本發(fā)明涉及一種羊新疆巴貝斯蟲未定種的診斷試劑盒及檢測方法，具體而言，是涉及一種使用Nested-PCR檢測羊新疆巴貝斯蟲未定種的診斷試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

羊巴貝斯蟲病是由羊巴貝斯蟲(Babesia spp.)引起綿羊和山羊的一種蜱傳性血液原蟲病，寄生于綿羊或山羊紅細(xì)胞內(nèi)^[1]。已報道的感染羊的巴貝斯蟲種有綿羊巴貝斯蟲(Babesia ovis)，莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)和粗糙巴貝斯蟲(B.crassa)，該病是主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的血液原蟲病。臨床反應(yīng)通常以高熱，溶血性貧血，黃疸，血紅蛋白尿為主要特征，嚴(yán)重時引起死亡。本病危害嚴(yán)重，嚴(yán)重時可引起死亡，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。在中國鑒定了感染綿羊和山羊的若干個巴貝斯蟲分離株，根據(jù)18S rRNA和ITS序列分析，分為兩個系統(tǒng)進(jìn)化組：莫氏巴貝斯蟲和新疆巴貝斯蟲未定種。羊新疆巴貝斯蟲未定種是最近發(fā)現(xiàn)的新種，該蟲體的傳播媒介均為小亞璃眼蜱。為我國特有病原。目前該蟲種已在中國廣泛分布流行，直接威脅著我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。所以，制定有效的檢測預(yù)報系統(tǒng)對該病的防治十分迫切和必要。

對巴貝斯蟲的診斷，傳統(tǒng)的方法建立在血涂片的形態(tài)學(xué)檢查和臨床癥狀，這些方法對于檢測急性病例是很可靠的，但是對于慢性的病例具有局限性。一些血清學(xué)檢測方法也常用于巴貝斯蟲的診斷，如IFAT和ELISA，但這些方法通常對相近的蟲種產(chǎn)生交叉反應(yīng)。與這些方法相反的，以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷方法具有，直接、特異性、敏感性較好等特點。目前在我國，常用的分子診斷方法，如LAMP、RLB等已用于鑒定羊巴貝斯蟲的感染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用于檢測羊新疆巴貝斯蟲的DNA的檢測試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明用于檢測羊新疆巴貝斯蟲的DNA，基于rap-1為靶基因，該基因?qū)儆诙嗷蚣易澹谛陆拓愃瓜x基因組上，已發(fā)現(xiàn)7個基因拷貝，本發(fā)明的引物設(shè)計在7個拷貝的保守區(qū)，確保了7個拷貝都可被PCR擴增獲得，從而大大提高了檢測限。

本發(fā)明用于檢測羊新疆巴貝斯蟲的DNA的檢測試劑盒及檢測方法的制備方法是在新疆巴貝斯蟲的rap-1基因的保守區(qū)分別人工設(shè)計合成雙向套氏特異性引物4個，進(jìn)行套氏PCR擴增，根據(jù)目的片段的大小，通過核酸電泳檢測結(jié)果。

本發(fā)明的檢測試劑盒檢測羊新疆巴貝斯蟲的方法是以待檢測羊血提取的DNA為模板，在羊新疆巴貝斯蟲rap-1基因序列的保守區(qū)域設(shè)計一對擴增出的片段大小為1400bp的引物，獲得的PCR產(chǎn)物，100倍稀釋后，再利用在rap-1基因保守區(qū)設(shè)計的內(nèi)部引物再進(jìn)行PCR擴增，獲得片段大小為506bp的PCR產(chǎn)物，將第二輪獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳進(jìn)行結(jié)果檢測。

具體而言，根據(jù)本發(fā)明提供了

1.一種檢測羊新疆巴貝斯蟲未定種的診斷試劑盒，其特征在于，含有兩組Nested-PCT引物，第1組引物

XJ-fullF:5'-CGGTAGTGTGTTGATATCCTAGAG-3'(SEQ ID NO.1),

XJ-fullR:5'-CACAAGCGT TACATCGTAGAGCCG-3'(SEQ ID NO.2)；

以及第2組引物

XJ-internalF:5'-

AATGACCGCCCGCGAAATCAGCCACGAC-3'(SEQ ID NO.3)，

XJ-internalR:5'-GTGGGTGGCGAAGGACAATTTGTTG-3'，(SEQ ID NO.4)

2.如上述1所述的診斷試劑盒，還包括：紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液、異丙醇、乙醇。

3.如上述1或2所述的診斷試劑盒，還包括：限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI。

4.一種檢測羊新疆巴貝斯蟲未定種的方法，包括如下步驟

(1)取待測羊血，制備待測DNA；

(2)以(1)制備的待測DNA為模板，利用引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，進(jìn)行第一輪PCR擴增；

(3)取(2)中得到的PCR產(chǎn)物1ul，并與99ul去離子水混勻，進(jìn)行第二輪PCR擴增，第二輪PCR擴增引物對為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

(4)取第二輪PCR擴增產(chǎn)物5ul，上膠電泳，并觀察電泳結(jié)果。

5.如上述4所述的方法，其中步驟(1)中取待測羊血后，分別加入紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液、異丙醇、乙醇等處理后，得到待測DNA樣品，在待測DNA樣品中，加入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行預(yù)處理。

6.如上述4或5所述的方法，所述限制性內(nèi)切酶是HindIII和NotI。

7.如上述4-6任一項所述的方法，所述限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時間為1-1.5小時。

8.如權(quán)利要求4至7任一項所述的方法，所述第一輪PCR擴增反應(yīng)的條件為

9.如權(quán)利要求4至8任一項所述的方法，所述第二輪PCR擴增反應(yīng)的條件為

本發(fā)明具有如下效果：

采用本發(fā)明的檢測試劑盒可以很方便地檢測羊新疆巴貝斯蟲的感染，同時由于本發(fā)明的檢測基因為多拷貝的基因，包含有7個拷貝，大大提高了檢測限。

本發(fā)明的方法最大優(yōu)點是可以通過特異，敏感的PCR擴增，快速的檢測到動物是否感染有羊新疆巴貝斯蟲。這對于疾病的控制及預(yù)防有重要的意義。本發(fā)明的敏感性要高于普通PCR，這一特性在流行病學(xué)調(diào)查上具有重要意義。

尤其是取待測羊血后，分別加入紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液、異丙醇、乙醇等處理后，得到待測DNA樣品，在待測DNA樣品中，加入限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI進(jìn)行預(yù)處理，使用這樣的DNA樣品作為模板，極大地提高了檢測的準(zhǔn)確率，減少了干擾。

采用本發(fā)明的檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法非常的簡單，而且檢測用時較少，其檢測成本相對也比較低，而且漏檢率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于現(xiàn)有技術(shù)。

附圖說明

圖1：限制性內(nèi)切酶處理和未處理的待測DNA作為模板的結(jié)果。

圖2：部分田間羊血液樣品檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1 特異性引物設(shè)計與合成：

根據(jù)已報道的羊巴貝斯蟲rap-1基因序列，經(jīng)過序列比對，在羊新疆巴貝斯蟲的保守區(qū)，且可與其他蟲種區(qū)分的區(qū)域設(shè)計針對該蟲種的特異性引物，并命名為：XJ-fullF，XJ-fullR，XJ-internalF和XJ-internalR，將合成的引物用去離子水溶解至儲存濃度100uM，尋找最佳濃度用于PCR擴增。具體的做法如下：引物由專業(yè)公司按設(shè)計要求合成，在保守區(qū)設(shè)計好后，將引物的序列發(fā)給專業(yè)公司，由他們合成，本發(fā)明是由蘭州生工公司合成引物。用去離子水稀釋羊新疆巴貝斯蟲的特異性引物待用。

實施例2檢測試劑盒的制備

1、羊新疆巴貝斯蟲裂殖子的制備

選試驗除脾羊4只，用液氮保存的含有呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、莫氏巴貝斯蟲和新疆巴貝斯蟲未定種的血液紅細(xì)胞頸靜脈接種，感染除脾羊。

在感染羊后，每天肌肉注射地塞米松，首次4支/羊，以后2支/羊，每天射一次，直至染蟲率升高為止。從感染之日起，每天早晨測量羊的體溫，從體溫開始上升之日起，每天從耳緣靜脈涂制血片，甲醇固定兩次，姬母薩染色后，用顯微鏡檢查紅細(xì)胞染蟲率。當(dāng)紅細(xì)胞染蟲率達(dá)到10.0％以上時，頸動脈放血，20.0％枸櫞酸鈉抗凝，得到待檢測的血樣。

蟲體DNA的分離與提純，本實施例使用的是QIAamp DNA Blood Kit(QIAGEN,美國)and QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,德國)。

(1)加300ul血液于盛有900ul紅細(xì)胞裂解液(RBC Cell Lysis Solution)的1.5ml的離心管中，室溫孵育10分鐘，孵育過程中顛倒離心管數(shù)次，直到液體澄清透明。

(2)13000rpm離心1分鐘，棄上清，保留下面的可見的沉淀和大約10～20μl液體，用渦旋儀渦旋20秒，使沉淀物懸浮。

(3)每管中加入300ul細(xì)胞裂解液(Cell Lysis Solution)，吹打混勻使所有細(xì)胞裂解。

(4)加入100ul蛋白沉淀液(Protein Precipitation Solution)到細(xì)胞裂解液中。

(5)渦旋20秒，至出現(xiàn)棕褐色沉淀顆粒。

(6)13000rpm離心5分鐘。

(7)將上清液移至新標(biāo)記的離心管中，加入300μl異丙醇，顛倒50次。

(8)13000rpm離心5分鐘。

(9)棄上清，在干凈的紙巾上倒置，將剩余的液體吸干。

(10)加入300μl 70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次以洗脫DNA小團(tuán)塊。

(11)13000rpm離心3分鐘，小心除去乙醇，在吸水紙上吸干剩余液體。

(12)用真空干燥儀進(jìn)行真空干燥。

(13)加入100μl DNA水解溶液(Hydration Solution)。

(14)4℃過夜或60℃溫育1小時，得到待測的DNA。

(15)-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、限制性內(nèi)切酶處理

雖然現(xiàn)有技術(shù)中還未確定新疆巴貝斯蟲未定種的全基因組序列，但是根據(jù)本發(fā)明人的創(chuàng)造性試驗，已經(jīng)測出了新疆巴貝斯蟲未定種的部分序列，并根據(jù)推測及不斷試驗，發(fā)現(xiàn)使用限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI進(jìn)行預(yù)處理后，使用處理過的DNA樣品，可以減少干擾。如圖1所示，第1、2泳道是未經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的DNA樣品，第3泳道是經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI進(jìn)行預(yù)處理后的DNA樣品，后續(xù)兩步PCR擴增條件完全一致。

限制性內(nèi)切酶處理可按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行處理，本實施例是按照1ug DNA分別加入1單位HindIII和NotI，37℃水浴1小時后，65℃10分鐘，停止反應(yīng)，停止反應(yīng)后的混合液稀釋至100ng/μl濃度作為下一步PCR反應(yīng)的模板。也可以使用EDTA處理停止反應(yīng)，為了減少雜質(zhì)的干擾，限制性內(nèi)切酶處理后還可以使用溴化乙錠重新處理，也可以使用任意市售試劑盒進(jìn)行處理。

圖1所示第1、2泳道是未經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理的DNA樣品，雖然出現(xiàn)了目的條帶，但是還有很多其它干擾條帶，而第3泳道的結(jié)果卻排除了干擾。雖然新疆巴貝斯蟲未定種的全基因組序列還未解析完畢，但是本發(fā)明人分析，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI處理后，恰好得到了本發(fā)明所拷貝的目的基因的片段，其有利于后續(xù)的PCR擴增。本實施例使用了MiniBEST126 DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa)對DNA片段進(jìn)行了處理。

3、PCR擴增

第一輪基因片段PCR擴增的反應(yīng)體系及程序：

所有的樣品混合后12000rpm離心10秒，置于PCR擴增儀中按照如下循環(huán)進(jìn)行擴增：

取PCR產(chǎn)物1ul與99ul去離子水混勻，將第一輪PCR進(jìn)行100倍稀釋后作為第二輪PCR擴增的模板。

第二輪基因片段PCR擴增的反應(yīng)體系及程序：

第2輪PCR反應(yīng)的循環(huán)條件與第1輪相同。

取第2輪反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物5ul在1.0％的瓊脂糖凝膠(含0.5％ug/ml溴化乙錠)，在75伏的電壓下進(jìn)行電泳分析，觀察擴增結(jié)果。

※注：本發(fā)明所用的緩沖液為200mM的Tris-HCl(pH 8.55)，160mM(NH₄)₂SO₄和20mMMgCl₂。

對于PCR反應(yīng)體系的確定，本發(fā)明人經(jīng)多次試驗后，發(fā)現(xiàn)引物的濃度對于最終檢測的結(jié)果起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)50μl的反應(yīng)溶液中，上下游引物的含量大于50pmol時，將會出現(xiàn)假陽性，當(dāng)控制好引物的濃度在50pmol以下時，對于致病原蟲的檢出正確率才達(dá)到最高。本實施例中所使用的酶均采購自TaKaRa，而分析純購自Promega以及Sigama。

5、檢測

結(jié)果判定：通過PCR擴增羊新疆巴貝斯蟲rap-1基因，并用感染羊的呂氏泰勒蟲，尤氏泰勒蟲和莫氏巴貝斯蟲提取的基因組DNA作為對照時，僅新疆巴貝斯蟲可擴增出特異性條帶。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)陽性試驗，對田間樣品進(jìn)行檢測，部分樣品的檢測結(jié)果參見圖2，圖中：1-2道分別為：羊基因組陰性對照和新疆巴貝斯蟲基因組陽性對照，3-48泳道分別是田間樣品編號。經(jīng)過對部分患病羊的檢測結(jié)果顯示：所有感染有羊新疆巴貝斯蟲的樣品均可看到特異性的條帶。

本發(fā)明表明，根據(jù)已報道的新疆巴貝斯蟲rap-1基因序列設(shè)計特異性引物用于建立了一種特異，敏感的套氏PCR診斷方法，可以特異性擴增羊新疆巴貝斯蟲；其敏感性明顯高于普通PCR方法。通過對978份采集的32個不同地區(qū)的來自15個省市自治區(qū)的田間樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該方法為羊新疆巴貝斯蟲病的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了工具。

采用本發(fā)明對部分野外放養(yǎng)羊采集的血樣檢測，其結(jié)果見表1

經(jīng)對采用本發(fā)明方法檢測為陽性的樣品進(jìn)行DNA序列測定，證明了其結(jié)果的正確性。另外，取樣地區(qū)的疫情與檢測結(jié)果是相關(guān)的，這進(jìn)一步證明了本發(fā)明的可靠性。

表1基于rap-1基因，套氏PCR方法對田間血液樣品的檢測結(jié)果