本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高精度指導華法林用量的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

華法林是目前應用最廣泛的口服抗凝藥,僅口服有效，奏效慢而持久。

華法林廣泛應用于預防和治療靜脈、動脈血栓栓塞性疾病。心房纖顫或心臟瓣膜機械瓣置換術(shù)后的患者需要終身服用華法林。由于其治療窗較窄，在使用相同抗凝劑量的華法林時，可導致不同個體發(fā)生出血或血栓等嚴重的并發(fā)癥，這主要與劑量的個體差異有關(guān)，使其臨床應用受到限制，華法林用藥不當所引起的不良反應,甚至能夠威脅生命。

隨著遺傳藥理學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)編碼華法林代謝和藥效的酶的基因存在遺傳多態(tài)性，而且在很大程度上解釋了華法林的個體差異和種族差異。以遺傳藥理為基礎(chǔ)的華法林藥物基因組學劑量預測方程得到越來越多的關(guān)注，2007年美國食品與藥品監(jiān)督管理局更新華法林的處方，推薦用藥前患者接受相關(guān)基因型檢測。

目前，對于華法林的檢測方面，主要集中在VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9*3(1061A/C)，如中國專利201210082350.8，但僅檢測這兩種基因型僅能解釋大約50％的華法林用量的個體差異，精度不高。

隨著研究的推進，中國專利201210003997.7提出了聯(lián)用CYP2C9*3、CYP2C9*1、VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG和CYP4F2rs2108622TT制備相應的試劑盒并對華法林劑量進行預測的方案，并取得了較好的效果；中國專利201210196926.3提出了聯(lián)用VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*6、CALU rs339097制備相應試劑盒的方案；中國專利201310033313.2也提出了利用CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、CALU和GGCX的相關(guān)基因型制備試劑盒的方案。

然而，上述試劑盒還存在精度不高，達到穩(wěn)定INR值所需時間較長的缺點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種高精度指導華法林用量的檢測試劑盒，該試劑盒包括含VKORC1(1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的擴增引物、PCR反應試劑、RFLP試劑；

所述VKORC1(1639G/A)的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’

R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’；

所述CYP4F2(V433M)的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’

R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’；

所述GGCX rs11676382的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’

R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’；

所述CYP2C9*2的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’

R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’；

所述CYP2C9*3的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’

R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’；

所述CYP2C9*5的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’

R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’；

所述CYP2C9*6的擴增引物的核苷酸序列為：

F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’

R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’。

所述PCR反應試劑包括高保真taq酶、Mg²⁺、緩沖液、ddH₂O。

所述RFLP試劑包括限制性內(nèi)切酶、緩沖液、ddH₂O。

本發(fā)明還提供了利用上述試劑盒的檢測方法，方法包括如下步驟：

(1)采集外周血2ml，EDTA抗凝，采用SnoMagTM Blood DNA Extraction Kit提取基因組DNA；

(2)利用所述擴增引物，對提取的基因組DNA進行PCR擴增；PCR反應體系為20ul：基因組DNA 1ul，2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul，引物(F/R 10uMol)0.5ul，雙蒸水8.5ul；PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)，72℃延伸5min，12℃Hold 0min；

(3)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)所得的擴增產(chǎn)物進行觀察與分析，判斷擴增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰：分別取5ul擴增產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％瓊脂糖凝膠的加樣孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標，瓊脂糖凝膠以綠如藍核酸染料為染色劑，100V穩(wěn)壓電泳40分鐘，在凝膠成像儀中觀察帶型；達到要求則進行下一步，否則重復步驟(2)；

(4)以限制性內(nèi)切酶MspI、PvuII、HindIII、AvaII、KpnI、AluI、MnlI分別對VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR產(chǎn)物進行消化，體系總共10ul：PCR產(chǎn)物5ul，限制性內(nèi)切酶0.5ul，酶對應的緩沖液1ul，ddH2O 3.5ul；37℃恒溫2小時；

(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)所得的酶切產(chǎn)物進行觀察與分析，判斷擴增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰：分別取10ul酶切產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％瓊脂糖凝膠的加樣孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標，瓊脂糖凝膠以綠如藍核酸染料為染色劑，100V穩(wěn)壓電泳40分鐘，在凝膠成像儀中觀察帶型；

(6)將所得的VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年齡、身高、體重代入以下計算公式得出華法林最佳服用量：

＝exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484AG+0.554×VKORC1 6484AA-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3)

式中BSA(m2)＝0.0061×height(cm)+0.0128×weight(kg)-0.1529；age單位為years；VKORC1-6484AG VKORC1-6484AA CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3是計為1，否則計為0。Exp表示自然對數(shù)(e)的指數(shù)

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明能夠更準確的預測患者的華法林最佳服用量，從而輔助臨床醫(yī)生更合理安全的使用華法林，盡快達到穩(wěn)定INR值，減少用藥初期的出血風險，提高治療效果。

附圖說明

圖1為VKORC1(-1639G/A)多態(tài)性酶切電泳圖；

圖2為CYP4F2(V433M)多態(tài)性酶切電泳圖；

圖3為GGCX rs11676382多態(tài)性酶切電泳圖；

圖4為CYP2C9*2多態(tài)性酶切電泳圖；

圖5為CYP2C9*3多態(tài)性酶切電泳圖；

圖6為CYP2C9*5多態(tài)性酶切電泳圖；

圖7為CYP2C9*6多態(tài)性酶切電泳圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

(1)首先采集患者外周血2ml，EDTA抗凝，采用SnoMag^TM Blood DNA Extraction Kit提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。

(2)對提取的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系為20ul：基因組DNA 1ul，2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul，引物(F/R 10uMol)0.5ul，雙蒸水(ddH₂O)8.5ul；PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)，72℃延伸5min，12℃Hold0min。引物序列如下：

VKORC1 F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’

R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’

CYP4F2 F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’

R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’

GGCX F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’

R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’

CYP2C9*2 F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’

R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’

CYP2C9*3 F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’

R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’

CYP2C9*5 F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’

R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’

CYP2C9*6 F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’

R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’

(3)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)所得的擴增產(chǎn)物進行觀察與分析，判斷擴增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰：分別取5ul擴增產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％瓊脂糖凝膠的加樣孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標，瓊脂糖凝膠以綠如藍核酸染料為染色劑，100V穩(wěn)壓電泳40分鐘，在凝膠成像儀中觀察帶型。達到要求則進行下一步，否則重復步驟(2)。

(4)以限制性內(nèi)切酶MspI、PvuII、HindIII、AvaII、KpnI、AluI、MnlI分別對VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR產(chǎn)物進行消化，總共10ul體系：PCR產(chǎn)物5ul，限制性內(nèi)切酶0.5ul，酶對應的緩沖液1ul，ddH₂O 3.5ul；37℃恒溫2小時。

(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)所得的酶切產(chǎn)物進行觀察與分析，判斷擴增條帶是否為目的條帶且明亮、清晰：分別取10ul酶切產(chǎn)物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％瓊脂糖凝膠的加樣孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作為分子量標，瓊脂糖凝膠以綠如藍核酸染料為染色劑，100V穩(wěn)壓電泳40分鐘，在凝膠成像儀中觀察帶型。

基因型鑒定如圖1～圖7所示，經(jīng)PCR擴增后，VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的目的片段大小分別為423bp、358bp、300bp、375bp、152bp、310bp、368bp。

根據(jù)酶切產(chǎn)物判斷基因型，VKORC1-1639G>A的基因型有三種，野生型GG：207bp與216pb兩條帶，雜合子GA：423、207bp與216pb三條帶，突變純合子AA：423一條帶，如圖1所示(其中M：DNA Marker；泳道1：野生型GG)；

CYP4F2V433M的基因型有三種，野生型CC：150bp與208pb兩條帶，雜合子CT：358、150bp與208pb三條帶，突變純合子TT：423一條帶，如圖2所示(其中M：DNA Marker；泳道2：野生型CC)；

GGCX rs11676382的基因型有三種，野生型CC：149bp與151bp兩條帶，雜合子CG：300、149bp與151bp三條帶，突變純合子GG：300一條帶，如圖3所示(其中M：DNA Marker；泳道3：野生型CC)；

CYP2C9*2的基因型有三種，野生型CYP2C9*1/*1：79bp與296bp兩條帶，雜合子CYP2C9*1/*2：375bp、79bp與296bp三條帶，突變純合子CYP2C9*2/*2：375bp一條帶，如圖4所示(其中M：DNA Marker；泳道4：野生型CYP2C9*1/*1)；

CYP2C9*3的基因型有三種，野生型CYP2C9*1/*1：152bp一條帶，雜合子CYP2C9*1/*3：152bp、134bp與18bp三條帶，突變純合子CYP2C9*3/*3：134bp與18bp兩條帶，如圖5所示(其中M：DNA Marker；泳道5：野生型CYP2C9*1/*1)；

CYP2C9*5的基因型有三種，野生型CYP2C9*1/*1：243bp與67bp兩條帶，雜合子CYP2C9*1/*5：243bp、124bp、119bp與67bp四條帶，突變純合子CYP2C9*5/*5：124bp、119bp與67bp三條帶，如圖6所示(其中M：DNA Marker；泳道6：野生型CYP2C9*1/*1)；

CYP2C9*6的基因型有三種，野生型CYP2C9*1/*1：216bp、130bp與22bp三條帶，雜合子CYP2C9*1/*6：216bp、152bp、130bp與22bp四條帶，突變純合子CYP2C9*6/*6：216bp與152bp兩條帶，如圖7所示(其中M：DNA Marker；泳道7：突變純合子CYP2C9*6/*6)；

(6)將所得患者的VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年齡、身高、體重代入以下計算公式得出患者的華法林最佳服用量：

該患者的身高為172cm，體重60kg，年齡為41歲，基因型分別為VKORC1-1639G>A：GG、CYP4F2V433M：CC、GGCX rs11676382：CC、CYP2C9*2：*1/*1、CYP2C9*3:*1/*1、CYP2C9*5:*1/*1、CYP2C9*6:*6/*6。

實驗例1

根據(jù)實施例1的方法，對105位患者進行測試，未發(fā)現(xiàn)假陽性，說明本發(fā)明方法的敏感性和特異性均達到了100％。

實驗例2

以實施例1的服藥方法為實驗組，以申請?zhí)枮?01310033313.2中國專利的方法為對照組1，以3mg的服藥量為對照組2，對124名患者進行INR相關(guān)檢測。其中，實驗組共42名，對照組1共44名，對照組2共38名。

實驗組在第3、5、7天的INR達標率為45.2％、61.9％、83.8％；對照組1在第3、5、7天的INR達標率為38.3％、50.1％、69.4％；對照組2在第3、5、7天的INR達標率為11.0％、22.7％、46.0％。

實驗組首次達標的時間為4.10±1.22天；對照組1首次達標的時間為6.23±2.30天；對照組2首次達標的時間為7.55±2.69天。