專利名稱：用于診斷和鑒別牛巴貝斯蟲種類的試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物寄生蟲的檢測鑒別技術(shù)，確切講本發(fā)明用于檢測被檢牛只是否感染牛巴貝斯蟲的檢測試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
巴貝斯蟲病(Babesiosis)又稱蜱傳熱，紅尿熱等，是由媒介蜱傳播的巴貝斯科巴貝斯屬的多種巴貝斯蟲寄生于牛、羊、馬、犬及其它野生動物紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱，臨床上多以發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿和死亡為主要特征，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展(McCosker PJ. The global importance of babesiosis. In :Ristic M and kreier J. P (editors), Babesiosis. New York :Academic Press，1981，ppl_24· ) 。 ￠^**^! 以蜱為傳播媒介，一旦傳入，要消滅它便極為困難，往往成為地方流行性疾病而長期存在， 因而傳染病控制水平較高的國家十分重視血液原蟲病的研究。鑒于本類疾病危害嚴(yán)重，國際獸醫(yī)局(OIE)國際委員會于1985年通過議案，建議各成員國加強(qiáng)蜱傳性血液原蟲病的協(xié)作研究，建立國際性防制措施，以減少經(jīng)濟(jì)損失。我國是世界上巴貝斯蟲病流行最嚴(yán)重的國家之一 (Yin H, Lu WS, Luo JX. Babesiosis in China. Tropical Animal Health and Production，1997,29 :11S-15S.)，目前已有十多個省(區(qū))報道有本病的存在，且潛伏的病原種類較為復(fù)雜，已知感染黃牛的主要病原有5種，S卩，牛巴貝斯蟲(Babesia bovis)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、卵形巴貝斯蟲(B. ovata)、大巴貝斯蟲(B. major)和牛巴貝斯蟲未定種(B.U.sp)。本病在我國分布廣泛、致病力強(qiáng)、危害嚴(yán)重。遺憾的是，截至目前，全球還沒有一個國家完全消滅和根治牛巴貝斯蟲病。由于不同的病原其傳播媒介也不同，故其病原的致病性也不一樣，其中牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲由牛蜱屬的微小牛蜱傳播；卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲則由血蜱屬的蜱傳播；而牛巴貝斯蟲未定種則由我國北方廣泛分布的璃眼蜱屬的蜱傳播。目前所公認(rèn)，牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的致病性最強(qiáng)，危害最為嚴(yán)重，且兩種病原常呈混合感染狀態(tài)，卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種的致病性較弱，該病對畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重影響人類健康。牛巴貝斯蟲病對養(yǎng)牛業(yè)則造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(McCOSker，1981)，由于巴貝斯蟲傳播的特性和血液原蟲疫苗研究的滯后性，對于巴貝斯蟲病的預(yù)防至今還沒有一種很好的實(shí)用方法，因此感染初期的診斷就顯得尤為重要。目前，牛巴貝斯蟲病的診斷主要有下列幾種手段(1)血液樣品的血涂片鏡檢技術(shù)，(2)血清學(xué)檢查，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，( 分子檢測技術(shù)，如常規(guī)PCR檢測技術(shù)、反向線性斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RBL)以及PCR-— ELISA等。但是這些方法都具有同一個不可避免的缺點(diǎn)——需要先進(jìn)的儀器和專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員，而且檢測中耗時較多。因此， 為控制牛巴貝斯蟲病在我國的大規(guī)模爆發(fā)，建立一種簡單可靠、敏感性高的分子生物學(xué)診斷方法是必要的，尤其是早期診斷。故在我國對本病進(jìn)行及時的鑒別診斷和有效控制是相當(dāng)必要的。中國發(fā)明專利申請201110041865. 9和200910005006. 7分別公開了一種用于檢測巴貝斯蟲的試劑盒及檢測方法，但這些技術(shù)只能對用于檢測某一特定各類的巴貝斯蟲。截至目前，在我國已發(fā)現(xiàn)的感染黃牛的巴貝斯蟲共五個種，即，牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲未定種，但至今沒有任何一種方法能完全區(qū)分開這五個種，特別是在發(fā)生混合感染時。由于其病原形態(tài)接近，有些媒介蜱也相同，用傳統(tǒng)分類學(xué)對病原進(jìn)行分類就遇到一些難以解決的問題。因此，建立一種有效的分子生物學(xué)方法，鑒別診斷牛巴貝斯蟲病的不同病原在臨床與研究中有著特殊意義，但現(xiàn)階段尚無一種簡單有效的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能快速鑒別診斷我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的五種牛巴貝斯蟲，S卩，牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲未定種的LAMP檢測試劑盒，同時提供這種試劑盒的使用方法。該發(fā)明依據(jù)牛梨形蟲核糖體18S rRNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS 兩種苷酸序列設(shè)計特異性引物，建立能分別檢測與區(qū)分這五種寄生蟲的LAMP方法，本發(fā)明的試劑盒及使用方法可準(zhǔn)確地檢測與區(qū)分我國五種牛的巴貝斯蟲，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白。 該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、診斷迅速等諸多優(yōu)點(diǎn)，且與別的梨形蟲沒有交叉反應(yīng)，其所檢測的五種牛巴貝斯蟲敏感性分別在10_5-10_6之間。同時可克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，無需復(fù)雜的儀器，操作技術(shù)簡單快速，不需要復(fù)雜的操作系統(tǒng)，可以在普通實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)施檢測。本發(fā)明用于診斷和鑒別牛巴貝斯蟲種類的試劑盒中包括有如下十四對牛的巴貝斯蟲特異引物1)兩對牛巴貝斯蟲特異引物分別為，BbF3 :CACTAGCACCACACCAGTG (SQL Na 1)，BbB3 :CAAAAGGGGGTGCATCTCG (SQL Na 2)，BbFIP GCGTTGCTAGTAGTGGCACCGGAATTCCAGCTTCCACCCAACGAG(SQL Na 3)，BbBIP :GCTACCCTAGTAGCCGGTTGGGGAATTCGAGCTTAACCCGGGTCGT(SQL Ns 4)；2)兩對雙芽巴貝斯蟲特異引物分別為，BbiF3 :ACTTGCAGACTTCTGCGATT (SQL Na 5)，BbiB3 :AGAAATTGGGGCGACAAGG (SQL Ns 6)，BbiFIP CAGGATTGGGGGCTCACTGAAAGAATTCGTAACAAACACACCGCCTCT(SQL Na 7)，BbiBIP :GGCCCCGGCCCATTTATAACGGAATTCAGGAGCACGGACACATTCA(SQL Na 8)；3)兩對卵形巴貝斯蟲特異引物分別為BoF3 :AAGGACGCAGCGAATTGC(SQL Na 9)，BoB3 :AAAACGACGCCCAATCGC(SQL Na 10)，BoFIP :GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL Ns 11)，BoBIP :GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL Na 12)；4)兩對大巴貝斯蟲特異引物分別為BmF3 CCACCGGGTCTAGTCTAGG (SQL Ns 13)，BmB3 CAACGGAGGGGTAGGAGAG (SQL Na 14)，BmFIP CGTCAAAACCCGGCAGGTCAGAATTCGAGCCTGTGTCCAAATCTCG(SQL Na 15)，
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BmBIP :CATGTTTCCCACTGCAACGTGCGAATTCAACGGCCTGGAATGGAATC (SQL Na 16)；5)兩對牛巴貝斯蟲未定種特異引物分別為BUF3 :GCTCGCACGCGGTACT (SQL Na 17)，BUB3 :CGCAAACCGCACAAACC(SQL Na 18)，BUFIP :AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL Na 19)，BUBIP :AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL Na 20)。為方便鑒別區(qū)分工作，本發(fā)明的試劑盒內(nèi)最好有如下內(nèi)容a)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；b)標(biāo)準(zhǔn)牛雙芽巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；c)標(biāo)準(zhǔn)牛卵形巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；d)標(biāo)準(zhǔn)牛大巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；e)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲未定種陽性基因組DNA ；f)標(biāo)準(zhǔn)牛環(huán)形泰勒蟲陽性基因組DNA ；g)標(biāo)準(zhǔn)牛瑟氏泰勒蟲陽性基因組DNA ；h)標(biāo)準(zhǔn)牛中華泰勒蟲陽性基因組DNA ；i)標(biāo)準(zhǔn)牛邊蟲陽性基因組DNA ；j)標(biāo)準(zhǔn)巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA ；k)滅菌超純水；1)LAMP反應(yīng)緩沖液；m) DNA 聚合酶；在試劑盒中的各特異引物可以是混合物，即1)由40pmol的BbFIP和BbBIP, 5pmol的BbF3和BbB3組成的牛巴貝斯蟲特異引物混合物；2)由40pmol的BbiFIP和BbiBIP，5pmol的BbiF3和BbiB3組成的牛雙芽巴貝斯蟲特異引物混合物；3)由40pmol的BoFIP和BoBIP，5pmol的BoF3和BoB3組成的牛卵形巴貝斯蟲特異引物混合物；4)由40pmol的BmFIP和BmBIP，5pmol的BmF3和BmB3組成的牛大巴貝斯蟲特異引物混合物；5)由40pmol的BUFIP和BUBIP，5pmol的BUF3和BUB3組成的牛巴貝斯蟲未定種特異引物混合物；本發(fā)明試劑盒的使用方法是首先從待檢牛只靜脈采血，提取血樣的基因組DNA。將此基因組DNA與DNA聚合酶、緩沖液、滅菌超純水以及牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲未定種特異引物混合物按比例混合均勻，擴(kuò)增后立刻滅活， 取擴(kuò)增產(chǎn)物以TAE為緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠中，在75伏電壓下電泳檢測，根據(jù)特定泳道是否出現(xiàn)特異性電泳帶型得出被檢牛只是否患有牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲或牛巴貝斯蟲未定種。本發(fā)明鑒別診斷五種牛的巴貝斯蟲的檢測方法是以牛巴貝斯蟲核糖體RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因?yàn)榘谢?，利用專用軟件設(shè)計出五種牛的巴貝斯蟲的特異性LAMP引物，待檢動物采血提取基因組DNA，將所得DNA分別與反應(yīng)緩沖液、滅菌超純水、五種牛的巴貝斯蟲特異性引物反應(yīng)混合物及DNA聚合酶混勻，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物滅活后加入上樣緩沖液，再置于含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)電泳后是否出現(xiàn)特定帶型即可得出被檢動物是否感染五種牛的巴貝斯蟲中的任何一種。在本發(fā)明的檢測方法中所用的上樣緩沖液為0. 25%溴酚藍(lán)，0.25% 二甲苯青， 40%蔗糖水溶液，所用的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠為由0. 04M Tris-乙酸和0. OOlM EDTA 組成的TAE緩沖液配制的2%瓊脂糖(0. 25%溴酚藍(lán)、0. 25%二甲苯青、40%蔗糖水溶液和 2%瓊脂糖為質(zhì)量/體積比，即g/v ;0.04M Tris-乙酸和0. OOlM EDTA為摩爾濃度)，其中含0. 5 μ g/mL的溴化乙錠。本發(fā)明實(shí)際上是一種采用環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法(LAMP)，這種方法是日本科學(xué)家Notomi T.等于2000年發(fā)明的敏感性很高的DNA擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isotheral amplification method, LAMP)(Notomi, Τ. , Okayama, H. , Masubuchi, H., Yonekawa, Τ. , Watanabe, K. , Amino, N. , Hase, Τ. ,2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 沘，E63.)。采用本發(fā)明的方法鑒別診斷五種牛的巴貝斯蟲時不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，只需要常規(guī)的水浴鍋就可以完成檢測，可在普通的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而且可得到具有高敏感性的檢測結(jié)果。


圖1 牛巴貝斯蟲LAMP弓丨物的特異性擴(kuò)增電泳圖，圖中M，標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker2000 ； 1，牛巴貝斯蟲；2，牛雙芽巴貝斯蟲；3，牛卵形巴貝斯蟲；4，牛大巴貝斯蟲；5，牛巴貝斯蟲未定種；6，牛環(huán)形泰勒蟲；7，瑟氏泰勒蟲；8，中華泰勒蟲，9，?；蚪MDNA ；10,巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA ； 11，滅菌超純水。圖2 牛雙芽巴貝斯蟲LAMP引物的特異性擴(kuò)增電泳圖，圖中M，標(biāo)準(zhǔn) DNAMarker2000 ；1，牛雙芽巴貝斯蟲；2，牛巴貝斯蟲；3，牛卵形巴貝斯蟲；4，牛大巴貝斯蟲； 5，牛巴貝斯蟲未定種；6，牛環(huán)形泰勒蟲；7，瑟氏泰勒蟲；8，中華泰勒蟲，9，牛邊蟲陽性基因組DNA ； 10，巴貝斯蟲陰性牛基因組DNA ；11，滅菌超純水。圖3 牛卵形巴貝斯蟲LAMP引物的特異性擴(kuò)增電泳圖，圖中M，標(biāo)準(zhǔn) DNAMarker2000 ；1，牛卵形巴貝斯蟲；2，牛巴貝斯蟲；3，牛雙芽巴貝斯蟲；4，牛大巴貝斯蟲； 5，牛巴貝斯蟲未定種；6，牛環(huán)形泰勒蟲；7，瑟氏泰勒蟲；8，中華泰勒蟲，9，牛邊蟲陽性基因組DNA ；10，巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA ；11，滅菌超純水。圖4 牛大巴貝斯蟲LAMP引物的特異性擴(kuò)增電泳圖，圖中M，標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker2000 ； 1，牛大巴貝斯蟲；2，牛巴貝斯蟲；3，牛雙芽巴貝斯蟲；4，牛卵形巴貝斯蟲；5，牛巴貝斯蟲未定種；6，牛環(huán)形泰勒蟲；7，瑟氏泰勒蟲；8，中華泰勒蟲，9，牛邊蟲陽性基因組DNA ;10，巴貝斯蟲陰性牛基因組DNA ； 11，滅菌超純水。圖5:牛巴貝斯蟲未定種LAMP引物的特異性擴(kuò)增電泳圖，圖中M，標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker2000 ；1，牛巴貝斯蟲未定種；2，牛巴貝斯蟲；3，牛雙芽巴貝斯蟲；4，牛卵形巴貝斯蟲蟲；5，牛大巴貝斯；6，牛環(huán)形泰勒蟲；7，瑟氏泰勒蟲；8，中華泰勒蟲，9，牛邊蟲陽性基因組 DNA ；10，巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA ；11，滅菌超純水。
具體實(shí)施例方式以下提供本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。本發(fā)明的診斷和鑒別牛巴貝斯蟲的試劑盒所使用的引物及試劑如下1)特異引物牛巴貝斯蟲引物BbF3 CACTAGCACCACACCAGTG (SQL Na 1)BbB3 :CAAAAGGGGGTGCATCTCG(SQL Ns 2)BbFIP GCGTTGCTAGTAGTGGCACCGGAATTCCAGCTTCCACCCAACGAG(SQL Na 3)BbBIP GCTACCCTAGTAGCCGGTTGGGGAATTCGAGCTTAACCCGGGTCGT(SQL Na 4)雙芽巴貝斯蟲BbiF3 :ACTTGCAGACTTCTGCGATT (SQL Na 5)BbiB3 :AGAAATTGGGGCGACAAGG(SQL Na 6)BbiFIP CAGGATTGGGGGCTCACTGAAAGAATTCGTAACAAACACACCGCCTCT (SQL Na 7)BbiBIP :GGCCCCGGCCCATTTATAACGGAATTCAGGAGCACGGACACATTCA(SQL Na 8)卵形巴貝斯蟲BoF3 :AAGGACGCAGCGAATTGC(SQL Na 9)BoB3 :AAAACGACGCCCAATCGC(SQL Na 10)BoFIP :GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL Na 11)BoBIP :GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL Na 12)大巴貝斯蟲BmF3 CCACCGGGTCTAGTCTAGG (SQL Na 13)BmB3 CAACGGAGGGGTAGGAGAG (SQL Na 14)BmFIP CGTCAAAACCCGGCAGGTCAGAATTCGAGCCTGTGTCCAAATCTCG(SQL Na 15)BmBIP CATGTTTCCCACTGCAACGTGCGAATTCAACGGCCTGGAATGGAATC(SQL Na 16)牛巴貝斯蟲未定種BUF3 :GCTCGCACGCGGTACT(SQL Na 17)BUB3 :CGCAAACCGCACAAACC(SQL Na 18)BUFIP :AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL Na 19)BUBIP :AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL Na 20)2)牛巴貝斯蟲特異性引物反應(yīng)混合物GOpmol的BbFIP和BbBIP，5pmol的BbF3 和。3)牛雙芽巴貝斯蟲特異性引物反應(yīng)混合物GOpmol的BbiFIP和BbiBIP，5pmol的 BbiF3 和 Κ Β3)。4)牛卵形巴貝斯蟲特異性引物反應(yīng)混合物GOpmol的BoFIP和BoBIP，5pmol的 BoF3 和 BoB3)。5)牛大巴貝斯蟲特異性引物反應(yīng)混合物GOpmol的BmFIP和BmBIP，5pmol的BmF3 和 BmB3)。6)牛巴貝斯蟲未定種特異性引物反應(yīng)混合物GOpmol的BUFIP和BUBIP，5pmol的 BUF3 禾口 BUB3)。
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7) 2 X LAMP 反應(yīng)緩沖液(40mM Tris-HCl (pH 8. 8), 20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM(NH4)2S04,0. 2% Tween 20，1· 6M betaine 和 2. 5mM dNTP)。8) Bst DNA 聚合酶(M0275L，BioLabs)。9)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；10)標(biāo)準(zhǔn)牛雙芽巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；11)標(biāo)準(zhǔn)牛卵形巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；12)標(biāo)準(zhǔn)牛大巴貝斯蟲陽性基因組DNA ；13)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲未定種陽性基因組DNA ；14)標(biāo)準(zhǔn)牛環(huán)形泰勒蟲陽性基因組DNA ；15)標(biāo)準(zhǔn)牛瑟氏泰勒蟲陽性基因組DNA ；16)標(biāo)準(zhǔn)牛中華泰勒蟲陽性基因組DNA ；17)標(biāo)準(zhǔn)牛邊蟲陽性基因組DNA ；18)標(biāo)準(zhǔn)巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA ；19)滅菌超純水20)6X上樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液)。21) IXTAE 緩沖液(0. 04M Tris-乙酸，0. OOlM EDTA)。22) 2%瓊脂糖(用IXTAE緩沖液配制)其具體的檢測操作方法如下(一)感染牛的五種巴貝斯蟲，即，牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲未定種血液的獲得用液氮中保存的含蟲血液分別接種五只實(shí)驗(yàn)動物，當(dāng)染蟲率達(dá)到5%以上時，以 20%枸櫞酸鈉為抗凝劑，靜脈采血，將所采血液4°C條件下2500rpm離心10分鐘，棄去上清， 盡量將白細(xì)胞吸棄。用2%枸櫞酸鈉洗滌三次(同上2500rpm離心10分鐘)，最后將上清去掉，紅細(xì)胞分裝入1. 5ml離心管中，-20°C保存。(二)巴貝斯蟲陰性牛血的獲得采集經(jīng)血涂片檢查和PCR檢測陰性的牛的靜脈血，同上處理。(三)從血液中提取基因組的方法a)力口 900 μ 1 BRC Cell Lysis Solution 于盛 300 μ 1 血液的 1. 5ml 離心管中，顛
倒10次，在室溫下放置到液體澄清透明。b)3000g離心3分鐘，棄上清，保留下面的可見的白色沉淀和大約10 20μ 1液體，渦旋20秒。C)每管中加入 300μ1 Cell Lysis Solution，吹打混勻。d)力口入 100 μ 1 Protein Preciptation Solution。e)蝸旋20秒，至出現(xiàn)棕褐色沉淀顆粒。13000g離心3分鐘。將上清液移至新標(biāo)記的離心管中，加入300 μ 1異丙醇，顛倒50次·f) 13000g離心5分鐘。棄上清，在干凈的紙巾上放置，將剩余的液體吸干。g)加入300 μ 1 70%乙醇。13000g離心3分鐘，小心除去乙醇，在吸水紙上吸干剩余液體。h)在 Speedcac 真空干燥。
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i)力口入 100 μ 1 DNA Hydration Solution。j)4°C過夜或60°C溫育1小時。k)_20°C 保存?zhèn)溆谩?四)2X LAMP反應(yīng)緩沖液的準(zhǔn)備首先應(yīng)用滅菌的超純水按照如下表比例配制無dNTP的2X反應(yīng)緩沖液儲存液。所配制的儲存液可在4°C保存3個月，-20°C長期保存。
權(quán)利要求
1.用于診斷和鑒別牛巴貝斯蟲種類的試劑盒，其特征在于試劑盒中包括有如下二十個巴貝斯蟲特異引物1)兩對牛巴貝斯蟲特異引物SQLNa 1、SQL Na 2、Ns 3和SQL Na 4 ；2)兩對雙芽巴貝斯蟲特異引物SQLNa 5、SQL Ns 6、SQL Na 7和SQL Na 8 ；3)兩對卵形巴貝斯蟲特異引物SQLNa 9、SQL Na 10、SQL Ns 11和SQL Na 12 ；4)兩對大巴貝斯蟲特異引物SQLNa 13、SQL Na 14、SQL Na 15和SQL Na 16 ；5)兩對牛巴貝斯蟲未定種特異引物SQLNa 17、SQL Na 18、SQL Na 19和SQL Na 20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于診斷和鑒別牛巴貝斯蟲種類的試劑盒，其特征在于試劑盒中還有a)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲陽性基因組DNA;b)標(biāo)準(zhǔn)牛雙芽巴貝斯蟲陽性基因組DNA;c)標(biāo)準(zhǔn)牛卵形巴貝斯蟲陽性基因組DNA;d)標(biāo)準(zhǔn)牛大巴貝斯蟲陽性基因組DNA;e)標(biāo)準(zhǔn)牛巴貝斯蟲未定種陽性基因組DNA;f)標(biāo)準(zhǔn)牛環(huán)形泰勒蟲陽性基因組DNA；g)標(biāo)準(zhǔn)牛瑟氏泰勒蟲陽性基因組DNA；h)標(biāo)準(zhǔn)牛中華泰勒蟲陽性基因組DNA；i)標(biāo)準(zhǔn)牛邊蟲陽性基因組DNA；j)標(biāo)準(zhǔn)巴貝斯蟲陰性?；蚪MDNA; k)滅菌超純水； 1)LAMP反應(yīng)緩沖液； m) DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于檢測被檢牛只是否感染牛巴貝斯蟲、區(qū)分感染何種巴貝斯蟲的檢測試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。本發(fā)明的診斷和鑒別牛巴貝斯蟲種類的試劑盒中包括有SQL №1至SQL №20共二十個牛的巴貝斯蟲特異引物。
文檔編號C12Q1/68GK102337342SQ201110324308
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者任巧云, 關(guān)貴全, 劉軍龍, 劉志杰, 劉愛紅, 李有全, 楊吉飛, 殷宏, 牛慶麗, 羅建勛, 馬米玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所