本發(fā)明屬于植物分子檢測技術(shù)，具體涉及用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的PCR引物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界范圍最具毀滅性的柑橘病害，給柑橘生產(chǎn)造成了巨大的損失，是國內(nèi)外柑橘主產(chǎn)國的重大植物檢疫病害。1994年柑橘黃龍病的病原被確定為“CandidatusLiberibacter spp.”，是一種限于篩管組織內(nèi)寄生，通過柑橘木虱傳播的革蘭氏陰性細(xì)菌。柑橘黃龍病在我國的大部分柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生，嚴(yán)重制約我國柑橘產(chǎn)業(yè)的生存與健康發(fā)展。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年因黃龍病減產(chǎn)超過75萬噸，直接經(jīng)濟(jì)損失超過15億元。我國的19個柑橘栽培省、區(qū)中已有11個遭受黃龍病危害，受害面積超過柑橘栽培總面積的80％。同時，隨著國際貿(mào)易、旅游和交通的迅速發(fā)展，黃龍病菌從國外疫區(qū)入侵我國的危險性也日益增加，入侵后極易爆發(fā)成災(zāi)并導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其檢疫檢測特別是高效快速檢測的需求愈發(fā)迫切。

目前，柑橘黃龍病菌CandidatusLiberibacter spp.的主要檢測方法有癥狀診斷法、電鏡觀察法、血清學(xué)法和PCR法。由于柑橘黃龍病癥狀較為復(fù)雜，與多種植物缺素癥相似，依據(jù)癥狀的診斷方法在黃龍病的早期檢測中具有很大的局限性，不利于黃龍病的早期的防治。而電鏡觀察法由于受樣品采集和處理等客觀因素影響大使得檢出率較低，只有60％～70％。血清學(xué)法由于抗體制備過程繁雜，且所制得抗體只能與免疫抗原采集地的病原發(fā)生反應(yīng)，易造成假陰性，因而不適合未廣泛使用。PCR檢測方法是一種可信度高、可批量進(jìn)行，不僅能對顯癥的植物組織的病原進(jìn)行定性和定量分析，還能對未顯癥的植物材料、介體昆蟲中的病原物進(jìn)行檢測，目前已成為柑橘黃龍病診斷的可靠方法之一。目前已有報道的黃龍病PCR檢測技術(shù)主要包括常規(guī)PCR法、巢式PCR法和實時熒光定量PCR法。

黃龍病菌的常規(guī)PCR檢測方法較之其他PCR檢測方法具有操作簡單快捷、檢測成本低等特點，一般情況下可以完成對黃龍病的定性檢測，近十年來已應(yīng)用于黃龍病菌的快速檢測，成為實驗室檢測黃龍病菌的常用方法。從目前已有報道來看，絕大部分常規(guī)PCR檢測方法只針對黃龍病菌建立了快速檢測方法，但在靈敏度方面要么缺少數(shù)據(jù)說明，要么到達(dá)的靈敏度不夠高，例如在2006年胡浩等在《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》發(fā)表的“柑桔黃龍病的常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測”中報道，其檢測靈敏度到達(dá)0.439pg/μl。

對于未顯癥的感染植株，由于黃龍病病菌在柑橘植株體內(nèi)含量較低且分布不均勻，因此PCR模板中黃龍病病菌的DNA含量極低，這常常導(dǎo)致檢測假陰性，影響早期預(yù)警的準(zhǔn)確性，不利于黃龍病菌的早期防治，因此，PCR方法的靈敏度越高越有利于早期預(yù)警的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述領(lǐng)域本領(lǐng)域存在的上述黃龍病菌檢測準(zhǔn)確性低，易出現(xiàn)假陰性、漏檢，不利于柑橘黃龍病早期防治等問題，本發(fā)明提供用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的PCR引物、試劑盒及方法，即使僅僅采用常規(guī)PCR方法和設(shè)備，也能實現(xiàn)超高的靈敏度，非常適合于早期預(yù)警診斷。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的PCR引物對，其核苷酸序列如下：

上游引物HLBF468：5`-GCGATTAAGTTAGAGGTGA-3’；

下游引物HLBR877：5`-TACCATCTCTGATATCGTCCTATA-3’。

用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的試劑盒，其特征在于，包括所述PCR引物對。

進(jìn)一步地，還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的常規(guī)試劑，和/或電泳檢測所需的常規(guī)試劑。

一種用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)對取自待測地區(qū)的柑橘材料進(jìn)行DNA提取，獲得含有柑橘材料DNA和可能存在的黃龍病菌DNA的待測模板；

(2)采用權(quán)利要求1所述的引物對對所述待測模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；若泳道出現(xiàn)433bp的目標(biāo)條帶，則該泳道對應(yīng)的柑橘材料初定為黃龍病菌攜帶或感染材料。

進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

2×Taq PCR MasterMix15μl，10μM的上、下游引物HLBF468和HLBR877各1μl，待測模板2μl，ddH2O 11μl。

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；以95℃變性30s、55℃退火延伸30s、72℃延伸30s為1個循環(huán)，共40個循環(huán)；72℃延伸5min。

所述柑橘材料為柑橘葉片中脈。

一種檢測黃龍病菌(CandidatusLiberibacter spp.)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待測病菌的DNA作為待測模板；

(2)采用所述引物對對所述待測模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；若泳道出現(xiàn)為433bp的目標(biāo)條帶則待測病菌是黃龍病菌或含有黃龍病菌。

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

2×Taq PCR MasterMix 15μl，10μM的上、下游引物HLBF468和HLBR877各1μl，待測模板2μl，ddH₂O 11μl，和/或

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；以95℃變性30s、55℃退火延伸30s、72℃延伸30s為1個循環(huán)，共40個循環(huán)；72℃延伸5min。

上述試劑盒的制備方法，其特征在于，在標(biāo)有柑橘黃龍病早期診斷用途的包裝盒內(nèi)包裝權(quán)利要求1所述的PCR引物對。

發(fā)明人在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索黃龍病菌CandidatusLiberibacterspp.及其同屬其他菌種序列長度大于1000bp的16s rDNA基因同源序列，對所獲得的40多條16s rDNA基因同源序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對，尋找并選擇出黃龍病菌CandidatusLiberibacterspp.的保守位點，所選保守位點又能特異性地區(qū)別同屬其他菌種，在所選擇的保守位點人工設(shè)計出若干候選引物，利用Oligo軟件對這些候選引物進(jìn)行評估，并對評估分?jǐn)?shù)較高的引物進(jìn)行驗證，選擇能特異性地區(qū)別同屬其他菌種，柑橘組織DNA，且靈敏度好的引物。

發(fā)明人在所選的引物中，偶然中發(fā)現(xiàn)其中一對引物的靈敏度超出預(yù)期若干倍，編號為HLBF468/HLBR877，分別如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。如實施例2所記載，該引物對能夠?qū)S龍病菌DNA濃度僅為1.17×10^-9ng/μl的模板擴(kuò)增出可檢測的條帶，是現(xiàn)有報道2006年胡浩等人報道的靈敏度0.439pg/μl的3000倍，即靈敏度提高了3000倍以上，該引物超出了本領(lǐng)域預(yù)期的前所未有的高靈敏度，這種高靈敏度對于檢測柑橘黃龍病菌以及柑橘黃龍病的早期診斷來說意義重大，能夠克服因黃龍病病菌在柑橘植株體內(nèi)含量較低且分布不均勻引起的假陰性而造成的漏檢、診斷錯誤等問題，從而實現(xiàn)柑橘黃龍病的早期準(zhǔn)確診斷，根據(jù)該早期診斷，及早剔除感染病菌的幼苗，以免植株成年發(fā)病后引發(fā)進(jìn)一步大面積感染，從而避免造成大面積損失。

基于所述PCR引物對HLBF468/HLBR877，本發(fā)明還提供了一種用于高效檢測柑橘黃龍病菌或早期診斷柑橘黃龍病的試劑盒和PCR方法。

為完善本發(fā)明所述試劑盒的可用性，優(yōu)選進(jìn)一步包括PCR擴(kuò)增所需的常規(guī)試劑，和/或電泳所需的常規(guī)試劑。

另一方面，本發(fā)明通過對PCR檢測的引物設(shè)計與篩選、優(yōu)化常規(guī)PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序，建立了一種高效檢測柑橘黃龍病菌的PCR檢測方法，即，采用上述PCR引物對或試劑盒，采用常規(guī)的PCR檢測手段對柑橘基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及電泳檢測。本發(fā)明的PCR檢測方法可以提高常規(guī)PCR檢測方法的靈敏度，比目前國內(nèi)有報道的常規(guī)PCR檢測方法提高3000 倍以上，能夠避免檢測假陰性情況，滿足對柑橘黃龍病的早期準(zhǔn)確診斷的需要。

本發(fā)明還請求保護(hù)上述試劑盒的制備生產(chǎn)方法，任何規(guī)模的基于商業(yè)目的的試劑盒的生產(chǎn)行為都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述生產(chǎn)行為包括，在標(biāo)有柑橘黃龍病菌檢測用途的包裝盒內(nèi)裝入權(quán)利要求1所述的PCR引物對。進(jìn)一步，所述生產(chǎn)行為包括在所述包裝盒內(nèi)裝入PCR擴(kuò)增所需的常規(guī)試劑，和/或電泳所需的常規(guī)試劑。

綜上所述，利用本發(fā)明提供的PCR引物對進(jìn)行柑橘黃龍病的鑒定與診斷，操作簡單易行，特異性強(qiáng)，靈敏度超高，能大大提高檢測診斷效率，以便更有針對性地培育健康柑橘，將生成損失降至最低。同時本發(fā)明建立了具有高靈敏度和普遍適用的柑橘黃龍病快速鑒定技術(shù)體系，為黃龍病早期診斷和防控、保護(hù)我國柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1是柑橘黃龍病特異性引物驗證結(jié)果圖。

其中，M：D2000marker；1-7：新會果園的感染黃龍病樣品；8：脫毒苗樣品；9：陰性對照(ddH₂0)。

圖2是柑橘黃龍病特異性引物檢測靈敏度結(jié)果圖。

其中，M：D2000marker；1：PCR純化產(chǎn)物原液(11.7ng/μl)；2：10倍稀釋液；3：10²倍稀釋液；4：10³倍稀釋液；5：10⁴倍稀釋液；6：10⁵倍稀釋液；7：10⁶倍稀釋液；8：10⁷倍稀釋液；9：10⁸倍稀釋液；10：10⁹倍稀釋液；11：10¹⁰倍稀釋液；12：陰性對照(ddH₂0)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明所述的制品，但并不以此限制本發(fā)明的范圍。如無特殊說明，下述所采用的試劑與材料均可商購獲得，所采用的方法均為常規(guī)操作。

生物材料

陽性樣品是由廣東康士生物科技股份有限公司江門市新會果園內(nèi)感染黃龍病的柑橘樹葉片組織；

陰性樣品是由廣州市齊美植物保護(hù)有限公司提供的柑橘脫毒苗葉片組織。

試劑耗材

植物基因組DNA提取試劑盒、大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒，2×Taq PCR MasterMix均購自天根生化科技(北京)有限公司；

實施例1、柑橘黃龍病特異性引物的設(shè)計

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索黃龍病菌CandidatusLiberibacter spp.及其同屬其他菌種序列長度大于1000 bp的16s rDNA基因同源序列(40條)，對所獲得的所有16s rDNA基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對，尋找黃龍病菌CandidatusLiberibacter spp.的保守位點，同時該保守位點又能特異性地區(qū)別于同屬其他菌種，在該選擇出的位點人工設(shè)計出一系列、若干對引物對，利用Oligo軟件對引物進(jìn)行評估，并一一進(jìn)行實驗驗證，最終確定出一對可用的引物對，如下表1所示：

表1鑒定柑橘黃龍病的特異性引物

上述引物對上下游引物序列分別對應(yīng)Seq ID No.1和Seq ID No.2。

上述目標(biāo)片段長度433bp，序列如Seq ID No.3所示。

實施例2、本發(fā)明所述的試劑盒

本實施例提供一種高效檢測柑橘黃龍病菌和/或早期診斷柑橘黃龍病的試劑盒，其包括實施例1所述的PCR引物對，以及PCR擴(kuò)增所需的常規(guī)試劑，和/或電泳所需的常規(guī)試劑。

所述PCR擴(kuò)增所需的常規(guī)試劑包括：PCR緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶、TE緩沖液、雙蒸水等，或者商品化的各類含Taq聚合酶的PCR反應(yīng)Mix混合液。

所述電泳所需的常規(guī)試劑包括：瓊脂粉、雙蒸水、EB(溴化乙錠)等。

實施例3、柑橘黃龍病快速鑒定體系的建立

(1)DNA提?。?/p>

利用“植物基因組DNA提取試劑盒”(天根生化科技(北京)有限公司)對植物樣品進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作流程參照說明書，用于后續(xù)的引物驗證。

(2)引物特異性驗證：

以上述所提取的DNA為模板，利用所設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過不斷調(diào)整PCR反應(yīng)試劑用量以及退火溫度、時間等，確定最終的反應(yīng)體系。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR特異的擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，EB染色15分鐘，在紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果如下圖1所示。

結(jié)果表明HLBF468/HLBR877引物對在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，對且僅對所有感染黃龍病的柑橘組織發(fā)生陽性反應(yīng)，產(chǎn)生特異性目的條帶，對健康柑橘樹組織為陰性反應(yīng)(無特異性條帶產(chǎn)生)，結(jié)果如圖1。

(3)靈敏度檢測：

利用“大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒”(天根生化科技(北京)有限公司)將得到特異性條帶的PCR反應(yīng)液用進(jìn)行產(chǎn)物純化，具體操作流程參照說明書。

利用ND-1000分光光度計進(jìn)行純化后PCR反應(yīng)產(chǎn)物的DNA濃度檢測，檢測結(jié)果為11.7 ng/μl，用于后續(xù)的靈敏度檢測。

將濃度11.7 ng/μl的PCR反應(yīng)純化產(chǎn)物使用TE緩沖液進(jìn)行系列稀釋，得到11種稀釋液；11種稀釋液中的目的片段DNA濃度為別為：11.7 ng/μl、1.17 ng/μl、0.117 ng/μl、1.17×10^-2ng/μl、1.17×10^-3ng/μl、1.17×10^-4ng/μl、1.17×10^-5ng/μl、1.17×10^-6ng/μl、1.17×10^-7ng/μl、1.17×10^-8ng/μl和1.17×10^-9ng/μl。

分別以每種稀釋液為模板(水為陰性對照)，用引物對HLBF468/HLBR877分別對不同濃度的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同(2)。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR特異的擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，EB染色15分鐘，在紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果如下圖2所示。

結(jié)果顯示可檢測的模板濃度達(dá)到1.17×10^-9ng/μl，比現(xiàn)有技術(shù)(胡浩，2006《柑橘黃龍病的常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測》)已報道的常規(guī)PCR檢測靈敏度4.39pg/μl提高了3000倍以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院

<120> 用于柑橘黃龍病早期預(yù)警的PCR引物、試劑盒及方法

<130> P160618/NYB

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 上游引物HLBF468

<400> 1

gcgattaagt tagaggtga 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 下游引物HLBR877

<400> 2

taccatctct gatatcgtcc tata 24

<210> 3

<211> 433

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 目標(biāo)片段

<400> 3

gcgattaagt tagaggtgaa atcccagggc tcaaccttgg aactgccttt aatactggtt 60

gtctagagtt taggagaggt gagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt 120

cggaggaaca ccggtggcga aggcggctca ctggcctgat actgacgctg aggcgcgaaa 180

gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 240

gctgttgggt ggtttaccat tcagtggcgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 300

gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 360

tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgcagaac cttaccagcc cttgacatgt ataggacgat 420

atcagagatg gta 433