本發(fā)明屬于生物工程，涉及菌種誘變，尤其涉及一種堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株及其所產(chǎn)的堿性蛋白酶。
背景技術(shù)：
：堿性蛋白酶(AlkalineProtease)是指在pH值為堿性的條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，其最適pH一般為9～11，屬內(nèi)肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，主要應(yīng)用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、飼料、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等工業(yè)也有廣泛的應(yīng)用。堿性蛋白酶最早在豬的胰臟中發(fā)現(xiàn)。1914年，德國科學(xué)家Rohm和Haas首先將胰蛋白酶和碳酸鈉混合劑作為洗滌浸泡劑(Burnus)使用。1945年，瑞士的Dr.Jaag等發(fā)現(xiàn)了微生物堿性蛋白酶，使蛋白酶有可能廣泛應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)。1956年，第一種含有微生物產(chǎn)堿性蛋白酶洗滌劑進(jìn)入市場。1963年，諾和諾德公司(現(xiàn)諾維信公司)發(fā)現(xiàn)了更適用于洗滌劑的堿性蛋白酶Alcalase，此后，酶制劑被廣泛地應(yīng)用于洗滌劑產(chǎn)品中。隨后的20年中，細(xì)菌類蛋白酶是唯一被應(yīng)用于洗滌劑的商品化酶制劑。目前，在世界范圍內(nèi)蛋白酶是工業(yè)酶種中用得最多的一種，約占酶總量的60％，其中堿性蛋白酶就占25％，它在商業(yè)中的巨大應(yīng)用前景和在基礎(chǔ)研究中的重要作用，吸引著國際國內(nèi)的許多公司及研究單位競相對其進(jìn)行多方面的研究。今天，Novozyme和GenencorInternational控制著全球堿性蛋白酶95％的份額。近年來，離子束作為一種新的誘變源在誘變育種方面因其獨(dú)特的誘變機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)展極為迅速，與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入除了具有能量沉積效應(yīng)外，還具有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷中和與交換等效應(yīng)，它將物理誘變與化學(xué)誘變特性集于一身，能夠在低劑量注入的情況下，顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果。離子注入技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物優(yōu)良菌株的選育和改良研究中，已選育出一些在工業(yè)上具有較大應(yīng)用前景的生物新品種，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。同時(shí)，常壓室溫等離子體誘變(ARTP)作為一種物理誘變手段，是指使用育種機(jī)的等離子體發(fā)射源，放射一束等離子體，直接照射裸露的樣品，具有條件溫和且能快速使菌體突變，操作簡便，不需要真空裝置，對人體無副作用，對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)。等離子體是大量相互作用的但仍處于非束縛狀態(tài)下的帶電粒子組成的宏觀體系，是與固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)處于同一層次上的物質(zhì)的第四態(tài)。等離子是電離氣體，這些物質(zhì)能與生物體內(nèi)的生物大分子(酶或DNA)相互作用，從而引起生物體的死亡或突變。將等離子體誘變應(yīng)用于微生物誘變育種是一項(xiàng)嶄新的技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種采用低能N+離子注入技術(shù)和常壓室溫等離子誘變技術(shù)誘變選育得到的高產(chǎn)堿性蛋白酶的克勞氏芽孢桿菌，本方法有效提高克勞氏芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的能力。所述克勞氏芽孢桿菌具體為克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)L-7。該菌株已于2016年9月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCCNo.12953。所述克勞氏芽孢桿菌L-7經(jīng)：出發(fā)菌株篩選→N+離子注入誘變→誘變后平板初篩(高產(chǎn))→搖瓶復(fù)篩(高產(chǎn))→常溫室壓等離子誘變→平板初篩(高產(chǎn))→搖瓶復(fù)篩(高產(chǎn))→傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)等步驟篩選獲得。所述克勞氏芽孢桿菌L-7發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法如下：(1)種子培養(yǎng)：從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的克勞氏芽孢桿菌L-7接入種子培養(yǎng)液中，200r/min，34℃培養(yǎng)12h；(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：按照5％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量70％(發(fā)酵培養(yǎng)基)，溫度：34℃；轉(zhuǎn)速：100～600r/min；通風(fēng)量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧維持在20～30％；發(fā)酵過程中自動流加氨水及20％(v/v)的鹽酸，使發(fā)酵液pH值維持在7.0；發(fā)酵時(shí)間50-60h；所述種子培養(yǎng)基為(g/L)：酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，K2HPO418，pH自然；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：酵母浸粉17，棉籽餅粉30，麥芽糊精100，檸檬酸鈉3，氯化鈣2.6，K2HPO418，pH自然?？藙谑涎挎邨U菌L-7所產(chǎn)堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)如下：(1)所述堿性蛋白酶的最適作用溫度為40℃；(2)所述堿性蛋白酶的最適作用pH為11；(3)所述堿性蛋白酶的酶活性：堿性蛋白酶的搖瓶酶活力的最大值達(dá)79000U/mL，較出發(fā)菌株提高了51.9％，60T規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達(dá)到88000U/mL；(4)pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性：在pH6～12、40℃保溫1h，殘余酶活為86％以上；在40～50℃、pH11保溫1h，殘余酶活在74％以上，具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。有益效果：1、本發(fā)明中誘變獲得的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株是由克勞氏芽孢桿菌在經(jīng)過低能N+離子注入誘變的基礎(chǔ)上，再經(jīng)過常壓室溫等離子誘變而得的堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，有效地提高了菌株的產(chǎn)酶能力，其堿性蛋白酶的搖瓶發(fā)酵酶活力最大值達(dá)到79000U/mL，較出發(fā)菌株提高了51.9％，60T規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達(dá)到88000U/mL，可降低生產(chǎn)成本，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。2、本發(fā)明中，由篩選的菌株發(fā)酵獲得的堿性蛋白酶的最適作用pH為11，最適作用溫度為40℃，大大提高了酶的最適pH，增加了酶的使用范圍。3、本發(fā)明的堿性蛋白酶在pH6～12、40℃保溫1h，殘余酶活為86％以上；在40～50℃、pH11保溫1h，殘余酶活在74％以上，具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。附圖說明圖1為本發(fā)明N+離子注入對菌株存活率的影響曲線；圖2為本發(fā)明N+離子注入對菌株突變及正突變率的影響；圖3為本發(fā)明等離子誘變對菌株存活率的影響曲線；圖4為本發(fā)明等離子誘變對菌株突變率及正突變率的影響；圖5為本發(fā)明經(jīng)低能N+離子注入技術(shù)和常壓室溫等離子體誘變技術(shù)得到的堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株L-7的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶曲線；圖6為本發(fā)明堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株L-7的60T發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線；圖7為本發(fā)明堿性蛋白酶電泳圖；其中，A.Marker，B.純化后堿性蛋白酶蛋白，C.發(fā)酵液；圖8為本發(fā)明堿性蛋白酶在不同pH下的相對酶活；圖9為本發(fā)明堿性蛋白酶在不同溫度下的相對酶活；圖10為本發(fā)明堿性蛋白酶在不同pH下40℃保溫1h后的殘余酶活；圖11為本發(fā)明堿性蛋白酶在pH11下、40、50、60℃分別保溫2h的殘余酶活。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例所用培養(yǎng)基：(1)保藏/活化培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏8，酵母浸粉2，多聚蛋白胨5，NaCl2，瓊脂17，酪蛋白4，K2HPO418，pH自然。(2)種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，K2HPO418，pH自然。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉17，棉籽餅粉30，麥芽糊精100，檸檬酸鈉3，氯化鈣2.6，K2HPO418，pH自然。(4)牛奶培養(yǎng)基(g/L)：脫脂奶粉100，瓊脂20，pH自然。實(shí)施例1、菌種誘變1、出發(fā)菌株的篩選從斜面(由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得)上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的克勞氏芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)液(種子培養(yǎng)基)中，于34℃、200r/min培養(yǎng)12h，然后涂布到固體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基添加1％瓊脂)中，在34℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，從中挑取20個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接入斜面，再將這20個(gè)斜面菌株接到種子培養(yǎng)基中，每瓶(50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)接種一個(gè)單菌落，200r/min，34℃培養(yǎng)12h，觀察菌液變渾濁、無異味后按2％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。34℃，200r/min，擋板三角瓶(50mL發(fā)酵培養(yǎng)基/250mL擋板三角瓶)中振蕩培養(yǎng)50h，將發(fā)酵液離心后，以福林酚法測定粗酶液活力，結(jié)果如表1所示。表1原始菌株的酶活原始出發(fā)菌株經(jīng)過復(fù)壯后，菌種發(fā)酵液的酶活平均值為48000U/mL～52000U/mL。測定堿性蛋白酶活力后，選擇酶活較高且較穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株。Y-18最高，為52000U/mL。將上述試驗(yàn)中酶活較高的菌株Y-18進(jìn)行傳代試驗(yàn)，連續(xù)傳代20次考察菌株遺傳性狀的穩(wěn)定性。其結(jié)果為(見表2)：此菌株高產(chǎn)且穩(wěn)定性好，適合作為離子注入誘變的出發(fā)菌株。表2出發(fā)菌株傳代試驗(yàn)結(jié)果2、N+離子注入誘變(1)樣品的前處理：將克勞氏芽孢桿菌出發(fā)菌株Y-18于產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至產(chǎn)芽孢期，取0.1mL芽孢懸液均勻地涂布于無菌平板(種子培養(yǎng)基)上，用無菌風(fēng)吹干后，然后將平板放入低能加速器靶室，靶室抽真空，用能量為30keV的不同劑量的、N+離子束進(jìn)行注入。(2)離子注入條件：注入能量為30keV，靶室真空度為5-6×10-3Kpa，以6s脈沖式注入，間隔為60s，單次注入劑量為1×1014N+ions/cm2；注入劑量分別為5、10、15、20、30、40、50、70、100、200。每個(gè)注入劑量做一個(gè)真空對照。每個(gè)處理及其相應(yīng)的真空對照在離子注入前預(yù)抽真空5min，以消除因真空干燥程度不同可能帶來的影響；(3)樣品的后處理：將經(jīng)過N+離子注入的培養(yǎng)皿和真空對照的培養(yǎng)皿分別用無菌水洗脫制備菌懸液，適當(dāng)稀釋后涂布于活化平板(活化培養(yǎng)基)上，置34℃下培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，用于單菌落的計(jì)數(shù)和存活率的挑選。存活率為經(jīng)N+離子注入處理的存活菌落數(shù)與經(jīng)真空對照處理的存活菌落數(shù)的比值。(4)存活率曲線的繪制：吸取離子注入后的菌懸液1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-1稀釋液；反復(fù)吹吸10-1的稀釋液，使其混合均勻后吸取1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液；按上述程序操作，制備10-3稀釋液；選擇適宜濃度的稀釋液，分別取0.1mL涂布于平皿中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行；于34℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取出計(jì)數(shù)。以注入劑量為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，繪制存活率與注入劑量的關(guān)系曲線。存活率(％)＝N+注入處理菌落數(shù)/真空對照菌落數(shù)×100％。其結(jié)果為(見圖1)：在N+離子注入劑量達(dá)到30×1014N+ions/cm2前，菌株存活率隨N+離子注入劑量的增加而迅速降低；注入劑量超過200×1014N+ions/cm2后，存活率基本為零。當(dāng)N+離子注入劑量在30×1014～50×1014N+ions/cm2范圍內(nèi)時(shí)，菌種的存活率呈現(xiàn)高-低-高的“馬鞍型”變化趨勢，這種特有的變化被認(rèn)為是能量、動量作用下?lián)p傷效應(yīng)和質(zhì)量、電荷作用下的保護(hù)和刺激綜合作用的結(jié)果。(5)N+離子注入對菌株突變率的影響采用初篩法檢測每個(gè)注入劑量下的菌落透明圈直徑與菌落直徑之比變化情況，規(guī)定透明圈直徑大于對照株5％的突變株稱為正突變，小于5％的為負(fù)突變，±5％之間為未突變。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著離子注入劑量的增加，菌株突變率隨之增加；注入劑量在30×1014～50×1014N+ions/cm2范圍內(nèi)菌株的正突變率較高(22％～26％)，注入劑量超過50×1014N+ions/cm2以后，菌株的突變率繼續(xù)增加，但其正突變率呈降低的趨勢。分析原因，可能是由于低劑量注入后的菌株容易發(fā)生回復(fù)突變，而高劑量使DNA及生物膜等生物大分子的損傷嚴(yán)重造成較高的突變率和較低的正變率。在“馬鞍”區(qū)域內(nèi)，注射劑量適宜，突變率相對較高，正突變率也較高。3、經(jīng)過N+離子注入誘變的高產(chǎn)菌株初次篩選將涂布有菌液的平板在最佳注入劑量下(即N+離子注入劑量為40×1014N+ions/cm2時(shí))進(jìn)行N+離子注入誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂布于初篩平板上。初篩選用雙層平板，下層為發(fā)酵固體培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基添加1％瓊脂)，上層為牛奶培養(yǎng)基，將隨機(jī)挑選的100株菌依次編號H-1—H-100，一一對應(yīng)點(diǎn)接于平板下層培養(yǎng)基；每板點(diǎn)接5株誘變菌，每株菌作一支平行，并點(diǎn)接原始菌做對照，34℃培養(yǎng)48h后，將定量的牛奶培養(yǎng)基均勻傾注于平板上，10℃放置12h，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑之比，挑選比值大于原始菌的突變株。按此方法篩選3輪，初步選定H-3、H-6、H-33、H-66、H-78、H-90六株突變株進(jìn)行復(fù)篩。4、經(jīng)過N+離子注入誘變的高產(chǎn)菌株的再次篩選將初篩篩得的6株菌分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng)基)，以50h酶活力作為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)三次。各個(gè)突變株酶活如表3所示，其中突變株H-6產(chǎn)酶活力最高，達(dá)65000U/mL，比初始菌株提高了25％。表3經(jīng)N+離子注入誘變的堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的復(fù)篩結(jié)果5、堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的確定對突變株H-6連續(xù)傳代5次，以50h發(fā)酵粗酶液活力為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表4所示，傳代五次后，產(chǎn)酶能力保持穩(wěn)定，菌株的優(yōu)良性狀可穩(wěn)定遺傳，突變株H-6即為高產(chǎn)堿性蛋白酶突變菌株。表4H-6遺傳穩(wěn)定性酶活力(U/mL)相對酶活(％)F165000100F264675±64999.5±0.8F364935±45699.9±0.6F465845±828101.3±1.0F566300±729102.0±0.96、等離子誘變(1)樣品的前處理：將經(jīng)過N+離子注入誘變篩選的高產(chǎn)突變菌株H-6于產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至產(chǎn)芽孢期，將高產(chǎn)突變菌株H-6的新鮮菌液制成芽孢懸液后分散均勻，用生理鹽水調(diào)節(jié)芽孢懸液濃度為105-106mL-1。取10uL的芽孢懸液，將其滴加在滅菌冷卻后的載玻片上。(2)等離子誘變條件：將載物臺上的載片放置區(qū)域紫外滅菌30min，將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2mm；打開工作氣體閥門，工作氣體即放電氣體為氦氣；打開外源氣體，外加200V、13.56MHz的射頻電壓，此時(shí)射流溫度為室溫。對樣品進(jìn)行輻照，輻照時(shí)間為80-180s。(3)樣品的后處理：將經(jīng)過誘變后的芽孢用無菌水洗下，適當(dāng)稀釋后涂布于活化平板(活化培養(yǎng)基)上，置34℃下培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，用于單菌落的計(jì)數(shù)和存活率的挑選。存活率為經(jīng)等離子誘變后的存活菌落數(shù)與誘變前的存活菌落數(shù)的比值。(4)存活率曲線的繪制：吸取等離子誘變后的芽孢懸液1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-1稀釋液；反復(fù)吹吸10-1的稀釋液，使其混合均勻后吸取1mL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液；按上述程序操作，制備10-3稀釋液；選擇適宜濃度的稀釋液，分別取0.1mL涂布于平皿中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行；于34℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取出計(jì)數(shù)。以誘變時(shí)間為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，繪制存活率與誘變時(shí)間的關(guān)系曲線。存活率(％)＝等離子誘變處理后菌落數(shù)/處理前菌落數(shù)×100％。其結(jié)果為(見圖3)：在ARTP照射時(shí)間達(dá)到120s前，菌株存活率隨ARTP照射時(shí)間的增加而迅速降低；照射時(shí)間超過180s后，存活率基本為零。當(dāng)ARTP照射時(shí)間在120～160s范圍內(nèi)時(shí)，菌種的存活率呈現(xiàn)高-低-高的“馬鞍型”變化趨勢。(5)等離子誘變對菌株突變率的影響采用初篩法檢測ARTP不同照射時(shí)間下的菌落透明圈直徑與菌落直徑之比變化情況，規(guī)定透明圈直徑大于對照株5％的突變株稱為正突變，小于5％的為負(fù)突變，±5％之間為未突變。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著ARTP照射時(shí)間的增加，菌株突變率隨之增加；照射時(shí)間在120-160s范圍內(nèi)菌株的正突變率較高(18％～26％)，照射時(shí)間140s以后，菌株的突變率繼續(xù)增加，但其正突變率呈降低的趨勢。分析原因，可能是由于照射時(shí)間過長后的菌株容易發(fā)生回復(fù)突變，而長時(shí)間的等離子照射使DNA及生物膜等生物大分子的損傷嚴(yán)重造成較高的突變率和較低的正變率。在“馬鞍”區(qū)域內(nèi)，ARTP照射時(shí)間適宜，突變率相對較高，正突變率也較高。最終確定最佳的ARTP照射時(shí)間為140s。7、高產(chǎn)突變株H-6再經(jīng)過等離子誘變后的雙重突變高產(chǎn)菌株的初次篩選將高產(chǎn)突變株H-6的菌懸液在最佳ARTP照射時(shí)間(即ARTP照射時(shí)間為140s時(shí))誘變處理，適當(dāng)稀釋后涂布于初篩平板(活化培養(yǎng)基)上。初篩選用雙層平板，下層為發(fā)酵固體培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)，上層為牛奶培養(yǎng)基，將隨機(jī)挑選的100株菌依次編號L-1—L-100，一一對應(yīng)點(diǎn)接于平板下層培養(yǎng)基；每板點(diǎn)接5株誘變菌，每株菌作一支平行，并點(diǎn)接原始菌做對照，34℃培養(yǎng)48h后，將定量的牛奶培養(yǎng)基均勻傾注于平板上，10℃放置12h，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑之比，每板挑選2個(gè)比值大于原始菌的突變株。按此方法篩選3輪，初步選定L-2、L-7、L-32、L-65、L-77、L-89六株突變株進(jìn)行復(fù)篩。8、雙重突變高產(chǎn)菌株的再次篩選將初篩篩得的6株菌分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng)基)，以50h酶活力作為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)三次。各個(gè)突變株酶活如表5所示，其中突變株L-7產(chǎn)酶活力最高，達(dá)79000U/mL，比初始菌株提高了51.9％。表5經(jīng)過雙重誘變后的堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的復(fù)篩結(jié)果9、堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的確定對以上誘變試驗(yàn)中篩選得到的高產(chǎn)雙重突變株進(jìn)行連續(xù)傳代試驗(yàn)，測其酶活力，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，篩選到可以最終應(yīng)用于生產(chǎn)上的菌株。對突變株L-7連續(xù)傳代5次，以50h發(fā)酵粗酶液活力為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表6所示，傳代五次后，產(chǎn)酶能力保持穩(wěn)定，這與報(bào)道的經(jīng)過離子注入誘變和等離子誘變后，菌株的優(yōu)良性狀可穩(wěn)定遺傳相一致，突變株L-7即為高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株。表6L-7遺傳穩(wěn)定性酶活力(U/mL)相對酶活(％)F179000100F278642±64999.5±0.8F378914±45699.9±0.6F480006±828101.3±1.0F580552±729102.0±0.9實(shí)施例2、堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株搖瓶水平發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的克勞氏芽孢桿菌L-7接入種子培養(yǎng)基中(50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培養(yǎng)12h，2％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，34℃，200r/min，擋板三角瓶(50mL發(fā)酵培養(yǎng)基/250mL擋板三角瓶)中振蕩培養(yǎng)，每間隔一定時(shí)間后，將發(fā)酵液離心，以福林酚法測定粗酶液活力，結(jié)果附圖5所示。實(shí)施例3、堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株60T發(fā)酵罐發(fā)酵工藝從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的克勞氏芽孢桿菌L-7接入種子培養(yǎng)液中(100mL種子培養(yǎng)基/500mL擋板三角瓶)，200r/min，34℃培養(yǎng)12h，按照5％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入60T發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量70％(發(fā)酵培養(yǎng)基)。溫度：34℃；轉(zhuǎn)速：300r/min；通風(fēng)量：1∶1.5；溶氧維持在25％。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20％(v/v)的鹽酸，使發(fā)酵液pH值維持在7.0。采用該工藝連續(xù)發(fā)酵三批，如附圖6所示，發(fā)現(xiàn)在該流加工藝控制工藝下，30h以后，堿性蛋白酶大量合成，到達(dá)55h時(shí)，酶活力最高88000U/mL。54h以后，產(chǎn)酶速度變慢，活力下降，很快菌體進(jìn)入消亡期，同時(shí)pH值迅速上升。如附圖7所示，SDS-PAGE蛋白電泳表明純化后的樣品己達(dá)到電泳純，分子量為28kDa。實(shí)施例4、對酶的性質(zhì)進(jìn)行研究(1)酶活測定①堿性蛋白酶活力的測定以輕工業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)QB/T1803-93(Folin試劑顯色法)：1毫升酶液在40℃，pH11，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1μg酪氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制不同濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、10、20、30、40、50、60μg/mL)。取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL，加0.4mol/L的碳酸鈉溶液5.00ml、福林試劑溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中顯色20min。取出，用分光光度計(jì)分別測定其吸光度A680(以不含酪氨酸的管為空白)。以吸光度A680為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(此線應(yīng)通過零點(diǎn))。③測定步驟(1)將發(fā)酵液8000r/min離心10min，取上清液以硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度，作為待測酶液。(2)將酪素、三氯乙酸溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min。(3)按下列程序操作：④酶活計(jì)算方法X＝A×K×4/10×n＝0.4×A×K×nX—樣品的酶活力，u/mLA—樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度K—吸光常數(shù)4—反應(yīng)試劑的總體積，mLn—稀釋倍數(shù)(2)酶的純化工藝：取發(fā)酵液100ml，8000r/min離心10min。取上清液，以飽和度70％的固體硫酸按進(jìn)行鹽析，8000r/min離心10min收集沉淀。將沉淀溶于Tris-HCI(pH8.8)緩沖液中，在相同的緩沖液中進(jìn)行透析除鹽。離心除去少量不溶物，取上清液過DEAE-SepharoseCL-6B離子交換柱進(jìn)行純化，以20mMTris-Hcl(pH8.8，含10mMNacl)緩沖液進(jìn)行洗脫。堿性蛋白酶未被吸附，先被洗脫下來，得到無色透明的液體。收集酶液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純酶粉進(jìn)行進(jìn)一步分析。(3)酶學(xué)性質(zhì)研究以酪蛋白為底物，以輕工業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)QB/T1803-93(Folin試劑顯色法)，即福林(Folin)法；分別研究該堿性蛋白酶的最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。測定最適pH：在40度條件下，分別測定堿性蛋白酶在pH5、6、7、8、9、10、11、12、13下的相對酶活(附圖8)。測定最適溫度：在pH11的條件下，分別測定堿性蛋白酶在30、40、50、60、70、80、90℃下的相對酶活(附圖9)。測定pH穩(wěn)定性：將酶液于pH5、6、7、8、9、10、11、12、13和40℃條件下保溫1h后，在最適溫度和最適pH條件下測定殘余酶活(附圖10)；殘余酶活是指在不同pH和40℃條件下保溫后的酶液在最適條件下測定的酶活值，相對于酶液在不保溫時(shí)在最適條件下測定的酶活值的百分?jǐn)?shù)。測定溫度穩(wěn)定性：將酶液于40、50、60℃和pH11的條件下保溫2h后，在最適溫度和最適pH條件下測定殘余酶活(附圖11)；殘余酶活是指在不同溫度和pH11條件下保溫后的酶液在最適條件下測定的酶活值，相對于酶液在不保溫時(shí)在最適條件下測定的酶活值的百分?jǐn)?shù)。結(jié)論：由圖8可知：該酶的最適作用pH為11；由圖9可知：該酶的最適作用溫度為40℃；由圖10可知：該酶在pH6～12的范圍內(nèi)穩(wěn)定；由圖11可知：該酶在40～50℃左右有較好的熱穩(wěn)定性。當(dāng)前第1頁1 2 3