專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是涉及一種利用流式細(xì)胞儀的 快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)來(lái)檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法。
背景技術(shù)：
腹腔吞噬細(xì)胞對(duì)于機(jī)體抵御病原體的入侵起著重要的作用。吞噬細(xì)胞屬于非特 異性免疫細(xì)胞，能夠非特異性的吞噬進(jìn)入人體內(nèi)的病原體，衰老病變細(xì)胞，參與抗原識(shí)別與 遞呈，生成多種細(xì)胞因子，在機(jī)體的固有免疫中發(fā)揮重要作用。因此，檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性對(duì) 于藥物的篩選和功能性食品的開(kāi)發(fā)具有極其重要的意義。而傳統(tǒng)的檢測(cè)吞噬細(xì)胞的活性主 要有吞噬雞紅細(xì)胞和酵母的方法，由于這些方法費(fèi)時(shí)、工作量大，受人的主觀(guān)因素影響比較 大，觀(guān)察的數(shù)量較少，一般只計(jì)數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞，所以存在一定誤差。目前，用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。由于流式 細(xì)胞儀檢測(cè)速度可達(dá)每秒10，000個(gè)左右的細(xì)胞，共計(jì)數(shù)20，000個(gè)細(xì)胞，極大的提高了檢測(cè) 的準(zhǔn)確性，并為樣本數(shù)量較多的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確、可行的實(shí)驗(yàn)方法。自1982 年Steinkamp首創(chuàng)熒光微球流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)吞噬細(xì)胞吞噬功能以來(lái)，到目前為止，發(fā) 展起來(lái)的技術(shù)方法也很多，如吞噬熒光微球的方法以及吞噬熒光標(biāo)記大腸桿菌、金黃色葡 萄球菌和結(jié)核分枝桿菌等細(xì)菌的方法。其中，吞噬熒光微球的方法中，熒光微球顆粒比較均 一，與小鼠血清孵育后，能夠使其表面結(jié)合免疫球蛋白，有很好的檢測(cè)效果，但是成本較高。 用大腸桿菌等一些細(xì)菌用來(lái)檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性具有以下缺點(diǎn)第一，細(xì)胞較小，很容易被吞 噬細(xì)胞表面受體所粘附，影響檢測(cè)結(jié)果。第二，利用FITC標(biāo)記這些細(xì)菌，標(biāo)記率較低，因此 在實(shí)驗(yàn)中會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。V. Miliukien 等報(bào)道了用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)外周血中 中性粒細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記啤酒酵母來(lái)檢測(cè)其吞噬活性，但由于其沒(méi)有把未吞噬的熒光酵母 細(xì)胞除去，只是利用前向光和側(cè)向光圈住吞噬細(xì)胞，由于酵母細(xì)胞個(gè)體較大，數(shù)目遠(yuǎn)多于粒 細(xì)胞的個(gè)數(shù)，因此，在流式細(xì)胞儀獲取的細(xì)胞中含有大量的酵母細(xì)胞，使獲取的粒細(xì)胞數(shù)量 減少，同時(shí)其中混有大量的酵母細(xì)胞，也影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；而且，在結(jié)果分析中，沒(méi) 有對(duì)中性粒細(xì)胞吞噬酵母的個(gè)數(shù)進(jìn)行定量分析，因此無(wú)法計(jì)算出粒細(xì)胞的吞噬指數(shù)。目前，尚未有利用熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞作為材料來(lái)檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方 法，由于V. Miliukien e的方法中存在上述缺陷，因此，需要在原有利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞 噬細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上探索出一套更加準(zhǔn)確、可靠、易行的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性技術(shù)中的不足之 處，提供一種能夠消除未吞噬熒光酵母細(xì)胞對(duì)分析結(jié)果的影響，對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬酵母的個(gè) 數(shù)進(jìn)行定量分析，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性的方法。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法，其特征在于，包括下述步驟
(1)制備啤酒酵母細(xì)胞凍干粉利用土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)啤酒酵母細(xì)胞，并將獲得的 啤酒酵母細(xì)胞溶液通過(guò)冷凍干燥制成啤酒酵母細(xì)胞凍干粉；(2)利用FITC標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞將FITC與二甲亞砜按照Img 200 μ 1的比例 溶解，然后與PH值為9. 5、濃度為0. 5Μ的碳酸緩沖液混合配制成濃度為0. lmg/ml的FITC 溶液備用；將步驟(1)中得到的啤酒酵母細(xì)胞凍干粉與PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩 沖液按20mg Iml的比例混勻后，80°C滅活15min;滅活后離心，棄上清液取沉淀；將得到 的沉淀物與上述備用的0. lmg/ml的FITC溶液混勻，室溫避光孵育Ih對(duì)啤酒酵母細(xì)胞進(jìn)行 熒光標(biāo)記，其中，0. lmg/ml的FITC溶液的用量為與步驟(1)中得到的啤酒酵母凍干粉的比 例為Iml 20mg ；將上述熒光標(biāo)記后的溶液用pH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液離 心洗滌，直至上清液無(wú)色透亮；離心，棄上清液取沉淀得到熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞；檢測(cè) 熒光標(biāo)記率，調(diào)整最終熒光標(biāo)記率合格的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液，其熒光標(biāo)記啤酒酵 母細(xì)胞濃度為2 X IO9個(gè)/ml于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?3)將步驟⑵中得到的備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與小鼠血清按照體 積比為1 1的比例室溫孵育60min，用PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液調(diào)整熒光 標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞濃度為1 X IO9個(gè)/ml ；(4)將吞噬細(xì)胞的個(gè)數(shù)至少為IXlO6個(gè)/ml的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)板的 一個(gè)孔中作為陰性對(duì)照；將步驟(3)中得到的與小鼠血清孵育后的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞 的懸液與同樣的上述吞噬細(xì)胞的個(gè)數(shù)至少為IX IO6個(gè)/ml的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入到細(xì) 胞培養(yǎng)板中其余的孔中，按照吞噬細(xì)胞和熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)比為1 20的比 例混合；然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)箱中貼壁孵育40min，用4°C pH值為7. 2、濃度為 0. OlM的PBS緩沖液沖洗除去細(xì)胞培養(yǎng)板中多余的啤酒酵母細(xì)胞和沒(méi)有貼壁的腹腔吞噬細(xì) 胞，最后，在培養(yǎng)板除陰性對(duì)照孔外的各孔中加入4°C的0. 5mlpH值為7. 2、濃度為0. OlM的 PBS緩沖液混勻，獲得吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液，用移液槍將其轉(zhuǎn)移至流 式管中，將流式管置于冰上，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；(5)利用流式細(xì)胞儀對(duì)步驟(2)中備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液和步驟(4) 中得到的吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲取數(shù)據(jù)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn) 行分析①取步驟(4)中沒(méi)有加熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照進(jìn)行 上樣，通過(guò)調(diào)整FLl熒光通道電壓，使腹腔吞噬細(xì)胞群體峰的位置位于熒光電壓橫軸左側(cè)， 并對(duì)腹腔吞噬細(xì)胞進(jìn)行獲??；②在流式細(xì)胞儀各熒光電壓參數(shù)和閾值保持不變的情況下， 利用流式細(xì)胞儀測(cè)得步驟(2)中備用的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，并以此 熒光強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)；③取步驟(4)中獲得的吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液 進(jìn)行上樣，在流式細(xì)胞儀各參數(shù)保持不變的情況下，利用流式細(xì)胞儀對(duì)流式管中的腹腔吞 噬細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞獲取；④利用BD CellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)獲取的腹腔吞噬細(xì) 胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先畫(huà)散點(diǎn)圖，通過(guò)前向光和側(cè)向光，圈住腹腔吞噬細(xì)胞群體區(qū)域，然后畫(huà) 柱狀圖對(duì)陰性區(qū)域設(shè)門(mén)Ml ；將步驟②的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度設(shè)為一 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，對(duì)步驟③得到的細(xì)胞獲取結(jié)果按照標(biāo)準(zhǔn)單位的倍數(shù)進(jìn)行設(shè)門(mén)，從門(mén)Ml的右端
至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位的位置為M2，在2倍、3倍.......n-1倍標(biāo)準(zhǔn)單位處設(shè)門(mén)依次分別為M3、
M4......Mn。其中M1代表Ml門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞數(shù)，即陰性腹腔吞噬細(xì)胞群體，為沒(méi)有吞噬啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞總數(shù)；M2代表M2門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞總數(shù)，即吞噬1個(gè) 酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；Mn代表Mn門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)，即吞噬n_l個(gè)酵母細(xì) 胞的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；
根據(jù)設(shè)門(mén)的個(gè)數(shù)來(lái)確定η的值，對(duì)門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析，分別得到Ml、Μ2、
M3......Mn門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)和Ml門(mén)內(nèi)腹腔吞噬細(xì)胞占總吞噬細(xì)胞的百分率，按
照下列兩個(gè)公式分別計(jì)算吞噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)吞噬率(％ )=吞噬啤酒酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)=I-Ml門(mén) 內(nèi)吞噬細(xì)胞占總吞噬細(xì)胞的百分率；吞噬指數(shù)=被吞噬的酵母細(xì)胞總數(shù)/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)= [M2+2M3+3M4+......+(n_l) Mn] /獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)。利用土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)啤酒酵母細(xì)胞的方法為將啤酒酵母菌種接種在斜面土豆 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，向斜面土豆培養(yǎng)基里面加入無(wú)菌水，用接種環(huán)輕刮，使斜面土豆培養(yǎng)基表 面的啤酒酵母懸于無(wú)菌水中，將啤酒酵母懸液置于渦旋混勻器上混勻，得到啤酒酵母菌懸 液；吸取0. 5ml啤酒酵母菌懸液加入平板土豆培養(yǎng)基，涂布后，置于28°C的培養(yǎng)箱中，3天 后，向每個(gè)土豆平板培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，用玻璃棒刮取并收集啤酒酵母細(xì)胞，用PBS緩 沖液8000rpmX Imin離心洗滌兩次之后，500rpmX Imin離心，棄去沉淀，取上層細(xì)胞懸液 SOOOrpmX Imin離心一次，棄去上清，獲取沉淀，即為啤酒酵母細(xì)胞。將獲得的啤酒酵母細(xì)胞 懸液放入-20°C的冰箱中冷凍后，置入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥制成啤酒酵母凍干粉。所述土豆培養(yǎng)基的成分按以下質(zhì)量比例進(jìn)行配置去皮土豆葡萄糖瓊脂水 =50 5 4 200。本發(fā)明具有下述技術(shù)效果1、本發(fā)明的方法利用流式細(xì)胞儀所獲取的細(xì)胞數(shù)據(jù)和吞噬細(xì)胞易貼壁的生物學(xué) 特性，以及FITC標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞接近100%的熒光標(biāo)記率，消除了未吞噬的熒光啤酒酵 母細(xì)胞對(duì)分析結(jié)果的影響，能夠準(zhǔn)確的測(cè)定吞噬率和吞噬指數(shù)。2、本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)板中吞噬細(xì)胞和熒光酵母?jìng)€(gè)數(shù)比為1 20，這樣就保證 了酵母細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的充分結(jié)合，并且通過(guò)幾次沖洗，除去了培養(yǎng)板中多余的啤酒酵母 細(xì)胞和未貼壁的吞噬細(xì)胞，減小了進(jìn)行流式分析時(shí)啤酒酵母細(xì)胞對(duì)吞噬細(xì)胞的干擾。3、本發(fā)明將啤酒酵母通過(guò)冷凍干燥制成凍干粉，延長(zhǎng)了啤酒酵母的保存時(shí)間，對(duì) 于制備檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性試劑盒具有很好的應(yīng)用前景。而且，細(xì)胞大小均一，保證了熒 光強(qiáng)度的均一性和吞噬細(xì)胞吞噬熒光酵母的穩(wěn)定性。4、本發(fā)明根據(jù)吞噬細(xì)胞吞噬啤酒酵母細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度來(lái)對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬熒光 標(biāo)記啤酒酵母的個(gè)數(shù)進(jìn)行定量分析，利用本發(fā)明中的公式通過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)計(jì)算，較為準(zhǔn)確 的測(cè)定了吞噬率和吞噬指數(shù)，提供了一種重復(fù)性好，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)吞噬細(xì)胞 活性的方法。5、本發(fā)明的方法中利用將啤酒酵母作為吞噬顆粒，利用FITC進(jìn)行熒光標(biāo)記，具有 較高的標(biāo)記率。


圖1為未被標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的散點(diǎn)圖2為未被熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的柱狀圖；
圖3為FITC熒光標(biāo)記的啤酒酵母的柱狀圖；圖4為未吞噬酵母的腹腔吞噬細(xì)胞流式柱狀5為測(cè)定熒光標(biāo)記啤酒酵母的平均熒光強(qiáng)度；圖6為吞噬熒光標(biāo)記啤酒酵母的腹腔吞噬細(xì)胞的散點(diǎn)圖；圖7是腹腔吞噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記啤酒酵母的流式柱狀圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)制備啤酒酵母細(xì)胞凍干粉將啤酒酵母菌種接種在斜面土豆培養(yǎng)基進(jìn)行活化，向斜面土豆培養(yǎng)基里面加入無(wú) 菌水3ml，用接種環(huán)輕刮，使斜面土豆培養(yǎng)基上的啤酒酵母細(xì)胞懸浮于無(wú)菌水中，將啤酒酵 母懸液置于渦旋混勻器上混勻，得到啤酒酵母菌懸液。吸取0. 5ml啤酒酵母菌懸液加入土 豆培養(yǎng)基平板上，涂布后，置于28°C的培養(yǎng)箱中，3天后，向每個(gè)土豆培養(yǎng)基平板上加入無(wú) 菌水約0. 1-0. 2ml，用玻璃棒刮取并收集啤酒酵母細(xì)胞，用PBS緩沖液8000rpmX Imi η離心 洗滌兩次之后，500rpmX Imin離心，棄去沉淀，取上層細(xì)胞懸液8000rpmX Imin離心一次， 棄去上清，獲取沉淀，即為啤酒酵母細(xì)胞。將獲得的啤酒酵母細(xì)胞溶液放入-20°C的冰箱中 冷凍后，置入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥制成啤酒酵母凍干粉。所述土豆培養(yǎng)基的成分是去皮 土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂16g、水1000ml。(2)小鼠血清的制備用昆明小鼠制備小鼠血清作為調(diào)理素。用鑷子摘除小鼠眼 球取血，在離心管中室溫靜置30min，在4°C冰箱放2h。隨后在4°C、IOOOg離心力下離心 30min,吸取上層血清，分裝后，于-20°C冰箱中保存。(3)用F ITC熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞將Img FITC用200 μ 1 二甲亞砜溶解后與ρΗ值為9. 5、濃度為0. 5Μ的碳酸緩沖 液混合配置成濃度為0. lmg/ml的FITC溶液備用。將步驟(1)中得到的120mg啤酒酵母凍 干粉與PH值為7. 2、濃度為0. OlM的6ml PBS緩沖液混勻后，放入80°C恒溫水浴箱中加熱 15分鐘滅活。滅活后SOOOrps離心2min，棄上清液取沉淀物，將得到的沉淀物與6ml上述 備用的0. lmg/ml的FITC溶液混勻，室溫避光孵育Ih對(duì)啤酒酵母細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。將上 述熒光標(biāo)記后的溶液用PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液離心洗滌4次，直至上清液 無(wú)色透亮。離心棄上清液取沉淀得到熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記酵母的標(biāo)記率首先利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)未標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞懸液將步驟(1)得到的少許啤 酒酵母細(xì)胞凍干粉與PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液混勻制成沒(méi)有標(biāo)記的啤酒酵 母細(xì)胞懸液。上樣未被標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞懸液，圖1為未被標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的散點(diǎn) 圖，分析圈住的Rl區(qū)域?yàn)槠【平湍讣?xì)胞群體，調(diào)整熒光電壓通道，使啤酒酵母細(xì)胞群體處 于流式柱狀圖的左側(cè)，并設(shè)陰性對(duì)照門(mén)m，如圖2所示，其中m門(mén)內(nèi)的陰性酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)為 9986，占的比例為99. 86%。然后取少許熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞懸液利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記率將少 許上述得到的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞加入PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液混勻制成熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞懸液，上樣熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)，如圖3 所示，共獲取了 10000個(gè)酵母細(xì)胞，將圖2中m的門(mén)復(fù)制到圖3中，然后在圖3中m的右 側(cè)區(qū)域設(shè)門(mén)N2，N2中的熒光標(biāo)記后的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為9997，占的比例為99. 97%，啤酒酵母 細(xì)胞的熒光標(biāo)記率即為N2門(mén)內(nèi)的啤酒酵母細(xì)胞數(shù)占圖1中圈中Rl區(qū)域的啤酒酵母細(xì)胞總 數(shù)的百分率，為99. 97%，熒光標(biāo)記率大于99. 9%的說(shuō)明標(biāo)記合格。將得到的標(biāo)記合格的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞加入pH值為7. 2、濃度為0. OlM的 PBS緩沖液混勻，并調(diào)整最終熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的濃度為2X IO9個(gè)/ml，得到熒光標(biāo)記 啤酒酵母細(xì)胞的懸液于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?4)將步驟(3)中得到的備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與步驟(2)中得到的小鼠血清按照體積比為1 1的比例室溫孵育60min，用pH值為7. 2,0. OlM的PBS緩沖 液調(diào)整，最終調(diào)整獲得的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞濃度為IX IO9個(gè)/ml。(5)腹腔吞噬細(xì)胞懸液的制備實(shí)驗(yàn)前兩天，向小鼠腹腔注射Iml的肉湯。實(shí)驗(yàn)時(shí)， 斷頸處死小鼠，用注射器向小鼠腹腔注射PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液4ml，輕 柔小鼠腹部，剪開(kāi)腹腔，吸取腹腔液2ml于離心管中，用pH值為7. 2,0. OlM的PBS緩沖液洗 滌，離心一次后取沉淀，加入PH值為7. 2、濃度為0. OlM的PBS緩沖液0. 5ml懸浮腹腔吞噬 細(xì)胞，混勻后，調(diào)整吞噬細(xì)胞濃度為2 X IO6個(gè)/ml，得到腹腔吞噬細(xì)胞懸液。(6)將步驟(5)中制備的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中作為陰 性對(duì)照。將步驟(4)中得到的與小鼠血清孵育后的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與步驟
(5)中制備的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的其余的孔中按照吞噬細(xì)胞和熒光標(biāo)記 的啤酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)比為1 20的比例混合，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)箱中貼壁孵 育40min，棄去孔內(nèi)液體，在細(xì)胞培養(yǎng)板除陰性對(duì)照孔外的各孔加入4°CpH值為7. 2、濃度為 0. OlM的PBS緩沖液1ml，輕輕晃動(dòng)沖洗一次，洗除去培養(yǎng)板中多余的啤酒酵母細(xì)胞和沒(méi)有 貼壁的腹腔吞噬細(xì)胞，然后在培養(yǎng)板除陰性對(duì)照孔外的各孔加入4°C的0. 5mlpH值為7. 2、 濃度為0. OlM的PBS緩沖液抽吸吹打，混勻，獲得吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸 液，用移液槍將其轉(zhuǎn)移至流式管中，將流式管置于冰上，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(7)利用流式細(xì)胞儀對(duì)步驟(3)中的備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液和步驟
(6)中得到的吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液以及貼壁孵育的沒(méi)有加入熒光 酵母的腹腔吞噬細(xì)胞懸液樣本進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本獲取10，000個(gè)細(xì)胞，利用BD CellQuest Pro獲取細(xì)胞并對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析①取步驟(6)中貼壁孵育的沒(méi)有加熒光啤酒酵母 細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照進(jìn)行上樣，通過(guò)調(diào)整FLl熒光通道電壓，使腹腔吞 噬細(xì)胞群體峰的位置位于熒光電壓橫軸左側(cè)，設(shè)陰性對(duì)照門(mén)M1，如圖4所示，并對(duì)腹腔吞 噬細(xì)胞進(jìn)行獲取。②在流式細(xì)胞儀各熒光電壓參數(shù)和閾值保持不變的情況下，利用流式細(xì) 胞儀測(cè)得步驟(3)中的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，并以此熒光強(qiáng)度作為標(biāo) 準(zhǔn)，如圖5所示，測(cè)得啤酒酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度為2603. 31。③取步驟(6)中獲得的流式管中的 吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液進(jìn)行上樣，在流式細(xì)胞儀各參數(shù)保持不變的情 況下，利用流式細(xì)胞儀對(duì)流式管中的腹腔吞噬細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞獲取。④利用BDCellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)獲取的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，先畫(huà)散點(diǎn)圖，如圖6所示，利用流式細(xì)胞儀 通過(guò)前向光和側(cè)向光，將腹腔巨噬細(xì)胞區(qū)域圈住，設(shè)為R2區(qū)域；然后對(duì)R2區(qū)域內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行 分析，然后畫(huà)柱狀圖，如圖7所示，將①中的陰性對(duì)照門(mén)Ml復(fù)制作為圖7中的陰性對(duì)照門(mén)，并按照②中得到的熒光標(biāo)記酵母的平均熒光強(qiáng)度2603. 31設(shè)為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，按照標(biāo)準(zhǔn)單 位的倍數(shù)進(jìn)行設(shè)門(mén)，從門(mén)Ml的右端至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位的位置為M2，在2倍、3倍、4倍標(biāo)準(zhǔn)單位 處設(shè)門(mén)依次分別為M3、M4、M5，如圖7所示。其中M1代表Ml門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞數(shù)，即陰 性腹腔吞噬細(xì)胞群體，為沒(méi)有吞噬啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞總數(shù)；M2代表M2門(mén)內(nèi)的腹 腔吞噬細(xì)胞總數(shù)，即吞噬1個(gè)酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；M3、M4、M5分別代表吞噬1個(gè)、 2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)熒光酵母的吞噬細(xì)胞。利用BD CellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)獲取的數(shù)據(jù) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別得到M2、M3、M4、M5門(mén)內(nèi)和總的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)以及Ml門(mén)內(nèi)吞噬細(xì)胞占 總吞噬細(xì)胞的百分率。其中Ml門(mén)內(nèi)細(xì)胞占總吞噬細(xì)胞的百分率為81. 64;總腹腔吞噬細(xì)胞 個(gè)數(shù)為7935 ;M2、M3、M4、M5門(mén)內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為665、246、236、333個(gè)。 (8)計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)吞噬率(％ )=吞噬啤酒酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)=I-Ml門(mén) 內(nèi)腹腔吞噬細(xì)胞占總腹腔吞噬細(xì)胞的百分率=1-81.64%= 18. 36%吞噬指數(shù)=被吞噬的酵母細(xì)胞總數(shù)/吞噬細(xì)胞總數(shù)=/ 吞噬細(xì)胞總數(shù)=(665+246X2+236X3+333X4)/7935 =
0. 26本發(fā)明的方法用流式細(xì)胞儀所獲取的細(xì)胞數(shù)據(jù)和吞噬細(xì)胞易貼壁的生物學(xué)特性， 以及FITC標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞接近100%的熒光標(biāo)記率，消除了沒(méi)有吞噬的熒光啤酒酵母細(xì) 胞對(duì)分析結(jié)果的影響。該方法能夠降低流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞吞噬活性的誤差，針 對(duì)以往所建立的檢測(cè)方法中不能夠準(zhǔn)確的測(cè)定吞噬個(gè)數(shù)的缺陷，本發(fā)明根據(jù)吞噬細(xì)胞吞噬 酵母細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度來(lái)對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記啤酒酵母的個(gè)數(shù)進(jìn)行定量分析，利用本 發(fā)明中的公式通過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)計(jì)算，較為準(zhǔn)確的測(cè)定了吞噬率和吞噬指數(shù)，提供了一種重 復(fù)性好，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性的方法。
權(quán)利要求
一種利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法，其特征在于，包括下述步驟(1)制備啤酒酵母細(xì)胞凍干粉利用土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)啤酒酵母細(xì)胞，并將獲得的啤酒酵母細(xì)胞溶液通過(guò)冷凍干燥制成啤酒酵母細(xì)胞凍干粉；(2)利用FITC標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞將FITC與二甲亞砜按照1mg∶200μl的比例溶解，然后與pH值為9.5、濃度為0.5M的碳酸緩沖液混合配制成濃度為0.1mg/ml的FITC溶液備用；將步驟(1)中得到的啤酒酵母細(xì)胞凍干粉與pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液按20mg∶1ml的比例混勻后，80℃滅活15min；滅活后離心，棄上清液取沉淀；將得到的沉淀物與上述備用的0.1mg/ml的FITC溶液混勻，室溫避光孵育1h對(duì)啤酒酵母細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，其中，0.1mg/ml的FITC溶液的用量為與步驟(1)中得到的啤酒酵母凍干粉的比例為1ml∶20mg；將上述熒光標(biāo)記后的溶液用pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液離心洗滌，直至上清液無(wú)色透亮；離心，棄上清液取沉淀得到熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞；檢測(cè)熒光標(biāo)記率，調(diào)整最終熒光標(biāo)記率合格的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液，其熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞濃度為2×109個(gè)/ml于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?3)將步驟(2)中得到的備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與小鼠血清按照體積比為1∶1的比例室溫孵育60min，用pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液調(diào)整熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/ml；(4)將吞噬細(xì)胞的個(gè)數(shù)至少為1×106個(gè)/ml的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)板的一個(gè)孔中作為陰性對(duì)照；將步驟(3)中得到的與小鼠血清孵育后的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與同樣的上述吞噬細(xì)胞的個(gè)數(shù)至少為1×106個(gè)/ml的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中其余的孔中，按照吞噬細(xì)胞和熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)比為1∶20的比例混合；然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中貼壁孵育40min，用4℃pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液沖洗除去細(xì)胞培養(yǎng)板中多余的啤酒酵母細(xì)胞和沒(méi)有貼壁的腹腔吞噬細(xì)胞，最后，在培養(yǎng)板除陰性對(duì)照孔外的各孔中加入4℃的0.5mlpH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液混勻，獲得吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液，用移液槍將其轉(zhuǎn)移至流式管中，將流式管置于冰上，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；(5)利用流式細(xì)胞儀對(duì)步驟(2)中備用的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞懸液和步驟(4)中得到的吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲取數(shù)據(jù)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析①取步驟(4)中沒(méi)有加熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照進(jìn)行上樣，通過(guò)調(diào)整FL1熒光通道電壓，使腹腔吞噬細(xì)胞群體峰的位置位于熒光電壓橫軸左側(cè)，并對(duì)腹腔吞噬細(xì)胞進(jìn)行獲?。虎谠诹魇郊?xì)胞儀各熒光電壓參數(shù)和閾值保持不變的情況下，利用流式細(xì)胞儀測(cè)得步驟(2)中備用的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，并以此熒光強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)；③取步驟(4)中獲得的吞噬熒光啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞懸液進(jìn)行上樣，在流式細(xì)胞儀各參數(shù)保持不變的情況下，利用流式細(xì)胞儀對(duì)流式管中的腹腔吞噬細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞獲??；④利用BD CellQuest Pro數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)獲取的腹腔吞噬細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先畫(huà)散點(diǎn)圖，通過(guò)前向光和側(cè)向光，圈住腹腔吞噬細(xì)胞群體區(qū)域，然后畫(huà)柱狀圖對(duì)陰性區(qū)域設(shè)門(mén)M1；將步驟②的熒光標(biāo)記的啤酒酵母細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度設(shè)為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，對(duì)步驟③得到的細(xì)胞獲取結(jié)果按照標(biāo)準(zhǔn)單位的倍數(shù)進(jìn)行設(shè)門(mén)，從門(mén)M1的右端至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位的位置為M2，在2倍、3倍......、n-1倍標(biāo)準(zhǔn)單位處設(shè)門(mén)依次分別為M3、M4......Mn，其中M1代表M1門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞數(shù)，即陰性腹腔吞噬細(xì)胞群體，為沒(méi)有吞噬啤酒酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞總數(shù)；M2代表M2門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞總數(shù)，即吞噬1個(gè)酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；Mn代表Mn門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)，即吞噬n-1個(gè)酵母細(xì)胞的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)；根據(jù)設(shè)門(mén)的個(gè)數(shù)來(lái)確定n的值，對(duì)門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析，分別得到M1、M2、M3......Mn門(mén)內(nèi)的腹腔吞噬細(xì)胞個(gè)數(shù)和M1門(mén)內(nèi)腹腔吞噬細(xì)胞占總吞噬細(xì)胞的百分率，按照下列兩個(gè)公式分別計(jì)算吞噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)吞噬率(％)＝吞噬啤酒酵母細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)＝1-M1門(mén)內(nèi)吞噬細(xì)胞占總吞噬細(xì)胞的百分率；吞噬指數(shù)＝被吞噬的酵母細(xì)胞總數(shù)/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)＝[M2+2M3+3M4+......+(n-1)Mn]/獲取的吞噬細(xì)胞總數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法，其特征在 于，利用土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)啤酒酵母細(xì)胞的方法為將啤酒酵母菌種接種在斜面土豆培養(yǎng) 基進(jìn)行活化，向斜面土豆培養(yǎng)基里面加入無(wú)菌水，用接種環(huán)輕刮，使斜面土豆培養(yǎng)基表面 的啤酒酵母懸于無(wú)菌水中，將啤酒酵母懸液置于渦旋混勻器上混勻，得到啤酒酵母菌懸 液；吸取0. 5ml啤酒酵母菌懸液加入平板土豆培養(yǎng)基，涂布后，置于28°C的培養(yǎng)箱中，3天 后，向每個(gè)土豆平板培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，用玻璃棒刮取并收集啤酒酵母細(xì)胞，用PBS緩 沖液8000rpmX Imin離心洗滌兩次之后，500rpmX Imin離心，棄去沉淀，取上層細(xì)胞懸液 SOOOrpmX Imin離心一次，棄去上清，獲取沉淀，即為啤酒酵母細(xì)胞；將獲得的啤酒酵母細(xì) 胞懸液放入-20°C的冰箱中冷凍后，置入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥制成啤酒酵母凍干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法，其特征在 于，所述土豆培養(yǎng)基的成分按以下質(zhì)量比例進(jìn)行配置去皮土豆葡萄糖瓊脂水= 50 5 4 200。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔吞噬細(xì)胞活性的方法，旨在提供一種能夠消除未吞噬熒光酵母細(xì)胞對(duì)分析結(jié)果的影響，對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬酵母的個(gè)數(shù)進(jìn)行定量分析，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)吞噬細(xì)胞活性的方法。包括下述步驟制備啤酒酵母細(xì)胞凍干粉；利用FITC標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞；將熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與小鼠血清室溫孵育；將腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)板的一個(gè)孔中；將與小鼠血清孵育后的熒光標(biāo)記啤酒酵母細(xì)胞的懸液與同樣的腹腔吞噬細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中其余的孔中，將細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁孵育；利用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本發(fā)明方法較為準(zhǔn)確的測(cè)定了吞噬率和吞噬指數(shù)，重復(fù)性好。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101846626SQ201010180339
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者李偉, 閻亞麗, 陳慶森 申請(qǐng)人:天津商業(yè)大學(xué)