本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及重組菌株及其構(gòu)建方法與在產(chǎn)菜油甾醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甾體激素類藥物是僅次于抗生素的第二類藥物，在治療呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、淋巴性白血病、風(fēng)濕病等方面有廣泛應(yīng)用。菜油甾醇作為甾體激素類藥物的重要前體，對于眾多甾體激素類藥物如糖皮質(zhì)激素、性激素等的合成有重大應(yīng)用。傳統(tǒng)菜油甾醇的制備多采用植物提取的方式，該方法操作過程繁瑣、收率低、有機物污染嚴(yán)重，極大地限制了菜油甾醇進(jìn)一步的生產(chǎn)和應(yīng)用。

利用微生物合成的方式成本較低、產(chǎn)量高、污染小且產(chǎn)品安全性有效保證，被認(rèn)為是一種有前途的生產(chǎn)方法。菜油甾醇屬于一種萜烯類物質(zhì)，在耶氏解脂酵母體內(nèi)萜烯類物質(zhì)的合成均需要一種重要前體——乙酰輔酶a(acetyl-coa)。在耶氏解脂酵母內(nèi)，當(dāng)以碳水化合物(如葡萄糖)為碳源時，胞內(nèi)乙酰coa主要由丙酮酸通過到乙醛再到乙酸，再由乙酰輔酶a合成酶(acetyl-coasynthetase,acs)催化合成，或者由線粒體穿梭到胞質(zhì)中的檸檬酸在檸檬酸裂解酶(atp-citratelyase，acl)催化下提供；而當(dāng)以疏水性物質(zhì)(如油)為碳源時，胞內(nèi)乙酰coa主要經(jīng)過油脂的β氧化過程再由acl催化提供，生成的乙酰coa經(jīng)過mva路徑合成下游萜烯類物質(zhì)。在釀酒酵母體內(nèi)，提高胞質(zhì)乙酰coa的合成被證明為一種提高萜烯類物質(zhì)的有效手段。在耶氏解脂酵母內(nèi)通過引入釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)來源的acs及小鼠(musmusculus)來源的acl可以使乙酰coa含量分別提高131.2％和144.2％，隨之α-酮戊二酸產(chǎn)量從36.3g/l分別提高到42.2g/l和46.7g/l。然而，胞內(nèi)的乙酰coa除了合成萜烯類物質(zhì)，還作為前體用于脂肪酸的合成，進(jìn)而形成脂滴，而形成的脂滴對于萜烯類弱極性物質(zhì)提供儲存作用，從而避免與細(xì)胞膜結(jié)合造成膜毒性，因此，萜烯的與脂肪酸的合成既存在競爭作用又具有聯(lián)動性。

在此基礎(chǔ)上提高耶氏解脂酵母體內(nèi)的萜烯類目標(biāo)產(chǎn)物積累可利用兩種乙酰coa代謝流，一方面耶氏解脂酵母胞質(zhì)內(nèi)的乙酰coa競爭性地分配到萜烯合成或脂肪酸合成：在mva路徑限速酶hmgr催化下進(jìn)入萜烯合成，在脂肪酸合成關(guān)鍵酶蘋果酸酶(malicenzyme,mae)催化下進(jìn)入脂肪酸合成；另一方面脂滴中脂肪酸氧化重新形成胞質(zhì)乙酰coa用于萜烯或脂肪酸的積累，耶氏解脂酵母酵母的脂肪酸β氧化包含四步：第一步為限速步驟，不同鏈長脂肪酸由六種酯酰輔酶a氧化酶(acyl-coaoxidases)pox1～pox6催化，第二步和第三步由多功能酶(multifunctionalenzyme,mfe)催化，不飽和acyl-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基酯酰coa(3-hydroxyacyl-coa)再轉(zhuǎn)化為3-酮基酯酰coa(3-ketoacyl-coa)，最后一步由過氧化物體酮基酯酰coa硫解酶(peroxisomalketoacyl-coathiolase,pot)催化形成少2個碳的acyl-coa及acetyl-coa，acetyl-coa進(jìn)入tca循環(huán)。

因此如何調(diào)節(jié)兩種代謝流間的平衡是提高耶氏解脂酵母內(nèi)萜烯積累的關(guān)鍵點，而對于耶氏解脂酵母的代謝流的調(diào)節(jié)與平衡目前還沒有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供重組菌株及其構(gòu)建方法與在產(chǎn)菜油甾醇中的應(yīng)用。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)萜烯合成與脂肪酸氧化代謝流來實現(xiàn)菜油甾醇在耶氏解脂酵母體內(nèi)產(chǎn)量的提高。

本發(fā)明提供的重組菌株，表達(dá)dhcr7基因且erg5基因失活；所述dhcr7基因的序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明提供的重組菌株還過表達(dá)乙酰coa代謝相關(guān)基因；

所述乙酰coa代謝相關(guān)基因選自hmgr基因、acl基因、pox2基因、pox4基因、pox5基因或pox6基因。

本發(fā)明提供的重組菌株的底盤菌為耶氏解脂酵母。

本發(fā)明采用的耶氏解脂酵母為野生型耶氏解脂酵母atcc201249。

本發(fā)明提供的重組菌株的基因型為：

erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-hmgr-xpr2t；

erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-acl-xpr2t；

erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-pox2-xpr2t；

erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-pox4-xpr2t；

erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-pox5-xpr2t；

或erg5::-exp1p-drdhcr7-xpr2tpbr322::hp4d-pox6-xpr2t。

本發(fā)明提供的重組菌株中，dhcr7基因的插入位點位于erg5基因內(nèi)。其以exp1p為啟動子，xpr2t為終止子。另外添加gpm1t終止子加強終止效果。

本發(fā)明提供的重組菌株中，乙酰coa代謝相關(guān)基因的插入位點位于基因組的pbr322platform位置。其中，插入的乙酰coa代謝相關(guān)基因hp4d為啟動子、xpr2t為終止子。

本發(fā)明還提供了保藏編號為cgmccno.14039的重組菌株。

本發(fā)明對構(gòu)建獲得的，基因型為erg5::exp1p-dhcr7(daniorerio)-xpr2tpbr322::hp4d-pox2-xpr2t的菌株進(jìn)行了生物保藏，保藏編號為cgmccno.14039。

本發(fā)明提供的重組菌株在生產(chǎn)菜油甾醇的應(yīng)用。

本發(fā)明利用重組耶氏解脂酵母底盤菌株通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)乙酰coa合成與脂肪酸合成的代謝流提高菜油甾醇產(chǎn)量，以本發(fā)明提供的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)菜油甾醇，產(chǎn)量可達(dá)941.5mg/l。

本發(fā)明提供的重組菌株的一級、二級種子培養(yǎng)基包括水和22g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨和10g/l酵母浸粉。

本發(fā)明提供的重組菌株的三級種子、發(fā)酵培養(yǎng)基包括水和3.7％v/v葵花籽油、20g/l蛋白胨和10g/l酵母浸粉。

本發(fā)明所述重組菌株的構(gòu)建方法，包括：

以耶氏解脂酵母為底盤菌，將所述dhcr7基因整合至底盤菌基因組并使其內(nèi)源erg5基因失活，制得中間菌株；

在所述中間菌株的基因組中，插入乙酰coa代謝相關(guān)基因，獲得重組菌株；

所述乙酰coa代謝相關(guān)基因選自hmgr基因、acl基因、pox2基因、pox4基因、pox5基因或pox6基因。

中間菌株的構(gòu)建包括：將外源dr_dhcr7基因用goldengate方法構(gòu)建入puc57k-eno2t-exp1p-xpr2t-gpm1t(可在http://synbioml.org/免費獲取)質(zhì)粒獲得dr_dhcr7的puc57k-eno2t-exp1p-dr_dhcr7-xpr2t-gpm1t；經(jīng)noti酶切后獲得外源功能基因表達(dá)盒eno2t-exp1p-dr_dhcr7-xpr2t-gpm1t。

質(zhì)粒peasy-blunt-erg5(700)-ura-eno2t(構(gòu)建過程參見《engineeringyarrowialipolyticaforcampesteroloverproduction》haoxingdu，wenhaixiao,等發(fā)表于plosone,jan2016)與質(zhì)粒peasy-blunt-gpm1t-erg5(670)(構(gòu)建過程參見《engineeringyarrowialipolyticaforcampesteroloverproduction》haoxingdu，wenhaixiao,等發(fā)表于plosone,jan2016)經(jīng)noti酶切后獲得基因組erg5位置上游整合片段erg5(700)-ura-eno2t和下游整合片段gpm1t-erg5(670)。

采用醋酸鋰法將上述獲得的所有整合片段(外源功能基因表達(dá)盒、上游整合片段、下游整合片段)共轉(zhuǎn)化到野生型耶氏解脂酵母atcc201249底盤菌株中，采用sc-ura固體平板進(jìn)行篩選、經(jīng)鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子，為中間菌株。

乙酰coa代謝相關(guān)基因的插入采用單拷貝整合型質(zhì)粒pina1269作為載體，基因構(gòu)建入載體的方法采用in-fusion組裝方法。整合型質(zhì)粒構(gòu)建入中間菌株的方式采用醋酸鋰法，以sc-ura-leu固體平板進(jìn)行篩選、經(jīng)鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子，為重組菌株。

中間菌株和重組菌株的鑒定采用菌落pcr的方式。

本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)菜油甾醇的方法，以植物油為碳源，發(fā)酵本發(fā)明提供的重組菌株，制得含有菜油甾醇的發(fā)酵液。

在本發(fā)明中，發(fā)酵采用流加碳源的方式，植物油的濃度不大于2g/l。

在本發(fā)明中，植物油為葵花籽油。

在本發(fā)明中，發(fā)酵的溫度為28℃，ph值為5.5，容氧量>30％、通氣量為1vvm。

本發(fā)明中，發(fā)酵制得含有菜油甾醇的發(fā)酵液后，還包括菜油甾醇的提取，方法包括：

將發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次；

用液氮冷凍細(xì)胞、破碎后，加入甲醇配制的1.5mol/lkoh，60℃皂化反應(yīng)8h～12h；

皂化后加入正己烷(與甲醇的體積比為1：1)渦旋震蕩10min后，5000rpm離心10min，收集有機相進(jìn)行真空冷凍干燥；

然后加入衍生化試劑n-甲基-n-三甲基硅基三氟乙酰胺(mstfa)30℃孵育2小時。

本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)dhcr7基因且erg5基因失活的重組菌株，該菌株還過表達(dá)乙酰coa代謝相關(guān)基因，該重組耶氏解脂酵母底盤菌株通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)乙酰coa合成與脂肪酸合成的代謝流提高菜油甾醇產(chǎn)量，實驗表明，經(jīng)工藝優(yōu)化，本發(fā)明提供重組菌株的菜油甾醇產(chǎn)量可達(dá)941.5mg/l。

生物保藏說明

sybe_yl02060069，分類命名：解脂耶羅維亞酵母yarrowialipolytica，于2017年04月17日保藏在保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。保藏編號為cgmccno.14039。

附圖說明

圖1示菜油甾醇合成關(guān)鍵基因dr_dhcr7基因組整合示意圖；

圖2示是合成菜油甾醇耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056與目前最高產(chǎn)耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060028產(chǎn)量比較圖；

圖3示過表達(dá)內(nèi)源基因的整合型質(zhì)粒構(gòu)建過程圖；

圖4示以葡萄糖為碳源搖瓶產(chǎn)量，其中，圖4-a示以葡萄糖為碳源耶氏解脂酵母中心代謝路徑形成乙酰coa；圖4-b示以葡萄糖為碳源耶氏解脂酵母β氧化形成乙酰coa，圖4-c示以葡萄糖為碳源乙酰coa分配；圖4-d示以葡萄糖為碳源搖瓶發(fā)酵菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4-e示以葡萄糖為碳源乙酰coa代謝相關(guān)基因；

圖5示葵花籽油為碳源搖瓶產(chǎn)量，其中，圖5-a示以葵花籽油為碳源耶氏解脂酵母中心代謝路徑形成乙酰coa；圖5-b示以葵花籽油為碳源耶氏解脂酵母β氧化形成乙酰coa，圖5-c示以葵花籽油為碳源乙酰coa分配；圖5-d示以葵花籽油為碳源搖瓶發(fā)酵菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5-e示以葵花籽油為碳源乙酰coa代謝相關(guān)基因；

圖6示發(fā)酵罐中重組耶氏解脂酵母發(fā)酵曲線圖，其中，圖6-a示發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)生菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6-b示過表達(dá)acl基因的菌株發(fā)酵曲線；圖6-c示過表達(dá)pox2基因的菌株發(fā)酵曲線；圖6-d示過表達(dá)hmgr基因的菌株發(fā)酵曲線。

具體實施方式

本發(fā)明提供了重組菌株及其構(gòu)建方法與在產(chǎn)菜油甾醇中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實施例高產(chǎn)菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株乙酰coa代謝調(diào)節(jié)與優(yōu)化

本發(fā)明的高產(chǎn)菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株的構(gòu)建及表征方法為：

1、合成菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母的獲得

野生型耶氏解脂酵母菌株體內(nèi)合成的麥角固醇不能向下游甾體激素轉(zhuǎn)化，菜油甾醇在酵母細(xì)胞中的合成需將其內(nèi)源生產(chǎn)麥角固醇的路徑截斷，敲除固醇c-22還原酶(erg5)，同時引入c7位還原酶(dhcr7)基因，即可將代謝流由生成麥角固醇轉(zhuǎn)到菜油甾醇方向。與已報道菜油甾醇最高產(chǎn)量的耶氏解脂酵母構(gòu)建方法一致(如圖1)，選取前期實驗證明表現(xiàn)最好的斑馬魚(daniorerio)來源dhcr7基因，簡寫為dr_dhcr7，經(jīng)耶氏解脂酵母密碼子優(yōu)化并適當(dāng)規(guī)避bsaⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點，在基因兩端額外添加5’端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通過人工合成得到，具體基因序列如seqidno:1所示。

將實驗室中puc57k-eno2t-exp1p-xpr2t-gpm1t質(zhì)粒(可在http://synbioml.org/免費獲取)及獲得的外源dr_dhcr7基因用goldengate方法進(jìn)行構(gòu)建，獲得dr_dhcr7的puc57k-eno2t-exp1p-dr_dhcr7-xpr2t-gpm1t大腸桿菌游離型多拷貝質(zhì)粒。將該質(zhì)粒與實驗室質(zhì)粒peasy-blunt-erg5(700)-ura-eno2t與peasy-blunt-gpm1t-erg5(670)(參見《engineeringyarrowialipolyticaforcampesteroloverproduction》)經(jīng)noti酶切后獲得基因組erg5位置上游整合片段erg5(700)-ura-eno2t，下游整合片段gpm1t-erg5(670)，外源功能基因表達(dá)盒eno2t-exp1p-dr_dhcr7-xpr2t-gpm1t(參見《engineeringyarrowialipolyticaforcampesteroloverproduction》)。采用醋酸鋰法將上述獲得的所有整合片段共轉(zhuǎn)化到野生型耶氏解脂酵母atcc201249底盤菌株中，采用sc-ura固體平板(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖22g/l，缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l，2％的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)后進(jìn)行菌落pcr驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并命名為sybe_yl02060056，菌株基因組基因型為：erg5::ura3-exp1p-dhcr7(daniorerio)-xpr2t。

2、耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056與高產(chǎn)菜油甾醇的耶氏解脂酵母菌株sybe_yl01070028搖瓶產(chǎn)量比較

實驗材料：耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056、sybe_yl01070028

試驗方法：

一級、二級種子培養(yǎng)基：22g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉；

發(fā)酵培養(yǎng)基：50g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉

將菌株sybe_yl02060056和sybe_yl01070028接種于5ml一級種子培養(yǎng)基中，在28℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于二級種子培養(yǎng)基中，在28℃、220rpm培養(yǎng)18h，再以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個實驗組做兩組平行，于28℃、220rpm條件下培養(yǎng)，發(fā)酵148小時結(jié)束，測定菌體密度(od600)，取10ml菌液提取菜油甾醇。

菜油甾醇提取方法：取10ml發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細(xì)胞并在研缽中研磨，直到細(xì)胞被研磨成白色極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至新10ml離心管中，加入2ml甲醇配制的1.5mkoh，60℃水浴皂化反應(yīng)過夜。皂化后加入2ml分析純正己烷渦旋震蕩10min對產(chǎn)物進(jìn)行萃取，5000rpm離心10min收集一定量有機相真空冷凍干燥2h，加入400μl正己烷溶解再次冷凍干燥4h，加入200μl衍生化試劑n-甲基-n-三甲基硅基三氟乙酰胺(mstfa)30℃水浴2h，用2μm有機濾膜過濾后適當(dāng)稀釋利用gc/ms檢測菜油甾醇含量。

表1耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056與sybe_yl01070028搖瓶產(chǎn)量比較實驗氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)檢測原始數(shù)據(jù)

試驗結(jié)果：由表1及圖2菌株sybe_yl02060056和sybe_yl01070028的菜油甾醇產(chǎn)量來看，發(fā)酵148小時，本專利構(gòu)建獲得的菌株sybe_yl02060056菜油甾醇產(chǎn)量為19.3±2.8mg/gdcw，與目前已報道最高產(chǎn)量菌株，即含有非洲爪蟾(xenopuslaevis)來源dhcr7的耶氏解脂酵母菌株sybe_yl01070028菜油甾醇產(chǎn)量(12.4±0.6mg/gdcw)相比提高56％，為目前的最高產(chǎn)量，因此該菌株可作為后續(xù)優(yōu)化的重要底盤菌株。

2、乙酰coa代謝優(yōu)化的耶氏解脂酵母菌株的構(gòu)建

選取13個乙酰coa代謝相關(guān)基因(包括碳代謝相關(guān)cs、acl和acs基因；乙酰coa分配相關(guān)hmgr和mae基因；脂肪酸β氧化相關(guān)pox1～pox6、mfe和pot基因)，以野生型耶氏解脂酵母atcc201249菌株基因組為模板，利用pcr擴增獲得乙酰coa代謝相關(guān)基因如hmgr(耶氏解脂酵母菌株中內(nèi)源基因的基因編號：yali0e04807g),cs(yali0e02684g),acl1(yali0e34793g),acl2(yali0d24431g),acs(yali0f05962g),pox1(yali0e32835g),pox2(yali0f10857g),pox3(yali0d24750g),pox4(yali0e27654g),pox5(yali0c23859g),pox6(yali0e06567g),mfe(yali0e15378g),pot(yali0e18568g),mae(yali0e18634g)，通過in-fusion組裝方法構(gòu)建到耶氏解脂酵母單拷貝整合型質(zhì)粒pina1269上(如圖3)，以強啟動子hp4d為啟動子、xpr2t為終止子，分別獲得13種質(zhì)粒pina1269-hmgr,pina1269-cs,pina1269-acl,pina1269-acs,pina1269-pox1,pina1269-pox2,pina1269-pox3,pina1269-pox4,pina1269-pox5,pina1269-pox6,pina1269-mfe,pina1269-pot,pina1269-mae，采用醋酸鋰法將13種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到本專利獲得的耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056底盤菌株中，整合于基因組pbr322platform位置從而過表達(dá)13種乙酰coa代謝相關(guān)基因，采用sc-ura-leu固體平板(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖22g/l，缺尿嘧啶和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/l，2％的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)后提取酵母基因組進(jìn)行pcr驗證，對驗證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076，各菌株基因組基因型如表2：

表2各菌株基因組基因型

3、比較耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076分別以葡萄糖或葵花籽油為碳源時菜油甾醇搖瓶產(chǎn)量

實驗材料：耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076

試驗方法：

一級、二級種子培養(yǎng)基：22g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉；

以葡萄糖為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：50g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉

以葵花籽油為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：3.7％v/v葵花籽油、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉

將上述菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076接種于5ml一級種子培養(yǎng)基中，在28℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于二級種子培養(yǎng)基中，在28℃、220rpm培養(yǎng)18h，再以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于50ml以葡萄糖為碳源或以葵花籽油為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個實驗組做兩組平行，于28℃、220rpm條件下培養(yǎng)，發(fā)酵148h結(jié)束，測定菌體密度(od600)，取10ml菌液提取菜油甾醇。

菜油甾醇提取方法：同上。

試驗結(jié)果：

以葡萄糖為碳源，耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量比較實驗氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)檢測原始數(shù)據(jù)如表3：

表3：以葡萄糖為碳源搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量

由表3及圖4～6，菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076的菜油甾醇產(chǎn)量來看，以葡萄糖為碳源發(fā)酵148h，所有乙酰coa代謝相關(guān)基因的過表達(dá)均對菜油甾醇的產(chǎn)量沒有明顯影響。

以葵花籽油為碳源，耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量比較實驗氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)檢測原始數(shù)據(jù)如表4：

表4：以葵花籽油為碳源搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量

而由附表4及圖5菌株sybe_yl02060056、sybe_yl02060063～sybe_yl02060065，sybe_yl02060067～sybe_yl02060076的菜油甾醇產(chǎn)量來看，以葵花籽油為碳源發(fā)酵148h，所有菌株的菜油甾醇產(chǎn)量均高于以葡萄糖為碳源時，因此葵花籽油是耶氏解脂酵母合成菜油甾醇的一種優(yōu)選碳源。以葵花籽油為碳源過表達(dá)acl、pox2和hmgr均使菜油甾醇的含量有明顯提高，菌株sybe_yl02060065中過表達(dá)acl基因使菜油甾醇產(chǎn)量從22.7±0.3mg/gdcw提高到25.3±0.1mg/gdcw(提高11.5％)，菌株sybe_yl02060069中過表達(dá)pox2基因使菜油甾醇產(chǎn)量從22.7±0.3mg/gdcw提高到24.7±0.1mg/gdcw(提高8.8％)，菌株sybe_yl02060063中過表達(dá)hmgr基因使菜油甾醇產(chǎn)量從22.7±0.3mg/gdcw提高到25.8±2.8mg/gdcw(提高13.7％)。該結(jié)果表明，以葵花籽油為碳源時，耶氏解脂酵母中過表達(dá)內(nèi)源acl、pox2或hmgr對于菜油甾醇產(chǎn)量提升具有積極作用，可進(jìn)一步用于發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗。

4、耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069及sybe_yl02060063發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化的菜油甾醇產(chǎn)量

實驗材料：耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069和sybe_yl02060063

試驗方法：

一級、二級種子培養(yǎng)基：22g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉；

三級種子、發(fā)酵培養(yǎng)基：3.7％v/v葵花籽油、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉

將上述菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069和sybe_yl02060063接種于5ml一級種子培養(yǎng)基中，在28℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于二級種子培養(yǎng)基中，在28℃、220rpm培養(yǎng)24h，再以初始菌體濃度od600＝0.2分別接種于50ml三級種子培養(yǎng)基中，每株菌株接種5瓶，于28℃、220rpm條件下培養(yǎng)12h，將全部250ml菌液倒入2.5l發(fā)酵培養(yǎng)基中。控制5-l發(fā)酵罐中發(fā)酵參數(shù)，溫度、ph值、容氧量及攪拌速率分別控制在28℃、5.5、>30％和1vvm，監(jiān)測發(fā)酵罐中剩余油量，采用碳源限制策略，待葵花籽油耗盡時開始滴加，調(diào)節(jié)滴加速率使油濃度限制在2g/l以下。發(fā)酵142h結(jié)束，每隔12h取15ml發(fā)酵液，測定菌體密度(od600)，發(fā)酵液殘余油量及菜油甾醇產(chǎn)量。

菜油甾醇提取方法：同上。

耶氏解脂酵母菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069及sybe_yl02060063發(fā)酵罐工藝優(yōu)化實驗氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)檢測原始數(shù)據(jù)如表5

表5：耶氏解脂酵母菌株發(fā)酵罐工藝產(chǎn)量

由附表5及圖6菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069和sybe_yl02060063的發(fā)酵曲線來看，發(fā)酵46h，發(fā)酵罐中初始加入的葵花籽油耗盡流加開始。此時三個菌株均進(jìn)入平臺期，菌株sybe_yl02060065、sybe_yl02060069和sybe_yl02060063生物量分別達(dá)到20.24mg/gdcw、26.40mg/gdcw和18.34mg/gdcw，說明碳源限制策略很好地控制了菌體生物量的增長，碳代謝流更多地進(jìn)入菜油甾醇及脂滴的積累。最終，過表達(dá)acl基因的菜油甾醇產(chǎn)量為800.8mg/l，過表達(dá)pox2基因的菜油甾醇產(chǎn)量為941.5mg/l，過表達(dá)hmgr基因的菜油甾醇產(chǎn)量為811.8mg/l，均為國際領(lǐng)先水平。對菜油甾醇產(chǎn)量最高菌株(sybe_yl02060069)進(jìn)行菌種保藏，保藏編號為cgmccno.14039。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>天津大學(xué)

<120>重組菌株及其構(gòu)建方法與在產(chǎn)菜油甾醇中的應(yīng)用

<130>mp1701565

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1437

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgatggcctccgatcgagtcagaaagcgacacaagggctccgctaacggcgctcagacc60

gtggagaaagaaccctccaaggaacccgcccaatggggtcgagcctgggaagtcgattgg120

ttctccctctccggcgtcattctgctcctgtgctttgccccctttctggtgtccttcttc180

atcatggcctgtgatcagtaccagtgctccatttcccaccctctgctcgacctgtataac240

ggcgacgccaccctgttcaccatctggaaccgagctccctcctttacctgggctgccgcc300

aagatctacgccatttgggtcaccttccaggtcgtgctctatatgtgcgtccctgacttc360

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gggctgattaacaagtacgaggtcaacgggctgcagtgttggctgatcacccacgtgctc480

tgggtcctgaacgcccagcacttccactggttctcccctaccatcatcatcgacaactgg540

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aaagcctacctcttccccaccaaccccgaggactgcaagttcaccggcaacatgttctat660

aactacatgatgggcatcgagtttaacccccgaatcggtaagtggttcgatttcaagctg720

ttctttaacggccgacccggcattgtcgcctggactctgatcaatctgtcctacgctgcc780

aagcagcaggagctctacggctacgtcaccaactccatgattctcgtgaacgtcctgcag840

gccgtctatgtcgtcgacttcttttggaacgaggcttggtacctcaagactatcgacatc900

tgtcacgaccacttcggctggtacctgggttggggcgattgtgtgtggctgccttttctg960

tacaccctgcaaggcctgtacctggtgtataaccccatccagctctccactccccatgcc1020

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aaagacctcttccgacgaaccgagggcaactgctccatctggggcaagaaacccaccttc1140

atcgaatgctcctaccaatccgccgatggcgccatccacaaatccaagctgatgacctct1200

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tactgtctcgcttgcggcggtaaccatctgctgccctacttctacatcatctacatgacc1320

atcctcctggtgcatcgatgcattcgagatgagcaccgatgctccaacaaatacggcaaa1380

gactgggagcgatacaccgctgctgtctcttaccgactgctgcccaatatcttctaa1437