1.一種高精度指導(dǎo)華法林用量的檢測試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括含VKORC1(1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)試劑、RFLP試劑;
所述VKORC1(1639G/A)的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’
R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’;
所述CYP4F2(V433M)的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’
R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’;
所述GGCX rs11676382的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’
R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’;
所述CYP2C9*2的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’
R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’;
所述CYP2C9*3的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’
R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’;
所述CYP2C9*5的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’
R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’;
所述CYP2C9*6的擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’
R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述PCR反應(yīng)試劑包括高保真taq酶、Mg2+、緩沖液、ddH2O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述RFLP試劑包括限制性內(nèi)切酶、緩沖液、ddH2O。
4.一種利用如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測試劑盒的檢測方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
(1)采集外周血2ml,EDTA抗凝,采用SnoMagTM Blood DNA Extraction Kit提取基因組DNA;
(2)利用所述擴(kuò)增引物,對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)體系為20ul:基因組DNA 1ul,2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul,引物(F/R 10uMol)0.5ul,雙蒸水8.5ul;PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃30s,60℃30s,72℃1min,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸5min,12℃Hold 0min;
(3)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察與分析,判斷擴(kuò)增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰:分別取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中,最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標(biāo),瓊脂糖凝膠以綠如藍(lán)核酸染料為染色劑,100V穩(wěn)壓電泳40分鐘,在凝膠成像儀中觀察帶型;達(dá)到要求則進(jìn)行下一步,否則重復(fù)步驟(2);
(4)以限制性內(nèi)切酶Mspl、Pvull、Hindlll、Avall、Kpnl、Alul、Mnll分別對VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化,體系總共10ul:PCR產(chǎn)物5ul,限制性內(nèi)切酶0.5ul,酶對應(yīng)的緩沖液1ul,ddH2O 3.5ul;37℃恒溫2小時(shí);
(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行觀察與分析,判斷擴(kuò)增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰:分別取10ul酶切產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中,最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標(biāo),瓊脂糖凝膠以綠如藍(lán)核酸染料為染色劑,100V穩(wěn)壓電泳40分鐘,在凝膠成像儀中觀察帶型;
(6)將所得的VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年齡、體重代入以下計(jì)算公式得出華法林最佳服用量:
=exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484AG+0.554×VKORC1 6484 AA-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3)
式中BSA(m2)=0.0061×height(cm)+0.0128×weight(kg)-0.1529:age單位為years;VKORC1-6484 AG VKORC1-6484AA CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3是計(jì)為1,否則計(jì)為0。Exp表示自然對數(shù)(e)的指數(shù)。