本發(fā)明涉及生物酶，特別是一種產(chǎn)木聚糖酶的菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木聚糖酶（1,4-β-d-xylanase:ec3.2.1.8）是一種重要的工業(yè)用酶，在分解木聚糖時(shí)起生物催化作用，可以將木聚糖分解成多糖或單糖的蛋白質(zhì)或rna。木聚糖酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生木聚糖酶。

木聚糖酶包括內(nèi)切1.3-β-木聚糖酶（ec3.2.1.32），內(nèi)切1.4-β-木聚糖酶（ec3.2.1.8），木聚糖1.3-β-木糖苷酶（ec3.2.1.72），木聚糖1.4-β-木糖苷酶（ec3.2.1.37）和乙酰木聚糖酯酶（ec3.1.1.6）五種。內(nèi)切型木聚糖酶水解木聚糖生成木寡糖和木糖，外切型木聚糖酶水解木寡糖，由非還原末端切除木糖殘基。木聚糖酶(1,4-β-d-xylanase；ec3.2.1.8)是一種重要的工業(yè)用酶，在造紙工業(yè)、食品、飼料和能源等領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。木聚糖酶在造紙工業(yè)上可作為紙漿漂白助劑，可以提高紙張的白度和強(qiáng)度，減少傳統(tǒng)氯化物漂白劑的實(shí)用；在動(dòng)物飼料中添加木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率；在食品工業(yè)上，木聚糖酶還可以用于澄清果汁飲料，改良面包松軟度。利用木聚糖酶降解木聚糖還可以得到低聚木糖，低聚木糖可以促進(jìn)人體大腸中益生菌的增殖，改善腸道功能。自然界中，不同來源的木聚糖酶的酶活特性有很大的差異，有著各自特異的最適反應(yīng)ph和最適作用溫度。但是，多數(shù)木聚糖酶最適反應(yīng)ph值在4.0～6.0，較窄的最適反應(yīng)ph限制了木聚糖酶在工業(yè)上的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種產(chǎn)木聚糖酶的菌株及其應(yīng)用，可有效解決木聚糖酶的生產(chǎn)，以滿足工業(yè)上的需要問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種產(chǎn)木聚糖酶的菌株分類命名為橘綠木霉（trichodermacitrinoviride）hl28-5，保藏號(hào)：cgmccno.11861，保藏日期：2015年12月11日，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；該菌株有效應(yīng)用于生產(chǎn)木聚糖酶，其應(yīng)用方法包括以下步驟：

（1）、制備木聚糖酶的發(fā)酵液：

將產(chǎn)木聚糖酶的菌株接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得木聚糖酶的發(fā)酵液；

（2）、將木聚糖酶的發(fā)酵液離心，得第一次上清液；

（3）、向第一次上清液中緩慢滴加硫酸銨，鹽析過夜，得鹽析液；

（4）、將鹽析液離心，取沉淀，用緩沖液溶解沉淀，得木聚糖酶粗酶液；

（5）、daeff凝膠過濾層析：將木聚糖酶粗酶液裝柱，以緩沖液作為平衡液，進(jìn)行daeff凝膠過濾層析，收集活性組分，得第一次活性成分；

（6）、cm.ff強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析：將第一次活性成分裝柱，以緩沖液作為平衡液，用平衡緩沖液進(jìn)行線性洗脫，收集活性組分，得第二次活性成分；

（7）、octylff疏水相互作用層析：將第二次活性成分中的硫酸銨質(zhì)量濃度調(diào)整至40％，裝柱，以硫酸銨緩沖液作為平衡液線性洗脫，收集活性組分，得第三次活性成分；

（8）、將第三次性成分透析除鹽，冷凍抽干，得到干粉木聚糖酶。

本發(fā)明產(chǎn)木聚糖酶為新的一種菌株橘綠木霉（trichodermacitrinoviride）hl28-5，具有產(chǎn)生木聚糖酶的功效，有效用于制備木聚糖酶，開拓了木聚糖酶生產(chǎn)的新途徑，可有效滿足工業(yè)上對(duì)木聚糖酶的需要，有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。

圖2為本發(fā)明篩選到的trichodermacitrinoviridehl28-5和其18srrna序列最相近的10個(gè)菌種構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。

圖3本發(fā)明中的trichodermacitrinoviridehl28-5生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲圖。

圖4本發(fā)明的高產(chǎn)木聚糖酶的最適作用溫度圖。

圖5本發(fā)明的高產(chǎn)木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性圖。

圖6本發(fā)明的高產(chǎn)木聚糖酶最適作用ph圖。

圖7本發(fā)明的高產(chǎn)木聚糖酶ph穩(wěn)定性圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種產(chǎn)木聚糖酶的菌株，其篩選是：

（1）、富集培養(yǎng)：

取0.1g朽木，加入到10ml無(wú)菌水中振蕩混勻，然后吸取1ml菌懸液接入到5ml富集培養(yǎng)基中，30℃水浴振蕩培養(yǎng)48h；

所述的富集培養(yǎng)基是酵母粉1g、蛋白胨2g、木聚糖2g和水1l混勻制成；

（2）、透明圈法初篩：

將富集培養(yǎng)的培養(yǎng)物10倍逐級(jí)稀釋，分別取稀釋倍數(shù)為10^-3、10^-5和10^-7的菌懸液各0.5ml涂布于平板篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑取透明圈相對(duì)較大的單菌落進(jìn)行分離純化，接入斜面保藏培養(yǎng)基保存原始菌株；

所述的平板篩選培養(yǎng)基是木聚糖10g、kno31g、mgso40.2g、nacl0.5g、k2hpo40.5g、瓊脂20g和水1l混勻制成；

所述的斜面保藏培養(yǎng)基是馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g和水1l混勻制成；

（3）、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩：

將初篩選到的原始菌株接入100ml基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每組3個(gè)重復(fù)，于30℃，180r/min下培養(yǎng)2-3d，發(fā)酵液離心取上清液，dns分別測(cè)量發(fā)酵液木聚糖酶酶活；

所述的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基是麩皮4.0g，蛋白胨0.5g，k2hpo40.5g和水1l混勻制成；

（4）、菌種鑒定：

根據(jù)其18srdna序列比對(duì)，選出與其序列最相近的13株已知菌種，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），鑒定該產(chǎn)木聚糖酶酶活力最高的菌種為橘綠木霉trichodermacitrinoviridehl28-5，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（cgmccno.11861），保藏日期：2015年12月11日，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；

該菌株有效應(yīng)用于生產(chǎn)木聚糖酶，其應(yīng)用方法包括以下步驟：

（1）、制備木聚糖酶的發(fā)酵液：

按質(zhì)量2%的接種量將產(chǎn)木聚糖酶的菌株接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180rpm搖瓶培養(yǎng)48h，得木聚糖酶的發(fā)酵液；

所述的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基是由重量計(jì)的：麩皮10g，木聚糖2g，蛋白胨6g，酵母粉1.5g，(nh4)2so41.5g，cacl20.3g，mgso40.3g，kh2po40.3g和feso40.005g和水1000ml混勻制成；

（2）、將木聚糖酶的發(fā)酵液4℃下、8000rpm、離心10min，取上清液；

（3）、向上清液中緩慢滴加硫酸銨，使硫酸銨的質(zhì)量含量達(dá)到80%，4℃下，鹽析過夜8-12h，得鹽析液；

（4）、將鹽析液4℃下、8000rpm離心10min，取沉淀，用ph7.0的tris-hcl緩沖液溶解沉淀，得到木聚糖酶粗酶液；

（5）、daeff凝膠過濾層析：將木聚糖酶粗酶液裝柱，柱型1ml，將ph8.0的0.02mol/ltris-hcl緩沖液作為平衡液，流速：1ml/min進(jìn)行daeff凝膠過濾層析，收集活性組分，得第一次活性成分；

（6）、cm.ff強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析：將第一次活性成分裝柱，柱型1ml，將ph8.0的0.02mol/ltris-hcl緩沖液作為平衡液，流速：1ml/min，用1.0mnacl的平衡緩沖液進(jìn)行線性洗脫，收集活性組分，得第二次活性成分；

（7）、octylff疏水相互作用層析：將第二次活性成分中的硫酸銨質(zhì)量濃度調(diào)整至40％，裝柱，進(jìn)行疏水相互作用層析，柱型1ml，ph8.0、含40％飽和度硫酸銨的0.02mol/l硫酸銨緩沖液作為平衡液，流速：1ml/min，用1m的硫酸銨線性洗脫，收集活性組分，得第三次活性成分；

（8）、透析除鹽：將第三次性成分轉(zhuǎn)入裝有20mmol/ltris-hcl緩沖液1l的透析袋中，透析過夜除鹽，透析袋截留分子量為3500u，然后冷凍抽干，得干粉木聚糖酶。

本發(fā)明菌株是一種新的菌株，具有高產(chǎn)木聚糖酶之功效，有效用于生產(chǎn)木聚糖酶，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)取得了非常好的有益技術(shù)效果，有關(guān)資料如下：

所述的高產(chǎn)木聚糖酶的菌株是從腐朽的木頭里面分離得到的，通過考察其形態(tài)特征、生理生化特征和18srrna序列特征對(duì)比，篩選出與其序列最接近的13株已知菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示，鑒定為橘綠木霉（trichodermacitrinoviride），命名為hl28-5，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.11861。其制備的木聚糖酶的相對(duì)分子量為34.8kda，木聚糖酶的最適作用溫度為50℃，木聚糖酶的最適作用ph7.0。

18srrna序列：

gagaatccggggttcactccaacccaatgtgaacgttaccaatctgttgcctcggcggga60

ttctctgccccgggcgcgtcgcagccccggatcccatggcgcccgccggaggaccaactc120

aaactcttttttctctccgtcgcggcctacgtcgcggctctgttttatttttgctctgag180

cctttctcggcgaccctagcgggcgtctcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatc240

tcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga300

attcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcat360

gcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcgg420

cccctcaccgggccgcccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcag480

tagtttgcacactcgcaccgggagcgcggcgcggccacagccgtaaaacaccccaaactc540

tgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaaaggcg600

gaggaa606

實(shí)驗(yàn)1

木聚糖酶酶活測(cè)定：180μl含1％木聚糖的底物，加入20μl適當(dāng)稀釋的酶液，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min后加入200μl3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，dns）試劑溶液終止反應(yīng)，沸水煮5min顯色，迅速冷卻至室溫后補(bǔ)加2.1ml水，然后于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定od值。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出反應(yīng)體系的含糖量。

試驗(yàn)中對(duì)木聚糖酶活力單位的定義為：在50℃，ph7.0條件下，每分鐘水解木聚糖酶1μmol還原糖（以木糖計(jì)）所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（1u）。

iu＝d×r/10min×0.1ml

式中：d為酶液稀釋倍數(shù)；r為回歸方程計(jì)算出的木糖含量。

將木聚糖酶進(jìn)行sds-page分析，得到單一條帶，并經(jīng)酶譜分析確定其具有木聚糖酶活性，達(dá)到電泳純。

實(shí)驗(yàn)2：木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

該木聚糖酶相對(duì)分子量的確定

將發(fā)酵得到的粗酶液及純化后的木聚糖酶分別進(jìn)行sds-page，分析得到其相對(duì)分子量約為34.8kda。

實(shí)驗(yàn)3：溫度對(duì)酶活力的影響

(1)分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，ph7.0條件下測(cè)定該純化后木聚糖酶的酶活力，重復(fù)3次，取平均值,計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力。

結(jié)果如圖4所示，其最適作用溫度為50℃。

(2)該木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將該純化后木聚糖酶酶液分別置于不同溫度

(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、ph為7.0的條件下，保溫2h，每隔30min取樣測(cè)酶活，計(jì)算各自的殘余酶活力，將最初酶液的酶活力定為100％。結(jié)果如圖5，在低于50℃的范圍內(nèi)，該酶的溫度穩(wěn)定性都較好，其相對(duì)木聚糖酶活力變化不大，而當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，該酶的溫度穩(wěn)定性變差，其相對(duì)酶活力迅速下降。

實(shí)驗(yàn)4：ph對(duì)酶活力的影響

(1)、該木聚糖酶最適作用ph的測(cè)定：在不同ph(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，溫度為50℃的條件下測(cè)定該純化后木聚糖酶的酶活力，以最高酶活力為100％，計(jì)算不同ph下的相對(duì)酶活力。

結(jié)果如圖6所示，其最適作用ph為7.0。

(2)、該木聚糖酶的ph穩(wěn)定性測(cè)定：將該純化后木聚糖酶酶液分別調(diào)至不同ph(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)、溫度50℃條件下，保溫2h后，測(cè)定各自的殘余酶活力，將其中最高酶活力定為100％。結(jié)果如圖7所示，該酶在ph5.0-10.0內(nèi)穩(wěn)定性較好。

由上述可以看出，本發(fā)明提供了產(chǎn)木聚糖酶的菌株，經(jīng)菌種鑒定后，命名為橘綠木霉hl28-5，用于生產(chǎn)木聚糖酶，并對(duì)純化后的木聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)測(cè)定，相對(duì)分子量為34.8kda，最適作用溫度及ph分別為50℃和7.0；在30℃～50℃和ph5.0-11.0范圍內(nèi)酶活保持相對(duì)穩(wěn)定，質(zhì)量好，可有效用于造紙、食品和飼料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，應(yīng)用范圍廣，是木聚糖酶生產(chǎn)上的創(chuàng)新，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。

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<110>河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司

<120>一種產(chǎn)木聚糖酶的菌株及其應(yīng)用

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