

S4:1500rpm離心5min；

S5:去上清液，加0.5mlPBS緩沖液重懸細胞；

S6:用上流式細胞儀檢測。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明用細胞分離液進行密度梯度離心，通過修正實驗過程中的各種參數(shù)和實驗條件，成功的分離純化魚類單核細胞（吞噬細胞），而后通過優(yōu)化營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，將半滑舌鰨單核細胞以貼壁生長的方式培養(yǎng)一周以上，可滿足于后續(xù)實驗。本發(fā)明成功進行了吞噬細胞的呼吸爆發(fā)檢測，為深入研究單核/吞噬細胞的生物學特性和免疫學功能提供材料。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中單核細胞形態(tài)（A：培養(yǎng)12h；B：培養(yǎng)24h；C：培養(yǎng)32h；D：培養(yǎng)38h）；

圖2為本發(fā)明實施例中單核細胞生長曲線;

圖3為本發(fā)明實施例中PMA刺激下的呼吸爆發(fā)檢測；

圖4為本發(fā)明實施例中鰻弧菌感染后的呼吸爆發(fā)檢測；

圖5為本發(fā)明實施例中單核細胞與吞噬細胞；

圖6為本發(fā)明實施例中吞噬細胞的幾種形態(tài)；

圖7為本發(fā)明實施例中老化的吞噬細胞；

圖8為本發(fā)明實施例中姬姆薩染色的吞噬細胞；

圖9為本發(fā)明實施例中吞噬雞紅細胞的吞噬細胞；

圖10為本發(fā)明實施例中培養(yǎng)第 5 天吞噬細胞染色體中期分裂相；

圖11為本發(fā)明實施例中吞噬細胞染色體數(shù)分布。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，基于本申請中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的其它類同實施例，都應(yīng)當屬于本申請保護的范圍。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：在魚類外周血細胞中，各種細胞由于形態(tài)和重量的差異，導致在進行密度梯度離心時：比重最大的紅細胞和粒細胞，次之的單個核細胞(包括淋巴細胞和單核細胞) ，比重最小的血栓細胞會在分離時處于不同層次。因此，通過修正離心轉(zhuǎn)速，離心時間，以及分離液的密度比例，就可以利用密度梯度離心的方法，將上述細胞進行分離。離心后，從上到下可分為透明的血漿層，呈白膜狀的單個核細胞層，透明的分離液層，粒細胞和紅細胞比重最大，沉在最下面，從而達到粗分離的目的；其次，白膜層中的淋巴細胞和吞噬細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時貼壁的能力存在差異，因此通過不通貼壁力的區(qū)分，可以成功分離吞噬細胞，細胞培養(yǎng)基中的血清能促進細胞生長，并有助于細胞貼壁，因此通過修正血清的加入量和加入時機，在培養(yǎng)一定時間后，通過修正胰酶濃度，來消化貼壁細胞可有效分離吞噬細胞和淋巴細胞；而且，在體外單核細胞會被吞噬細胞集落刺激因子（M-CSF）活化成吞噬細胞，吞噬細胞具有吞噬活性，呼吸爆發(fā)等特征。這是淋巴細胞和吞噬細胞之間最大的差異，可通過此條件鑒定吞噬細胞。

實施例：以半滑舌鰨為例，介紹本發(fā)明的一種用于魚類吞噬細胞的培養(yǎng)、功能驗證及吞噬細胞的轉(zhuǎn)化方法。

1.半滑舌鰨外周血單核細胞的分離與培養(yǎng)

半滑舌鰨于冰水中麻醉， 70%酒精棉球擦拭背部尾靜脈，肝素抗凝管抽取外周血2ml，于超凈工作臺中將全血與Hank’s緩沖液1:2.5-1:3稀釋混勻，取比重1.05-1.09之間的淋巴細胞分離液3ml于15ml離心管中，加入2ml稀釋血液于水平離心機1800-2100rpm離心18-21分鐘，收集單個核細胞層，加入4-5倍體積的Hank’s緩沖液洗2次，900-1100rpm 離心5min收集細胞沉淀，重懸于DMEM完全培養(yǎng)基，接種在培養(yǎng)瓶置于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，Hank’s緩沖液洗去上清，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞，隔天半量換新鮮的完全DMEM培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

利用半滑舌鰨外周血不同細胞的比重差異，離心獲得單核細胞層，即包括淋巴細胞和單核細胞，根據(jù)淋巴細胞在體外不貼壁呈懸浮狀態(tài)，而單核細胞極易貼壁的特點，將分離后的單個核細胞重懸于添加促貼壁生長因子bFGF并含10-15%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4h后洗去懸浮淋巴細胞，獲得貼壁的單核細胞，可培養(yǎng)一周以上，倒置顯微鏡下單核細胞形態(tài)圖1。胞體直徑12～16μm，細胞呈現(xiàn)扇形，多邊形等不規(guī)則形態(tài)，胞質(zhì)量多，具有較強的貼壁性。

2.MTT法檢測單核細胞體外生長曲線

將分離的單核細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中24℃培養(yǎng)。分別在0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h加入50ul MTT溶液，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。洗凈上清，每孔加150ul DMSO，平板搖床10min，酶標儀檢測在570nm波長處每孔的光密度，重復三次。MTT法檢測的半滑舌鰨單核細胞體外生長曲線見圖2。細胞在接種3h就能很好的貼壁，12h后迅速增殖，48h細胞數(shù)量基本穩(wěn)定，細胞呈現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象，形態(tài)不規(guī)則形。

3.單核細胞呼吸爆發(fā)的測定

分離得到的單核細胞加佛波酯（PMA）刺激劑50ul，23-25℃孵育15min，加二氫若丹明25ul，24℃避光孵育5min，PBS緩沖液洗滌2次，1500rpm離心5min，去上清液，加0.5mlPBS緩沖液重懸細胞，上流式細胞儀檢測，設(shè)置對照組，對照組不加入單核細胞；同時直接對半滑舌鰨進行鰻弧菌感染：設(shè)實驗組和對照組，實驗組用3.18×10⁵ CFU/g (半致死劑量，LD50) 對半滑舌鰨進行腹腔注射，對照組參照實驗組注射與體重相應(yīng)劑量的PBS注射。24h后分別無菌取實驗組魚和對照組魚外周血，按照上述方法分離獲得單核細胞，加佛波酯（PMA）刺激劑50ul24℃孵育15min，加二氫若丹明25ul，24℃避光孵育5min，PBS緩沖液洗滌2次，1500rpm離心5min，去上清液，加0.5mlPBS緩沖液重懸細胞，分別上流式細胞儀檢測。

流式細胞儀檢測結(jié)果如圖3，正常細胞對照組中發(fā)熒光的細胞比例為0.4%，而實驗組中PMA刺激下的單核細胞發(fā)熒光的細胞比例為80.67%，說明分離得到的單核細胞具有呼吸爆發(fā)功能。鰻弧菌感染后分離獲得的單核細胞的呼吸爆發(fā)如圖4，對照組中發(fā)熒光的細胞比例為4.18%，而實驗組中發(fā)熒光的細胞比例為83.81%，說明病原刺激顯著增強單核細胞呼吸爆發(fā)強度。

4.單核細胞誘導為吞噬細胞的體外培養(yǎng)

單核細胞和淋巴細胞體外共培養(yǎng)，能刺激單核細胞活化變?yōu)榈湫偷耐淌杉毎?。因此在含?5%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)集中加入5-10%數(shù)量比的淋巴細胞，隔天半量換取新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)3d后，倒置相差顯微鏡下觀察（如圖5）。吞噬細胞貼壁，細胞伸展，牢固黏附，體積明顯增大，從不規(guī)則形逐漸變成橢圓形，呈煎蛋狀，少數(shù)呈長梭形。細胞間可有部分融合，細胞周邊或兩極可見板狀偽足和突起，細胞無明顯增殖(如圖6)，培養(yǎng)至13天，吞噬細胞發(fā)生老化（如圖7）。

5.吞噬細胞染色觀察

吞噬細胞培養(yǎng)至7天，PBS緩沖液洗去培養(yǎng)瓶中懸浮的淋巴細胞，加甲醇固定貼壁的吞噬細胞，滴加稀釋好的姬姆薩染色液使其覆蓋瓶底，室溫染色20min，吸去染液，蒸餾水沖洗貼壁細胞，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，吞噬細胞細胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則。胞漿豐富，淡粉色，富含顆粒及少許空泡。胞核藍紫紅色，為卵圓形、腎形或不規(guī)則形，具有典型的吞噬細胞形態(tài)學特征(圖8)。

6.吞噬細胞吞噬功能的驗證

雞紅細胞吞噬試驗：培養(yǎng)第5d在培養(yǎng)體系中加入10-15％雞紅細胞懸液100ul/ml，24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育30 min至1h，PBS沖洗后鏡檢。吞噬雞紅細胞的吞噬細胞，胞漿內(nèi)可見多個雞紅胞，核被擠壓(見圖9)。外來病菌入侵吞噬細胞，鏡檢觀察培養(yǎng)基先是渾濁，繼續(xù)置于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)吞噬細胞最終將病菌吞噬，培養(yǎng)基變得澄清。

7.吞噬細胞染色體核型分析

在吞噬細胞培養(yǎng)至第 5 天時進行核型分析，制備染色體步驟如下：培養(yǎng)瓶內(nèi)加入秋水仙素，濃度為1ug/ml，作用3-4h，吸棄培養(yǎng)基，PBS 沖洗，用 0.25%胰酶消化混合液消化后加入培養(yǎng)基吹打，吞噬細胞貼壁較緊，難消化的細胞使用細胞刮，再將細胞懸液移入 15ml 離心管，以 1500rpm 離心5min，吸棄上清，加入 5ml 的 0.0375M KCl 后 在 37℃水浴鍋中低滲處理 25min，緩慢加入 1ml 新配的預(yù)冷卡諾固定液，以 1000rpm 離心 min，吸棄上清，加入 2ml 卡諾固定液，冰浴固定處理 15min，以 1000rpm 離心 5min，重復操作兩次，第二次固定后根據(jù)離心收集的細胞多少留存 0.2-0.5ml卡諾固定液，冷滴片法滴片，待載玻片干燥后，用 5%Gimsa 染色 25min，干燥后油鏡鏡檢。

對培養(yǎng)5天的吞噬細胞進行了染色體核型分析，在統(tǒng)計的 100 個分裂相中，染色體數(shù)目從 28-56不等，其中61%的分裂相染色體數(shù)目為 42 條（圖 10），42 條染色體全部是端著絲點染色體，并且其中包含 W 異型染色體。染色體數(shù)目呈正態(tài)分布，二倍體染色體數(shù)目出現(xiàn)頻率最高，其他非整倍體所占比例很小（圖 11 ）。

以上已將本發(fā)明做一詳細說明，以上所述，僅為本發(fā)明之較佳實施方式而已，當不能限定本發(fā)明實施范圍，即凡依本申請范圍所作均等變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋范圍內(nèi)。