本發(fā)明涉及一種檢測結直腸癌miRNA表達水平的引物探針組和檢測產品，屬于生物
技術領域：
。
背景技術：
：microRNA是一類內源性、高度保守的非編碼小分子RNA，由單鏈RNA前體分子加工形成，長度一般為18～23bp，合成時首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄成原始miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ家族的Drosha酶切割形成miRNA前體，再經核糖核酸酶Ⅲ家族的Dicer酶加工最終形成成熟的miRNA。人體內存在大量miRNAs，這些成熟的miRNA能夠與RNA誘導沉默復合物結合，并與與其靶標基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結合，調控轉錄后的翻譯過程，從而調控對應靶蛋白的表達，組成了一系列的RNA調控網絡，在腫瘤發(fā)生起著重要的作用。有些miRNA在腫瘤中上調，起類似癌基因作用，有些miRNA在腫瘤中下調，起抑癌基因的作用，對細胞的功能發(fā)生較大的影響。一種miRNA可以調控多個靶基因，一個把標基因也可以被多種miRNAs調控，通過調節(jié)靶基因蛋白表達影響細胞的增值、分化、凋亡、侵襲等過程，多項研究表明miRNA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達失調。由于miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，以miRNA表達水平預測化療和放療療效的研究也逐步展開。多項研究已經證實了臨床上檢測結直腸癌患者血液中miRNA表達譜的變化可用于對結直腸癌患者的預后監(jiān)測。關于miRNA作為結直腸癌生物標志物的相關研究已成為了研究的焦點，也取得了一定的研究成果，結直腸癌患者血液中特征性miRNA有可能作為結直腸癌篩查、早期診斷、預測監(jiān)測及化療療效判斷的生物標志物，目前研究結果顯示可以作為結直腸癌預后判斷的標志物有miR-200b、miR-21、miR-29a、miR-92、miR-200c、miR-141、miR-429、miR-221、miR-19等，這些穩(wěn)定存在血清/血漿中miRNA的差異表達可用于指導結直腸癌的個體化治療。循環(huán)miRNA檢測方法與組織內miRNA檢測方法相近。目前不同實驗室采用檢測方法主要有：NorthernBlot法、高通量測序法、miRNA芯片和熒光實時定量PCR(qRT-PCR)法。測序技術結果最為可靠，有利于發(fā)現新的miRNA，但是測序方法價格較高。miRNA芯片雖然價格相對較低，但其重復性和準確性較差，只用于已知疾病相關miRNAs初篩。NorthernBlot方法繁雜并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測。技術實現要素：本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種可以快速、便捷、準確地檢測結直腸癌患者miRNA表達水平的結直腸癌預后檢測引物探針及其試劑盒。本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種結直腸癌預后檢測引物探針，包括用于逆轉錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉錄引物a，用于逆轉錄hsa-mir-145的莖環(huán)逆轉錄引物b，用于逆轉錄hsa-miR-19a的莖環(huán)逆轉錄引物c，用于逆轉錄hsa-miR-191的莖環(huán)逆轉錄引物d，用于檢測hsa-mir-20a的上游引物a和探針a，用于檢測hsa-mir-145的上游引物b和探針b，用于檢測hsa-miR-19a的上游引物c和探針c，用于檢測hsa-miR-191的上游引物d和探針d，以及用于檢測hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a和hsa-miR-191的通用下游引物；所述hsa-mir-20a、hsa-mir-145和hsa-miR-19a是標志物，所述hsa-miR-191是內參；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述莖環(huán)逆轉錄引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探針a和探針b的5’端設有一種熒光報告基團，所述探針c和探針d的5’端設有另一種熒光報告基團，所述探針a、探針b、探針c、和探針d的3’端設有淬滅熒光基團；所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為2μM/L～4μM/L；所述探針a在反應體系中的終濃度為0.16μM/L～0.5μM/L，所述探針b在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～0.15μM/L，所述探針c在反應體系中的終濃度為0.18μM/L～0.5μM/L，所述探針d在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～0.17μM/L。上述探針a在反應體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針b在反應體系中的終濃度為0.14μM/L，所述探針c在反應體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針d在反應體系中的終濃度為0.17μM/L。上述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.8μM/L，所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為3μM/L。上述各莖環(huán)逆轉錄引物在逆轉錄體系中的終濃度是50nM/L。上述探針a和探針b的5’端的熒光報告基團是FAM，所述探針c和探針d的5’端的熒光報告基團是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種采用上述引物探針的結直腸癌預后檢測產品。本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種結直腸癌預后檢測試劑盒，包括用于配制數字PCR反應液的數字PCR預混液、液滴穩(wěn)定劑和miRNAs引物探針混合液，以及用于進行RNA逆轉錄的莖環(huán)逆轉錄引物混合液；所述miRNAs引物探針混合液中包括用于檢測hsa-mir-20a的上游引物a和探針a，用于檢測hsa-mir-145的上游引物b和探針b，用于檢測hsa-miR-19a的上游引物c和探針c，用于檢測hsa-miR-191的上游引物d和探針d，以及用于檢測hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a和hsa-miR-191的通用下游引物；所述莖環(huán)逆轉錄引物混合液中包括用于逆轉錄hsa-mir-20a的莖環(huán)逆轉錄引物a，用于逆轉錄hsa-mir-145的莖環(huán)逆轉錄引物b，用于逆轉錄hsa-miR-19a的莖環(huán)逆轉錄引物c，用于逆轉錄hsa-miR-191的莖環(huán)逆轉錄引物d；所述hsa-mir-20a、hsa-mir-145和hsa-miR-19a是標志物，所述hsa-miR-191是內參；所述上游引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述上游引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述上游引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述上游引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述莖環(huán)逆轉錄引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物c的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述莖環(huán)逆轉錄引物d的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；所述探針a和探針b的5’端設有一種熒光報告基團，所述探針c和探針d的5’端設有另一種熒光報告基團，所述探針a、探針b、探針c、和探針d的3’端設有淬滅熒光基團；所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為2μM/L～4μM/L；所述探針a在反應體系中的終濃度為0.16μM/L～0.5μM/L，所述探針b在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～0.15μM/L，所述探針c在反應體系中的終濃度為0.18μM/L～0.5μM/L，所述探針d在反應體系中的終濃度為0.1μM/L～0.17μM/L。上述探針a在反應體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針b在反應體系中的終濃度為0.14μM/L，所述探針c在反應體系中的終濃度為0.2μM/L，所述探針d在反應體系中的終濃度為0.17μM/L；所述各上游引物在反應體系中的終濃度為0.8μM/L，所述通用下游引物在反應體系中的終濃度為3μM/L；所述各莖環(huán)逆轉錄引物在逆轉錄體系中的終濃度是50nM/L；所述探針a和探針b的5’端的熒光報告基團是FAM，所述探針c和探針d的5’端的熒光報告基團是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。上述數字PCR預混液中包括DNA聚合酶、超純水、dNTPs混合液、參比熒光ROX和緩沖液；所述液滴穩(wěn)定劑中包括礦物油。上述結直腸癌預后檢測試劑盒反應時，反應體系中包括數字PCR預混液10體積，miRNAs引物探針混合液2體積，液滴穩(wěn)定劑2體積，cDNA模板1體積，滅菌超純水5體積。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明的結直腸癌預后檢測試劑盒采用多重探針數字PCR技術，基于Taqman探針原理，對引物探針進行了優(yōu)化設計，針對多個miRNA分別使用不同的熒光素標記的探針，檢測時帶不同熒光的液滴將被相應識別出來，分別被計數。在保證熒光信號強度與探針濃度成正比的前提下，調整熒光素的濃度以及調整兩種熒光素混合的配比，可以一次同時檢測4個miRNA的表達水平。本發(fā)明解決樣本中miRNA含量低、樣本量少的問題，具有更好的組內穩(wěn)定性，能夠更好地用于疾病的無創(chuàng)檢測。(2)本發(fā)明的結直腸癌預后檢測試劑盒與一般的定量相比，不用設置陽性對照，也不需要設置標準品，一般的檢測技術是定性檢測，本發(fā)明的技術可以達到真正意義上的絕對定量，檢測出低至1個拷貝數模板量，克服了qPCR不具有精確定量的缺點。本發(fā)明對血清中miRNA進行定量檢測，不依賴于擴增曲線的閾值(CT值)進行定量，不依靠標準曲線達到絕對定量的目的，有很好的準確度和重現性，不受擴增效率的影響。(3)本發(fā)明的結直腸癌預后檢測試劑盒對樣本溶液采用微滴化處理，減少背景干擾，根據熒光類型、熒光微滴個數結果，能夠直接判讀拷貝數，操作簡化，降低檢測成本，以前的檢測技術方法的靈敏度一般在1％～50％之間，而本發(fā)明的實驗方法的靈敏度可以達到0.1％，檢測樣本中miRNA的絕對量和比例。附圖說明圖1為用本發(fā)明的試劑盒對結直腸癌患者血漿樣本進行檢測的結果圖。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本
發(fā)明內容對本發(fā)明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。一、試劑盒的組成。本實施例的結直腸癌預后檢測試劑盒，包括數字PCR預混液、液滴穩(wěn)定劑、miRNAs引物探針混合液和莖環(huán)逆轉錄引物混合液。試劑盒各成分如表1所示。表1試劑盒成分表試劑盒成分分裝試劑公司數字PCR預混液1管Lifetechnologies液滴穩(wěn)定劑1管RaindancetechnologiesmiRNAs引物探針混合液1管百力格莖環(huán)逆轉錄引物混合液1管百力格上述表1中試劑盒各組分的說明如下：1)數字PCR預混液的主要成分包括DNA聚合酶、超純水、dNTPs混合液、參比熒光ROX、緩沖液等(由Lifetechnologies公司提供，貨號：1508099)。2)液滴穩(wěn)定劑的主要成分是礦物油，(由Raindancetechnologies公司提供，貨號：30-00826)，主要作用是微滴化處理過程將反應體系形成油包水小液滴。3)miRNAs引物探針混合液中檢測的miRNA分別是hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a以及內參hsa-miR-191。miRNAs引物探針混合液包括hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a、hsa-miR-191各自的上游引物，hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a、hsa-miR-191各自的探針，以及hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a、hsa-miR-191共用的通用下游引物。hsa-mir-20a、hsa-mir-145和hsa-miR-19a是標志物，hsa-miR-191是內參。本發(fā)明選擇的內參是經過樣本驗證的在結直腸癌和健康對照組中表達量無顯著性差異，并且在結直腸癌的不同分期患者中表達量也無顯著性差異。4)莖環(huán)逆轉錄引物混合液包括hsa-mir-20a、hsa-mir-145、hsa-miR-19a和hsa-miR-191各自的莖環(huán)逆轉錄引物。本發(fā)明中的所有引物和探針都是基于miRNA在miRBase數據庫的序列信息，如表2所示。表2miRNA信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-20aMIMAT0000076uagcuuaucagacugauguugahsa-mir-145MIMAT0000086uagcaccaucugaaaucgguuahsa-miR-19aMIMAT0000092uauugcacuugucccggccuguhsa-miR-191MIMAT0000440caacggaaucccaaaagcagcug為設計引物方便，把在數據庫中檢索的到的miRNA序列中的U替換成T，替換后的結果如表3所示。表3miRNA堿基替換后序列信息表GeneAccessionSequence(5’——3’)hsa-mir-20aMIMAT0000076tagcttatcagactgatgttgahsa-mir-145MIMAT0000086tagcaccatctgaaatcggttahsa-miR-19aMIMAT0000092tattgcacttgtcccggcctgthsa-miR-191MIMAT0000440caacggaatcccaaaagcagctg通用下游引物是以逆轉錄引物為模板設計的GC含量、二聚體情況等達到最佳的一段序列。上游引物是與通用下游引物配對的相關參數達到最佳的一段序列。莖環(huán)逆轉錄引物序列是將miRNA的3’端后4至6位堿基反向互補序列添加到經典頸環(huán)結構的3’端形成的序列，主要用于抽提RNA后的miRNA逆轉錄。選擇基于莖環(huán)引物的miRNA定量，莖環(huán)法具有特異性強，靈敏度高、miRNA前體的背景干擾小、線性范圍廣、效率高等優(yōu)點。莖環(huán)逆轉錄引物由一段與miRNA特異性互補序列和一段較長的通用莖環(huán)引序列組成，通用莖環(huán)引序列的核苷酸序列為：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac。miRNAs引物探針混合液中的上游引物、探針、通用下游引物，以及莖環(huán)逆轉錄引物混合液中的莖環(huán)逆轉錄引物的核苷酸序列如表4所示。表4引物和探針序列表探針兩端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團。探針的5’端標記的熒光報告基團是FAM或VIC，探針的3’端標記的淬滅基團是BHQ1。本實施例中hsa-mir-20a和hsa-mir-145的探針的5’端標記的是FAM，hsa-miR-19a和hsa-miR-191的探針的5’端標記的是VIC。探針引物干粉由百力格生物技術有限公司合成，母液由干粉加入滅菌超純水稀釋而成，引物和探針混合液均由母液加入滅菌超純水稀釋而成，包括上游引物、探針、通用下游引物，由于多重PCR可能產生引物間的抑制作用和擴增效率的不穩(wěn)定性，不同的引物探針使用濃度存在差異，本發(fā)明優(yōu)化實驗條件使引物探針使用濃度組合效果最佳，上游引物的使用濃度各為1μM/L～15μM/L，最終反應體系中的濃度為0.1μM/L～1.5μM/L，優(yōu)選地，上游引物在最終反應體系中的濃度為0.8μM/L；通用下游引物使用濃度為20μM/L～40μM/L，最終反應體系中的濃度為2μM/L～4μM/L，優(yōu)選地，通用下游引物在最終反應體系中的濃度為3μM/L；各探針使用濃度為1μM/L～5μM/L，最終反應體系中探針的濃度為0.1μM/L～0.5μM/L，優(yōu)選地，hsa-mir-20a探針在最終反應體系中的濃度為0.2μM/L、hsa-mir-145探針在最終反應體系中的濃度為0.14μM/L、hsa-miR-19a探針在最終反應體系中的濃度為0.2μM/L、hsa-miR-191探針在最終反應體系中的濃度為0.17μM/L。莖環(huán)逆轉錄引物在逆轉錄體系中的終濃度50nM/L。二、試劑盒的使用方法。本實施例的結直腸癌預后檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：1、RNA提取用抗凝管采集待測結直腸癌患者樣本和健康對照樣本，用德國Qiagen公司提供的血清總RNA提取試劑盒(貨號：51504)，按照試劑盒操作說明書抽提血清中的RNA。通過Thermo-Fisher公司3.0核酸蛋白熒光定量儀，測定樣本RNA濃度和純度，抽提的RNA最終加入逆轉錄反應體系中。2、RNA逆轉錄采用美國Invitrogen公司生產的逆轉錄試劑盒(貨號：18080085)，根據試劑盒說明書配置逆轉錄體系，取步驟1中抽提的RNA和莖環(huán)逆轉錄引物混合液，進行miRNA逆轉錄，獲得cDNA模板，將逆轉錄后的cDNA產物用滅菌超純水稀釋50倍，稀釋后的cDNA模板作為數字PCR反應的模板，放置4℃冰箱待用。3、數字PCR反應液制備根據表5中的PCR反應體系，取試劑盒中20μl的數字PCR預混液混合、4μl的miRNAs引物探針混合液，加入2ul的逆轉錄稀釋后的cDNA、4μl的液滴穩(wěn)定劑，加入滅菌超純水補至40μl，制得數字PCR反應液。表5PCR反應體系表反應成分加入濃度加入體積數字PCR預混液2×20ulmiRNAs引物探針混合液---4ul液滴穩(wěn)定劑10×4ulcDNA模板---2ulddH2O---to40ul4、PCR反應微滴制備將微滴發(fā)生板放入8通道微滴生成器中，用Raindance公司生產的微滴生成器RainDropSource對樣本進行微滴化處理，將數字PCR混合液制作成PCR微反應液滴，形成500～800萬個油包水液滴。本實驗的反應體系通過微滴發(fā)生器形成上百萬個皮升級大小的油包水小液滴后再進行PCR反應，每個微滴中會含有1個或者不含目的基因的模板。5、PCR擴增采用博日公司的PCR擴增儀對生成的微滴進行PCR擴增，擴增的反應程序如表6所示。表6PCR反應程序表優(yōu)選地，數字PCR擴增的條件為：預變性階段的條件95℃，10min；循環(huán)1，40個循環(huán)，條件為95℃15s，60℃45s；循環(huán)2條件為98℃10min；循環(huán)3條件為12℃30min。6、微滴檢測PCR反應結束后，將8聯管置于微滴分析儀中，用Raindance公司生產的微滴分析儀RainDropSense對每個微滴逐個檢測，含有熒光信號的微滴標記為1，不含熒光信號標記為0，再對微滴計數，軟件自動分析，通過泊松分布公式計算miRNA的拷貝數(液滴數)。泊松分布公式如下：7、實驗結果判定FAM信號通道檢測結果分別是hsa-mir-20a和hsa-mir-145的拷貝數，VIC信號通道檢測結果分別是hsa-miR-19a和內參hsa-miR-191的拷貝數。待測樣本miRNA表達判斷：若(待測樣本標志物miRNA拷貝數-待測樣本內參miRNA拷貝數)>(健康對照樣本miRNA拷貝數-健康對照樣本內參miRNA拷貝數)，則待測樣本的miRNA表達上調。若(待測樣本標志物miRNA拷貝數-待測樣本內參miRNA拷貝數)<(健康對照樣本miRNA拷貝數-健康對照樣本內參miRNA拷貝數)，則待測樣本的miRNA表達下調。三、應用例采用本實施例的結直腸癌預后檢測試劑盒檢測結直腸癌患者的血漿樣本，通過用Raindance公司的微滴分析儀RainDropSense對每個微滴逐個檢測，對微滴計數，軟件自動分析，通過泊松分布公式計算miRNA的絕對拷貝數。得到的檢測結果圖如圖1所示，hsa-mir-20a圈中是hsa-mir-20a目的片段的液滴數，hsa-mir-145圈中是hsa-mir-145目的片段的液滴數，hsa-miR-19a圈中是hsa-miR-19a目的片段的液滴數，hsa-miR-191圈中是hsa-miR-191目的片段的液滴數。emptydroplets圈中是不包括以上四個目的片段的液滴數，可以明顯看到miRNA目的片段的區(qū)域界線清晰，僅通過一次反應即可統計出結直腸癌患者的血漿樣本的miRNA拷貝數，再與健康對照樣本miRNA拷貝數比較，準確的判斷樣本的miRNA表達水平，有助于結直腸癌患者預后判斷。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。SEQUENCELISTING<110>上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司<120>結直腸癌預后檢測引物探針及其試劑盒<130>無<160>13<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>1gcgtagcttatcagactg18<210>2<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>2tagcaccatctgaaatc17<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3aatattgcacttgtccc17<210>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>4aacggaatcccaaaagca18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gtcgtatccagtgcgaac18<210>6<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>6ctgatgttgagtcgtatccag21<210>7<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>7cactggatacgactaacc18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>8cctgtgtcgtatccagtgc19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>9cagctggtcgtatccagtgc20<210>10<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>10gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcaaca50<210>11<211>52<212>DNA<213>人工合成<400>11gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactaaccgat52<210>12<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>12gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacaggc50<210>13<211>52<212>DNA<213>人工合成<400>13gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccagctgct52當前第1頁1 2 3