本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

石油基聚合物為人們的生產(chǎn)生活帶來了極大的便利。但是，隨著石化資源的日益減少，以及使用石化資源帶來的環(huán)境問題，尋找新的環(huán)境友好的非石油基聚合物受到越來越多的重視。生物基材料具有易生物降解、原料來源廣和易化學(xué)改良等優(yōu)點(diǎn)，使其在很多領(lǐng)域中都有重要的應(yīng)用。目前，聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚乳酸(PLA)是受關(guān)注度較高的兩種生物基材料。PTT是一種性能優(yōu)異的聚酯類新型纖維，由對苯二甲酸和1,3-丙二醇(1,3-PD)縮聚而成，它綜合了聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)的優(yōu)勢，具有很好的柔軟性、蓬松性、抗污性、彈性和可以常溫染色等特點(diǎn)，可以廣泛用于服裝、裝飾和工程塑料等各個(gè)領(lǐng)域。PLA也稱為聚丙交酯，是以乳酸(LAC)為主要原料聚合得到的聚合物，它具有較好的熱穩(wěn)定性、抗溶劑性和生物相容性，可進(jìn)行多種方式的加工，可用于制造包裝材料、纖維和非織造物等在服裝、建筑、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域用途廣泛。此外，PLA制品具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，是公認(rèn)的環(huán)境友好材料。

生物基材料PTT和PLA巨大的市場需求，推動了生物法生產(chǎn)生物基材料單體1,3-PD和光學(xué)純LAC的發(fā)展。目前生物法生產(chǎn)1,3-PD的方法主要分為兩類：第一類是利用基因工程大腸桿菌，以葡萄糖等糖類為底物，生產(chǎn)1,3-PD(例如CN201110093628；ZL200710104008)；第二類是利用腸道細(xì)菌，以甘油為底物，生產(chǎn)1,3-PD(ZL200410100479；CN201180064621)。最近，由于生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，甘油作為其副產(chǎn)物，價(jià)格逐漸下降，是1,3-PD生產(chǎn)的理想底物?？衫酶视蜑榈孜锷a(chǎn)1,3-PD的菌株主要包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等。用于生產(chǎn)PLA的LAC必須具有高光學(xué)純度，因此，研究者篩選得到了很多可生產(chǎn)光學(xué)純LAC的細(xì)菌，例如鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)和土芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus terrae)等野生細(xì)菌，都可以以糖類為原料生產(chǎn)高濃度的光學(xué)純L-乳酸(L-LAC)或D-乳酸(D-LAC)(ZL200710176057；ZL201210115365；CN201410022868)。

利用上述的菌株和生產(chǎn)方法，可實(shí)現(xiàn)1,3-PD和LAC中一種化合物的生物法生產(chǎn)，但是，目前尚無可同時(shí)生產(chǎn)1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)的菌株。肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌在以甘油為底物，生產(chǎn)1,3-PD的過程中，還會生產(chǎn)少量的2,3-丁二醇、乙醇、LAC、琥珀酸、乙酸和甲酸等副產(chǎn)物，雖然這兩種菌株發(fā)酵甘油的發(fā)酵液中，同時(shí)具有1,3-PD和LAC，但由于兩種化合物的濃度差距大(一般不在同一數(shù)量級)導(dǎo)致其中一種化合物只能被當(dāng)做副產(chǎn)物處理，且醇類產(chǎn)物和酸類產(chǎn)物種類多，成分復(fù)雜，難以分離得到高純度的LAC，無法實(shí)現(xiàn)同時(shí)生產(chǎn)1,3-PD和LAC。在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中，必須考慮產(chǎn)物濃度、轉(zhuǎn)化率，提取成本等因素，如果能夠利用一個(gè)菌株，以甘油為底物，以1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)為主要產(chǎn)物，高轉(zhuǎn)化率的實(shí)現(xiàn)同時(shí)生產(chǎn)1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)，將大大降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種菌，所述菌具有聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的特性。聯(lián)產(chǎn)是指同時(shí)生產(chǎn)。

進(jìn)一步地，所述菌是由野生菌改造獲得的人工菌。

進(jìn)一步地，所述野生菌具有如下代謝途徑：

1)甘油→1,3-丙二醇；

所述野生菌還具有如下代謝途徑中一個(gè)或多個(gè)：

2)丙酮酸→α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸合成酶(budB)是催化該代謝途徑的酶；

3)α-乙酰乳酸→乙偶姻，α-乙酰乳酸脫羧酶(budA)是催化該代謝途徑的酶；

4)丙酮酸→乙酸，丙酮酸氧化酶(poxB)是催化該代謝途徑的酶；

5)乙酰輔酶A→乙酰磷酸，乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(pta)是催化該代謝途徑的酶；

6)乙酰磷酸→乙酸，乙酰激酶(ackA)是催化該代謝途徑的酶；

7)乙酰輔酶A→乙醛，醛脫氫酶(adhE)是催化該代謝途徑的酶；

8)富馬酸→琥珀酸，富馬酸還原酶(frdA)是催化該代謝途徑的酶；

9)丙酮酸→D-乳酸，D-乳酸脫氫酶(dldh)是催化該代謝途徑的酶；

所述改造包括：阻斷所述代謝途徑中的2)－9)中的一個(gè)或多個(gè)。

進(jìn)一步地，所述野生菌為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

進(jìn)一步地，所述野生菌為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0于2016年4月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M 2016184。

進(jìn)一步地，所述改造包括：通過抑制或去除酶的活性來阻斷所述代謝途徑中的2)－9)中的一個(gè)或多個(gè)。

進(jìn)一步地，所述改造包括：通過改變酶的基因來抑制或去除酶的活性。

進(jìn)一步地，所述改造包括：通過基因重組的辦法來改變酶的基因。

進(jìn)一步地，編碼α-乙酰乳酸脫羧酶基因的序列如SEQ ID NO:1所示；

編碼α-乙酰乳酸合成酶基因的序列如SEQ ID NO:2所示；

編碼醛脫氫酶基因的序列如SEQ ID NO:3所示；

編碼乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列如SEQ ID NO:4所示；

編碼丙酮酸氧化酶基因的序列如SEQ ID NO:5所示；

編碼富馬酸還原酶基因的序列如SEQ ID NO:6所示；

編碼D-乳酸脫氫酶基因序列如SEQ ID NO:7所示。

進(jìn)一步地，所述人工菌的budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和dldh中的一種基因或者多種基因缺陷。

進(jìn)一步地，所述基因缺陷通過同源重組的方法產(chǎn)生。

進(jìn)一步地，所述改造還包括外源引入L-乳酸合成途徑。

進(jìn)一步地，所述外源引入L-乳酸合成途徑指：將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6的L-乳酸脫氫酶基因lldh通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述野生菌中，得到產(chǎn)L-乳酸的菌。

進(jìn)一步地、如權(quán)利要求12所述的菌，其特征在于，所述外源引入L-乳酸合成途徑指：將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6的L-乳酸脫氫酶基因lldh替換所述野生菌中的budB基因，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述野生菌中，得到產(chǎn)L-乳酸的菌。

進(jìn)一步地，所述人工菌的基因型包括ΔbudA::lldh ΔbudB ΔadhE ΔackA-ptaΔpoxB ΔfrdA Δdldh。

進(jìn)一步地，所述人工菌的基因型是ΔbudA::lldh ΔbudB ΔadhE ΔackA-ptaΔpoxB ΔfrdA Δdldh。

從另一角度描述，所述人工菌是由所述野生菌的budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和dldh基因缺陷，并外源引入了lldh基因獲得；所述人工菌產(chǎn)1,3-PD和L-LAC，且1,3-PD和L-LAC的總轉(zhuǎn)化率超過90％?？傓D(zhuǎn)化率計(jì)算公式為：總轉(zhuǎn)化率＝1,3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率+L-乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率；其中，1,3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率＝(1,3-PD的最終濃度×最終發(fā)酵液體積×甘油的摩爾質(zhì)量92)/(消耗的甘油質(zhì)量×1,3-PD的摩爾質(zhì)量76)；L-乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率＝(L-LAC的最終濃度×最終發(fā)酵液體積×甘油的摩爾質(zhì)量92)/(消耗的甘油質(zhì)量×L-LAC的摩爾質(zhì)量90)。

進(jìn)一步地，budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和dldh基因缺陷的獲得采用同源重組的方法，且各基因缺陷的獲得不存在固定的先后順序；所述同源重組的方法是指通過PCR擴(kuò)增以上所述基因的上游同源片段和下游同源片段，并將所述上游同源片段和所述下游同源片段構(gòu)建到自殺質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)中，得到供體菌；將所述供體菌與相應(yīng)的受體菌進(jìn)行雙親本雜交，使所述上游同源片段和所述下游同源片段與所述受體菌的基因組發(fā)生同源重組，從而獲得以上所述基因缺陷的菌株，即所述人工菌。

進(jìn)一步地，所述野生菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0于2016年4月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M 2016184。

進(jìn)一步地，所述budA的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；和/或所述budB的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；和/或所述adhE的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；和/或所述ackA-pta的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；和/或所述poxB的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；和/或所述frdA的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；和/或所述dldh的DNA序列如SEQ ID NO:7所示；和/或所述lldh的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。

在一較佳實(shí)施方式中，所述改造包括向所述野生菌中引入外源1,3-PD合成途徑和/或L-LAC合成途徑。

進(jìn)一步地，所述引入外源1,3-PD合成途徑是將甘油脫水酶編碼基因dhaB及1,3-PD氧化還原酶編碼基因dhaT轉(zhuǎn)化到所述野生菌中。

進(jìn)一步地，所述引入外源L-LAC合成途徑是將L-乳酸脫氫酶基因lldh通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述野生菌中，得到產(chǎn)L-乳酸的菌。

進(jìn)一步地，所述外源引入的L-乳酸脫氫酶基因lldh來自于凝集芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6。凝集芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6為CN101173242A中的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)CASH，其保藏號為CGMCC No2184。

進(jìn)一步地，所述改造還包括：通過基因重組的辦法來改變budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和/或dldh基因。

在一個(gè)較佳實(shí)施方式中，所述菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL于2016年4月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M 2016186。

本發(fā)明提供的菌具有如下代謝途徑：

1)甘油→1,3-丙二醇；

2)甘油→丙酮酸→L-乳酸。

本發(fā)明提供的一種菌具有聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的特性，其中聯(lián)產(chǎn)得到的：1,3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率≥35％；L-乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率≥40％。

進(jìn)一步地，聯(lián)產(chǎn)得到的：1,3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率≥40％；和/或L-乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率≥50％。

本發(fā)明提供的一種菌具有聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的特性，其中聯(lián)產(chǎn)得到的：1,3-丙二醇和L-乳酸的總轉(zhuǎn)化率超過90％。

本發(fā)明提供的一種菌具有聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的特性，其中聯(lián)產(chǎn)得到的1,3-丙二醇和L-乳酸的質(zhì)量比為1:0.1-10。進(jìn)一步地，聯(lián)產(chǎn)得到的1,3-丙二醇和L-乳酸的質(zhì)量比為1:0.2-5。進(jìn)一步地，聯(lián)產(chǎn)得到的1,3-丙二醇和L-乳酸的質(zhì)量比為1:0.5-2。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的所述菌來自于真菌中的曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬或鏈霉菌屬；或者來自細(xì)菌中的甲基菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌、乳桿菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、暗桿菌屬、泥桿菌屬或者梭菌屬。

本發(fā)明還公開了一種如上所述的菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一、從土壤樣品中篩選能生產(chǎn)1,3-丙二醇和乳酸的產(chǎn)酸克雷伯氏菌；

步驟二、使得步驟一中得到的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的α-乙酰乳酸脫羧酶基因、α-乙酰乳酸合成酶基因、醛脫氫酶基因、乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、丙酮酸氧化酶基因、富馬酸還原酶基因和D-乳酸脫氫酶基因缺陷，得到過程菌株一；

步驟三、將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6的L-乳酸脫氫酶基因插入到所述步驟二中得到的過程菌株一的α-乙酰乳酸脫羧酶基因在基因組中上游的啟動子之后，得到具有L-乳酸脫氫酶活性的菌株，即所述菌。

進(jìn)一步地，所述步驟一中得到的產(chǎn)酸克雷伯氏菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0于2016年4月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCC M2016184。

進(jìn)一步地，所述budA的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；所述budB的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；所述adhE的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；所述ackA-pta的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；所述poxB的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；所述frdA的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；所述dldh的DNA序列如SEQ ID NO:7所示；所述lldh的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。

進(jìn)一步地，所述步驟二包括以下步驟：

步驟2-1、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0 CCTCC M 2016184的α-乙酰乳酸脫羧酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因缺陷，得到α-乙酰乳酸脫羧酶和α-乙酰乳酸合成酶活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1；

步驟2-2、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1的醛脫氫酶基因缺陷，得到醛脫氫酶活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2；

步驟2-3、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2的乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因缺陷，得到乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3；

步驟2-4、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3的丙酮酸氧化酶基因缺陷，得到丙酮酸氧化酶活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4；

步驟2-5、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4的富馬酸還原酶基因缺陷，得到富馬酸還原酶活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5；

步驟2-6、使所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5的D-乳酸脫氫酶基因缺陷，得到D-乳酸脫氫酶基因活性丟失的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6；

經(jīng)過以上步驟后得到了α-乙酰乳酸脫羧酶基因、α-乙酰乳酸合成酶基因、醛脫氫酶基因、乙酸激酶基因、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、丙酮酸氧化酶基因、富馬酸還原酶基因和D-乳酸脫氫酶基因缺陷的所述過程菌株一；

所述α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述α-乙酰乳酸合成酶基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述醛脫氫酶基因序列如SEQ ID NO:3所示；所述乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因序列如SEQ ID NO:4所示；所述丙酮酸氧化酶基因序列如SEQ ID NO:5所示；所述富馬酸還原酶基因序列如SEQ ID NO:6所示；所述D-乳酸脫氫酶基因序列如SEQ ID NO:7所示。

進(jìn)一步地，所述步驟三中的凝結(jié)芽孢桿菌2-6的L-乳酸脫氫酶基因序列如SEQ ID NO:8所示。

進(jìn)一步地，所述步驟二中，使得產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0 CCTCC M 2016184的α-乙酰乳酸脫羧酶基因、α-乙酰乳酸合成酶基因、醛脫氫酶基因、乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、丙酮酸氧化酶基因、富馬酸還原酶基因和D-乳酸脫氫酶基因缺陷是通過PCR擴(kuò)增以上所述基因的上游同源片段和下游同源片段，并將所述上游同源片段和所述下游同源片段構(gòu)建到自殺質(zhì)粒pKR6K上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)S17-1(λpir)中，得到供體菌；將所述供體菌與相應(yīng)的受體菌進(jìn)行雙親本雜交，使所述上游同源片段和所述下游同源片段與所述受體菌的基因組發(fā)生同源重組，從而獲得以上所述基因缺陷的菌株；所述受體菌包括所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0 CCTCC M 2016184、所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1、所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2、所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3、所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4和所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5；

所述步驟三中，將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6的L-乳酸脫氫酶基因lldh插入到所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的α-乙酰乳酸脫羧酶基因在基因組中上游的啟動子之后，是通過PCR擴(kuò)增所述α-乙酰乳酸脫羧酶基因在基因組中上游同源片段和下游同源片段，以及凝結(jié)芽孢桿菌2-6的L-乳酸脫氫酶基因片段后，構(gòu)建到自殺質(zhì)粒pKR6K上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到帶有pKR6K-ΔbudA::lldh的供體菌；將所述帶有pKR6K-ΔbudA::lldh的供體菌與所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6進(jìn)行雙親本雜交，得到所述菌。

本發(fā)明還提供另一種如上所述的菌的構(gòu)建方法，其特征在于，通過基因工程改造向菌株中引入外源1,3-PD合成途徑和/或外源L-LAC合成途徑。

進(jìn)一步地，所述引入外源1,3-PD合成途徑指：將甘油脫水酶編碼基因dhaB及1,3-PD氧化還原酶編碼基因dhaT通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述菌株中，得到菌株A，所述菌株A產(chǎn)1,3-PD。

進(jìn)一步地，所述引入外源1,3-PD合成途徑指：選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌中的1,3-PD合成途徑中的甘油脫水酶編碼基因dhaB及1,3-PD氧化還原酶編碼基因dhaT，進(jìn)行PCR克隆后連接到質(zhì)粒DNA pet-Duet上，并轉(zhuǎn)化到所述菌株中，得到菌株A，所述菌株A產(chǎn)1,3-PD。

進(jìn)一步地，所述引入外源L-LAC合成途徑指：將L-乳酸脫氫酶基因lldh通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述菌株中，得到菌株B，所述菌株B產(chǎn)L-LAC。

進(jìn)一步地，所述引入外源L-LAC合成途徑指：選用來自于凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)2-6的L-乳酸脫氫酶基因lldh通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述菌株中，得到菌株B，所述菌株B產(chǎn)L-LAC。

進(jìn)一步地，還包括如下操作：向引入外源1,3-PD合成途徑和/或引入外源L-LAC合成途徑的菌株，采用同源重組的方法產(chǎn)生budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和/或dldh基因缺陷的菌株。

本發(fā)明還涉及如上所述的菌在生產(chǎn)1,3-丙二醇或L-乳酸或聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸中的應(yīng)用。

尤其是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL CCTCC M 2016186在生產(chǎn)1,3-丙二醇或L-乳酸或聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種通過發(fā)酵如上所述的菌聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的方法。通過發(fā)酵如上所述的菌聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的方法，實(shí)際上是指如上所述的菌的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，如上所述的聯(lián)產(chǎn)1,3-丙二醇和L-乳酸的方法，其特征在于，所述菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL CCTCC M 2016186。

進(jìn)一步地，發(fā)酵時(shí)通氣量為0-2.0vvm。進(jìn)一步地，發(fā)酵時(shí)通氣量為1.0vvm。

進(jìn)一步地，發(fā)酵時(shí)采用氫氧化鈣和水的混合乳液作為中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。

進(jìn)一步地，包括以下步驟：

步驟(1)、菌株選擇：選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL CCTCC M 2016186；

步驟(2)、種子培養(yǎng)；

步驟(3)、發(fā)酵：發(fā)酵過程中，使用中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為5.5-7.5。

進(jìn)一步地，包括以下步驟：

步驟(1)、菌株選擇：選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PLL CCTCC M 2016186；

步驟(2)、種子培養(yǎng)：選用所述步驟(1)的菌株，在無菌條件下接種至甘油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25-40℃，搖床震蕩轉(zhuǎn)速為100-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為6-24小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；

步驟(3)、發(fā)酵：將所述步驟(2)中制得的種子培養(yǎng)液接種至裝有甘油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量v/v為0.5-10％，發(fā)酵溫度為25-40℃，通氣量為0.3-2.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為50-400rpm，發(fā)酵過程中，使用中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為5.5-7.5；發(fā)酵方式為分批發(fā)酵或分批補(bǔ)料發(fā)酵，進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，當(dāng)甘油培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，停止發(fā)酵；進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，當(dāng)甘油培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，通過向發(fā)酵罐中補(bǔ)加400-800g/L的甘油溶液，控制發(fā)酵液中甘油濃度為5-40g/L，當(dāng)發(fā)酵液中1,3-丙二醇或L-乳酸濃度不再升高時(shí)，停止發(fā)酵。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中培養(yǎng)溫度為30-37℃，搖床震蕩轉(zhuǎn)速為150-250rpm，培養(yǎng)時(shí)間為10-16小時(shí)；所述步驟(3)中接種量v/v為2-6％，發(fā)酵溫度為30-37℃，通氣量為0.7-1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為150-300rpm，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6.0-7.0，發(fā)酵方式為分批補(bǔ)料發(fā)酵，補(bǔ)加的甘油溶液中甘油濃度為500-700g/L，控制發(fā)酵液中甘油濃度為10-30g/L；所述步驟(3)中的中和劑包括氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、氨水水溶液，以及氫氧化鈣和水的混合乳液中的任一一種或者多種。

本發(fā)明的有益效果包括：

1、使用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，得到的發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物濃度高，副產(chǎn)物種類少且濃度低?？缮a(chǎn)濃度超過70.7g/L的1,3-PD和濃度超過95.4g/L的L-LAC，1,3-PD和L-LAC的總轉(zhuǎn)化率超過90％，生產(chǎn)的L-LAC具有高光學(xué)純度(純度大于99.9％)。發(fā)酵液中僅能檢測到少量的副產(chǎn)物。

聯(lián)產(chǎn)1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)的好處是：由于克雷伯氏菌代謝甘油屬于甘油歧化途徑，分為甘油氧化途徑和甘油還原途徑。甘油到1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化屬于甘油的還原途徑，轉(zhuǎn)化過程需要氧化途徑中產(chǎn)生的輔因子NADH和ATP來提供還原力及能量。乳酸在2004年被美國能源部評選為前三十種重點(diǎn)發(fā)展的平臺化合物之一，鑒于其廣闊的用途，在2010年又被選為最有前途的平臺化合物之一。乳酸是一種重要的單體，可以用來合成可生物降解、可生物相容且環(huán)境友好的生物多聚體－聚乳酸(PLA)。除了乳酸的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，合成乳酸的過程中凈產(chǎn)1mol NADH，可以為合成1,3-PD提供還原力，從而達(dá)到還原力平衡的狀態(tài)；從甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化過程中，是三碳到三碳的轉(zhuǎn)化，沒有碳損失，可以保證碳的回復(fù)率；另外，乳酸具有非常好的生物相容性，這對工業(yè)上高產(chǎn)乳酸至關(guān)重要；由于乳酸的生物合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)級別的生產(chǎn)，因此，其下游純化技術(shù)也相對成熟。這一切的特征都使得乳酸成為與1,3-PD聯(lián)產(chǎn)的最佳選擇。而事實(shí)也證明聯(lián)產(chǎn)1,3-PD和L-LAC獲得了非常高的總轉(zhuǎn)化率(超過90％)。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道(Biotechnol Bioeng.Metabolism in 1,3-propanediol fed-batch fermentation by a D-lactate deficient mutant of Klebsiella pneumoniae.2009；104(5):965-72.；Bioresour Technol.Production of optically pure d-lactate from glycerol by engineered Klebsiella pneumoniae strain.2014；172:269-75.；Hong A A,Cheng K K et al.Strain isolation and optimization of process parameters for bioconversion of glycerol to lactic acid[J].Journal of chemical technology and biotechnology,2009,84(10):1576-1581.)，在克雷伯氏菌中，由甘油直接轉(zhuǎn)化合成1,3-PD的最高產(chǎn)量為95.4g/L，從甘油到1,3-PD的摩爾轉(zhuǎn)化率為0.48mol/mol(即48％)；從甘油直接轉(zhuǎn)化L-乳酸的最高產(chǎn)量為85.4g/L，轉(zhuǎn)化率為0.9mol/mol(即90％)，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.97g/Lh^-1。但是根據(jù)現(xiàn)在已有報(bào)道，尚無可同時(shí)生產(chǎn)1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)的菌株。

由于在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中，必須考慮產(chǎn)物濃度、轉(zhuǎn)化率，提取成本等因素，如果能夠利用一個(gè)菌株，以甘油為底物，以1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)為主要產(chǎn)物，高摩爾轉(zhuǎn)化率的實(shí)現(xiàn)同時(shí)生產(chǎn)1,3-PD和光學(xué)純LAC(L-LAC或D-LAC)，將大大降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

2、產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186易于離心和過濾，有利于生物材料單體1,3-PD和L-LAC的高效生物法生產(chǎn)和提取。

3、產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4、產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL聯(lián)產(chǎn)得到的1,3-PD和L-LAC的濃度差距不大，其質(zhì)量比都在1:0.1-10范圍內(nèi)，尤其是在1:0.2-5范圍內(nèi)，進(jìn)一步地在1:0.5-2范圍內(nèi)。

附圖說明

圖1是對產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)進(jìn)行基因改造的示意圖。

圖2是D-乳酸和L-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)品混合物檢測圖。

圖3是產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186的發(fā)酵產(chǎn)物乳酸手性分析檢測圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步的說明：下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明所述的基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，由于budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和dldh基因缺陷，導(dǎo)致α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶、醛脫氫酶、乙酸激酶、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、丙酮酸氧化酶、富馬酸還原酶和D-乳酸脫氫酶活性丟失，因此2,3-丁二醇、乙醇、乙酸、琥珀酸和D-LAC代謝途徑失活；另外，凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因插入到budA基因在基因組中上游的啟動子之后，使菌株具有了L-乳酸脫氫酶的活性，如圖1所示。從圖1中可以看出，甘油可轉(zhuǎn)化得到1,3-丙二醇和L-乳酸，L-乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成L-乳酸，并且以下代謝途徑失活：α-乙酰乳酸合成酶催化丙酮酸生成α-乙酰乳酸；α-乙酰乳酸脫羧酶催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻；丙酮酸氧化酶催化丙酮酸生成乙酸；乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶催化乙酰輔酶A生成乙酰磷酸；乙酰激酶催化乙酰磷酸生成乙酸；醛脫氫酶催化乙酰輔酶A生成乙醛；富馬酸還原酶催化富馬酸生成琥珀酸；D-乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成D-乳酸。在圖1中，差號表示該酶活性丟失，相應(yīng)的代謝途徑失活。

由于α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶、醛脫氫酶、乙酸激酶、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、丙酮酸氧化酶、富馬酸還原酶和D-乳酸脫氫酶在產(chǎn)酸克雷伯氏菌中不利于甘油向1,3-PD和L-LAC轉(zhuǎn)化，因此當(dāng)這些酶功能缺陷后，則有利于產(chǎn)酸克雷伯氏菌以甘油為底物生產(chǎn)1,3-PD和L-LAC。同時(shí)，插入L-乳酸脫氫酶基因到該基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌中，也有利于丙酮酸向L-LAC轉(zhuǎn)化，見圖1。本發(fā)明正是在這樣的基因改造思路下進(jìn)行相應(yīng)的基因工程菌株構(gòu)建，得到了高產(chǎn)1,3-PD和L-LAC、易純化的上述基因型的基因工程產(chǎn)酸克雷伯氏菌。以下將以具體的菌株對其有益效果進(jìn)行說明和驗(yàn)證，但并不表示只有下述具體菌株才具有高產(chǎn)1,3-PD和L-LAC、易純化的有益效果，理論上應(yīng)該是凡是具備該基因型的產(chǎn)酸克雷伯氏菌均有這樣的有益效果。

如圖2和3所示，使用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，以甘油為底物，可生產(chǎn)高濃度的1,3-PD和高濃度的L-LAC。發(fā)酵液中檢測不到D-LAC，因此，生產(chǎn)的L-LAC具有高光學(xué)純度(純度大于99.9％)。發(fā)酵液中檢測不到2,3-丁二醇、乙醇和甲酸，僅能檢測到少量的乙酸和琥珀酸，發(fā)酵液中產(chǎn)物檢測結(jié)果如表1所示。

表1：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186以甘油為底物發(fā)酵液中產(chǎn)物組成

如表1所示，產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，以甘油為底物，可生產(chǎn)70.0g/L的1,3-PD和104.0g/L的L-LAC，其中，1,3-PD的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到42.5％，L-LAC的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到53.4％，兩種主要產(chǎn)物1,3-PD和L-LAC的總轉(zhuǎn)化率超過90％。發(fā)酵液中僅能檢測到少量的副產(chǎn)物。

實(shí)施例1：以1,3-PD和LAC為主要產(chǎn)物的菌株的篩選和鑒定

稱取2g土壤樣品加入50mL甘油液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃培養(yǎng)24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。然后用無菌的生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，分別稀釋10倍、100倍、1000倍和10000倍后涂布到含甘油固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)。待長出單菌落后，挑選菌落面積和產(chǎn)酸透明圈面積大的菌落，接種到甘油液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃培養(yǎng)24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。對培養(yǎng)液進(jìn)行離心，測定培養(yǎng)液中1,3-PD和LAC的產(chǎn)量，挑取一株1,3-PD和LAC產(chǎn)量高，同時(shí)易于離心的菌株。

將上述菌株多次在甘油固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，然后再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的培養(yǎng)測試，10次循環(huán)培養(yǎng)產(chǎn)生的1,3-PD和LAC產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率基本保持原有水平，證明上述菌株即是目標(biāo)菌株，將該菌株命名為PDL-0。測定菌株P(guān)DL-0培養(yǎng)液中D-LAC和L-LAC的比例，結(jié)果表明，菌株P(guān)DL-0生產(chǎn)的LAC中，D-LAC的比例大于99.9％，L-LAC的比例小于0.01％。

抽提菌株P(guān)DL-0的全基因組，然后PCR擴(kuò)增菌株P(guān)DL-0的16S rRNA的基因序列，將PCR產(chǎn)物測序，測序得到的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:9所示。菌株P(guān)DL-0的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中其他產(chǎn)酸克雷伯氏菌的16S rRNA基因序列具有99％的同源性，分析結(jié)果表明，菌株P(guān)DL-0為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

其中，所述甘油液體培養(yǎng)基的配方為：酵母粉3g/L、K₂HPO₄·3H₂O 10g/L、KH₂PO₄2g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、FeCl₃·6H₂O 20mg/L、CoCl₂·6H₂O 50mg/L和甘油20g/L；121℃滅菌20分鐘。

其中，所述甘油固體培養(yǎng)基的配方為：酵母粉3g/L、K₂HPO₄·3H₂O 10g/L、KH₂PO₄2g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、FeCl₃·6H₂O 20mg/L、CoCl₂·6H₂O 50mg/L，甘油20g/L和瓊脂粉15g/L；121℃滅菌20分鐘。

實(shí)施例2：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0中α-乙酰乳酸脫羧酶基因(budA)和α-乙酰乳酸合成酶基因(budB)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0中部分缺失budA基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)budA基因序列(如SEQ ID NO:1所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增budA基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0的基因組DNA為模板，使用引物budA-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGAACCATTCTGCTGAATG-3’(如SEQ ID NO:10所示)和引物budA-2：5’-AACGGGCTGGCATCACCGCGAAGGGCGTGC-3’(如SEQ ID NO:11所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物budA-3：5’-CGCGGTGATGCCAGCCCGTTTTCCGCTTCA-3’(如SEQ ID NO:12所示)和引物budA-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTAGTTTTCGACTGAGCGAA-3’(如SEQ ID NO:13所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。自殺質(zhì)粒pKR6K可通過將質(zhì)粒pK18mobsacB(優(yōu)寶生物公司)的復(fù)制子替換成質(zhì)粒pCAM140的復(fù)制子獲得。質(zhì)粒pCAM140的復(fù)制子的序列可通過基因合成的方式獲得，質(zhì)粒pCAM140的序列見文獻(xiàn)報(bào)道(Wilson K J,Sessitsch A,Corbo J C,et al.β-Glucuronidase(GUS)transposons for ecological and genetic studies of rhizobia and other Gram-negative bacteria[J].Microbiology,1995,141(7):1691-1705.)。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失budA基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔbudA。

(2)budA基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔbudA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudA)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudA)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔbudA上的budA基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0的budA基因缺失200bp，達(dá)到使budA基因缺陷的目的，具體方法為：

a.分別接種活化后的供體菌和受體菌至5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中，200rpm培養(yǎng)2-3小時(shí)，當(dāng)供體菌和受體菌同時(shí)生長到OD_620nm為0.5-0.8；將5mL供體菌菌液離心，無菌生理鹽水洗兩遍；將1mL受體菌菌液離心，無菌生理鹽水洗兩遍；將上述供體菌和受體菌的菌體一共用100μL無菌生理鹽水重懸，將重懸液全部滴在LB固體培養(yǎng)基平板中間，平板正面放置，37℃培養(yǎng)12-18小時(shí)。

b.將步驟a中LB固體培養(yǎng)基平板上的菌落用無菌生理鹽水和刮刀刮下，無菌生理鹽水洗兩遍，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布于加入了50μg/mL卡那霉素的M9固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24-36小時(shí)。

c.挑取步驟b中M9固體培養(yǎng)基平板上生長的單菌落至加入50μg/mL卡那霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)。轉(zhuǎn)接菌液至新鮮的5mL LB液體培養(yǎng)基中(不添加卡那霉素)，37℃，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)。

d.將上述菌液適當(dāng)稀釋，涂布于LAS固體培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)24小時(shí)。

e.挑取步驟d中LAS固體培養(yǎng)基平板上生長的單菌落至5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，提取基因組DNA，使用引物budA-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGAACCATTCTGCTGAATG-3’(如SEQ ID NO:10所示)和引物budA-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTAGTTTTCGACTGAGCGAA-3’(如SEQ ID NO:13所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的budA基因缺陷的菌株。

其中，所述LB液體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl10g/L，121℃滅菌20分鐘。

其中，所述LB固體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和瓊脂粉15g/L，121℃滅菌20分鐘。

其中，所述M9固體培養(yǎng)基配方為：Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g/L、KH₂PO₄0.3g/L、NaCl 0.05g/L、NH₄Cl 0.1g/L、檸檬酸三鈉0.5g/L和瓊脂粉15g/L，121℃滅菌20分鐘。

其中，所述LAS固體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、蔗糖150g/L和瓊脂粉15g/L，115℃滅菌20分鐘。

(3)用于在budA基因缺陷的菌株中部分缺失budB基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)budB基因序列(如SEQ ID NO:2所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增budB基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0的基因組DNA為模板，使用引物budB-1：5’-ACGCGAATTCGTGGATAATCAACATCAACCGCGCC-3’(如SEQ ID NO:14所示)和引物budB-2：5’-ACGCGGATCCGGGGCGTCCCTGCTCGGC-3’(如SEQ ID NO:15所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物budB-3：5’-ACGCGGATCCATCGCCCGCTATCTCTACAGCTTCC-3’(如SEQ ID NO:16所示)和引物budB-4：5’-ACGCCTGCAGATTTGACTGAGATGAAGCTGGCCCA-3’(如SEQ ID NO:17所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI酶切上游同源片段，使用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI酶切下游同源片段，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K和帶有粘性末端的上游和下游同源臂片段。

使用T4連接酶(NEB公司)將帶有粘性末端的上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失budB基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔbudB。

(4)budB基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔbudB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudB)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudB)與受體菌budA基因缺陷的菌株進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔbudB上的budB基因上游同源片段和下游同源片段與budA基因缺陷的菌株的基因組發(fā)生同源重組，從而budA基因缺陷的菌株的budB基因缺失722bp，達(dá)到使budB基因缺陷的目的。具體方法與步驟(2)相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物budB-1：5’-ACGCGAATTCGTGGATAATCAACATCAACCGCGCC-3’(如SEQ ID NO:14所示)和引物budB-4：5’-ACGCCTGCAGATTTGACTGAGATGAAGCTGGCCCA-3’(如SEQ ID NO:17所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的budA基因和budB基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1。

實(shí)施例3：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1中醛脫氫酶基因(adhE)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1中部分缺失adhE基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)adhE基因序列(如SEQ ID NO:3所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增adhE基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1的基因組DNA為模板，使用引物adhE-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGGCTGTTACTAATGTCGC-3’(如SEQ ID NO:18所示)和引物adhE-2：5’-TGCTGTCTGTTGGCGTTACGGGTCTTCAGG-3’(如SEQ ID NO:19所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物adhE-3：5’-CGTAACGCCAACAGACAGCATTCAGCCAGT-3’(如SEQ ID NO:20所示)和引物adhE-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTAAGCGGATTTTTTCGCTT-3’(如SEQ ID NO:21所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失adhE基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔadhE。

(2)adhE基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔadhE轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔadhE)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔadhE)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔadhE上的adhE基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-1的adhE基因缺失1876bp，達(dá)到使adhE基因缺陷的目的。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物adhE-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGGCTGTTACTAATGTCGC-3’(如SEQ ID NO:18所示)和引物adhE-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTAAGCGGATTTTTTCGCTT-3’(如SEQ ID NO:21所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的adhE基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2。

實(shí)施例4：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2中乙酸激酶和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(ackA-pta)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2中部分缺失ackA-pta基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)ackA-pta基因序列(如SEQ ID NO:4所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增ackA-pta基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2的基因組DNA為模板，使用引物ackA-pta-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGTCGAGTAAGTTAGTACT-3’(如SEQ ID NO:22所示)和引物ackA-pta-2：5’-CACGCGCGGTCCTCAGCGATACCGATCAGG-3’(如SEQ ID NO:23所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物ackA-pta-3：5’-ATCGCTGAGGACCGCGCGTGGCCATGCTCT-3’(如SEQ ID NO:24所示)和引物ackA-pta-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTATGCTTGCTGCTGGGACG-3’(如SEQ ID NO:25所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失ackA-pta基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔackA-pta。

(2)ackA-pta基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔackA-pta轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔackA-pta)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔackA-pta)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔackA-pta上的ackA-pta基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-2的ackA-pta基因缺失2749bp，達(dá)到使ackA-pta基因缺陷的目的。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物ackA-pta-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGTCGAGTAAGTTAGTACT-3’(如SEQ ID NO:22所示)和引物ackA-pta-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTATGCTTGCTGCTGGGACG-3’(如SEQ ID NO:25所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的ackA-pta基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3。

實(shí)施例5：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3中丙酮酸氧化酶基因(poxB)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3中部分缺失poxB基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)poxB基因序列(如SEQ ID NO:5所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增poxB基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3的基因組DNA為模板，使用引物poxB-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGAAACAGACCGTGGCGGC-3’(如SEQ ID NO:26所示)和引物poxB-2：5’-AAAATCCCCCGGGTTGAGACCAGTTCACAG-3’(如SEQ ID NO:27所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物poxB-3：5’-GTCTCAACCCGGGGGATTTTCTCTCGCTGG-3’(如SEQ ID NO:28所示)和引物poxB-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTACCTTAGCCAGTTAGTTT-3’(如SEQ ID NO:29所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失poxB基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔpoxB。

(2)poxB基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔpoxB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔpoxB)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔpoxB)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔpoxB上的poxB基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-3的poxB基因缺失919bp，達(dá)到使poxB基因缺陷的目的。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物poxB-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGAAACAGACCGTGGCGGC-3’(如SEQ ID NO:26所示)和引物poxB-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTACCTTAGCCAGTTAGTTT-3’(如SEQ ID NO:29所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的poxB基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4。

實(shí)施例6：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4中富馬酸還原酶基因(frdA)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4中部分缺失frdA基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)frdA基因序列(如SEQ ID NO:6所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增frdA基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4的基因組DNA為模板，使用引物frdA-1：5’-ACATGATTACGAATTCGTGCAAACTTTTCAAGCCGA-3’(如SEQ ID NO:30所示)和引物frdA-2：5’-GTAGATGCCGAGCCGGTTTTATCGGCAGCG-3’(如SEQ ID NO:31所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物frdA-3：5’-AAAACCGGCTCGGCATCTACCGTACGCCGG-3’(如SEQ ID NO:32所示)和引物frdA-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTCAGCCATTCGTCGTCTCCT-3’(如SEQ ID NO:33所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可部分缺失frdA基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-ΔfrdA。

(2)frdA基因部分缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔfrdA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔfrdA)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔfrdA)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔfrdA上的frdA基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-4的frdA基因缺失991bp，達(dá)到使frdA基因缺陷的目的。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物frdA-1：5’-ACATGATTACGAATTCGTGCAAACTTTTCAAGCCGA-3’(如SEQ ID NO:30所示)和引物frdA-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTCAGCCATTCGTCGTCTCCT-3’(如SEQ ID NO:33所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的frdA基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5。

實(shí)施例7：產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5中D-乳酸脫氫酶基因(dldh)的缺陷

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5中缺失dldh基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)dldh基因序列(如SEQ ID NO:7所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增dldh基因的上游和下游同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5的基因組DNA為模板，使用引物dldh-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGGAGCATCTGCACATGAA-3’(如SEQ ID NO:34所示)和引物dldh-2：5’-AAAGGGAAAGGAATAAAGACTTTTCTCCAGTGATAATACC-3’(如SEQ ID NO:35所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物dldh-3：5’-CTGGAGAAAAGTCTTTATTCCTTTCCCTTTTGTGCTC-3’(如SEQ ID NO:36所示)和引物dldh-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTATCAGAACTGATCTTCTT-3’(如SEQ ID NO:37所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到上游和下游同源片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將上游同源片段、下游同源片段和線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到可缺失dldh基因的自殺質(zhì)粒pKR6K-Δdldh。

(2)dldh基因缺失的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-Δdldh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-Δdldh)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-Δdldh)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-Δdldh上的dldh基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5的基因組發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-5的dldh基因缺失990bp，達(dá)到dldh基因缺陷的目的。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物dldh-1：5’-ACATGATTACGAATTCATGGAGCATCTGCACATGAA-3’(如SEQ ID NO:34所示)和引物dldh-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCTTATCAGAACTGATCTTCTT-3’(如SEQ ID NO:37所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的dldh基因缺陷的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6。

實(shí)施例2-7給出了構(gòu)建budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB、frdA和dldh酶失活菌株的方法，即通過基因同源重組的方式來實(shí)現(xiàn)基因缺陷從而導(dǎo)致其所編碼的酶失活。然而導(dǎo)致酶失活的方式并不限于基因同意重組，還可以是：小RNA干擾，點(diǎn)突變，加入相關(guān)酶的抑制劑等等。

實(shí)施例8：將凝結(jié)芽孢桿菌2-6的L-乳酸脫氫酶基因(lldh)插入產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的α-乙酰乳酸脫羧酶基因(budA)在基因組中上游的啟動子之后

(1)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的budA基因在基因組中上游的啟動子之后插入凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)產(chǎn)酸克雷伯氏菌基因組序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增budA基因在基因組上游和下游的同源片段。以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的基因組DNA為模板，使用引物budA-lldh-1：5’-ACATGATTACGAATTCATTGCCCTCGACCTGATGTAAC-3’(如SEQ ID NO:38所示)和引物budA-lldh-2：5’-ATTGACTTTTTTCATTACCCGCTTCCTCGTTCAAC-3’(如SEQ ID NO:39所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源片段；使用引物budA-lldh-3：5’-GCACCGATATTGTAAGTCACTACAGAAGGAATCCAGCAAT-3’(如SEQ ID NO:40所示)和引物budA-lldh-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCGCACGGCAAACTTACTTGAGCTA-3’(如SEQ ID NO:41所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游同源片段。根據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因序列(如SEQ ID NO:8所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因。以凝結(jié)芽孢桿菌2-6的基因組DNA為模板，使用引物lldh-1：5’-ACGAGGAAGCGGGTAATGAAAAAAGTCAATCGTATTGCA-3’(如SEQ ID NO:42所示)和引物lldh-2：5’-TCCTTCTGTAGTGACTTACAATATCGGTGCCATTGTTT-3’(如SEQ ID NO:43所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因片段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5分鐘；95℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到budA基因在基因組上游和下游的同源片段，以及凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因片段。

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切自殺質(zhì)粒pKR6K(Wang et al.,J.Biol.Chem.2014,289:6080-6090)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化，得到線性化的質(zhì)粒pKR6K。

使用無縫克隆和組裝試劑盒(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，將budA基因在基因組上游和下游的同源片段，以及凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因片段與線性化的質(zhì)粒pKR6K連接，得到用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6中替換budB基因?yàn)槟Y(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因的載體pKR6K-ΔbudA::lldh。

(2)攜帶凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的構(gòu)建

將pKR6K-ΔbudA::lldh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1(λpir)中，得到供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudA::lldh)。將供體菌大腸桿菌S17-1(λpir)(pKR6K-ΔbudA::lldh)與受體菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6進(jìn)行雙親本雜交，使pKR6K-ΔbudA::lldh上的budA基因上游同源片段和下游同源片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的基因組發(fā)生同源重組，從而將凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因插入到產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-6的budA基因在基因組中上游的啟動子之后。具體方法與實(shí)施例2相同，只是PCR驗(yàn)證時(shí)，使用引物budA-lldh-1：5’-ACATGATTACGAATTCATTGCCCTCGACCTGATGTAAC-3’(如SEQ ID NO:38所示)和budA-lldh-4：5’-TACCGAGCTCGAATTCGCACGGCAAACTTACTTGAGCTA-3’(如SEQ ID NO:41所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得的攜帶凝結(jié)芽孢桿菌2-6的lldh基因的菌株，命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186。

實(shí)施例9：使用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186分批發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD和L-LAC

(1)菌株選擇：選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186；

(2)種子培養(yǎng)：選用步驟(1)的菌株，在無菌條件下接種至甘油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床震蕩轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；

(3)發(fā)酵：將步驟(2)中制得的種子培養(yǎng)液接種至裝有甘油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為5％(v/v)，發(fā)酵溫度為30℃，通氣量為0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵過程中，使用25％(w/v)氫氧化鈉水溶液作為中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為7.0，發(fā)酵方式為分批發(fā)酵，當(dāng)甘油培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，停止發(fā)酵。

其中，所述甘油培養(yǎng)基的配方為：酵母粉2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 5g/L、KH₂PO₄1g/L、NH₄Cl 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、FeCl₃·6H₂O 10mg/L、CoCl₂·6H₂O 10mg/L和甘油60g/L；121℃滅菌20分鐘。

發(fā)酵14小時(shí)后，甘油培養(yǎng)基中的甘油耗盡，停止發(fā)酵，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)物組成和濃度。發(fā)酵的主要產(chǎn)物為1,3-PD和L-LAC，1,3-PD濃度為22.7g/L，L-LAC濃度為32.4g/L。副產(chǎn)物僅能檢測到少量的乙酸、甲酸和琥珀酸，乙酸濃度為0.7g/L，琥珀酸濃度為0.3g/L，丙酮酸濃度為0.4g/L。發(fā)酵液中檢測不到2,3-丁二醇、乙醇和甲酸。1,3-PD的摩爾轉(zhuǎn)化率為45.8％，L-lac的摩爾轉(zhuǎn)化率為50.0％。兩種產(chǎn)物的總轉(zhuǎn)化率為95.8％。

實(shí)施例10：使用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD和L-LAC

(1)菌株選擇：選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186；

(2)種子培養(yǎng)：選用步驟(1)的菌株，在無菌條件下接種至甘油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，搖床震蕩轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；

(3)發(fā)酵：將步驟(2)中制得的種子培養(yǎng)液接種至裝有甘油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為2.5％(v/v)，發(fā)酵溫度為37℃，通氣量為1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm，發(fā)酵過程中，使用25％(w/v)的氫氧化鈣和水的混合乳液作為中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6.5，發(fā)酵方式為分批補(bǔ)料發(fā)酵，當(dāng)甘油培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，通過向發(fā)酵罐中補(bǔ)加700g/L的甘油溶液，控制發(fā)酵液中甘油濃度為5-30g/L，當(dāng)發(fā)酵液中1,3-PD或L-LAC濃度不再升高時(shí)，停止發(fā)酵。

其中，所述甘油培養(yǎng)基的配方為：酵母粉5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 10g/L、KH₂PO₄2g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、FeCl₃·6H₂O 20mg/L、CoCl₂·6H₂O 15mg/L和甘油20g/L；121℃滅菌20分鐘。

發(fā)酵30小時(shí)后，發(fā)酵液中1,3-PD和L-LAC濃度不再升高時(shí)，停止發(fā)酵，檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)物組成和濃度。發(fā)酵的主要產(chǎn)物為1,3-PD和L-LAC，1,3-PD濃度為70.0g/L，L-LAC濃度為104.0g/L。副產(chǎn)物僅能檢測到少量的乙酸和琥珀酸，乙酸濃度為1.5g/L，琥珀酸濃度為0.7g/L。發(fā)酵液中檢測不到2,3-丁二醇、乙醇、甲酸等其他副產(chǎn)物。1,3-PD的摩爾轉(zhuǎn)化率為42.5％，L-乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為53.4％。兩種產(chǎn)物的總轉(zhuǎn)化率為95.9％。

實(shí)施例9和10只是本發(fā)明在應(yīng)用方法上的兩個(gè)較佳實(shí)施方式，其所限定的數(shù)值在合理范圍內(nèi)的變化也可以實(shí)現(xiàn)同一目的，因此不能以實(shí)施例9和10中給出的數(shù)值對本發(fā)明進(jìn)行限制。雖然實(shí)施例9和10是對產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測，證明了產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL可以生產(chǎn)高摩爾轉(zhuǎn)化率的1,3-PD和L-LAC，但是并不能僅僅理解為本發(fā)明所公開的產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)行基因改造的技術(shù)方案只適用于產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL，而應(yīng)該理解為只要是通過本發(fā)明所公開的對產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)行基因改造的技術(shù)方案所得到的人工菌都具有同時(shí)提高1,3-PD和L-LAC的摩爾轉(zhuǎn)化率和減少副產(chǎn)物的能力。此外，實(shí)施例1-10是以產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0為野生菌進(jìn)行基因改造的，若通過其他與產(chǎn)酸克雷伯氏菌PDL-0具有相同代謝通路的菌進(jìn)行同樣的基因改造，應(yīng)當(dāng)理解為也能同時(shí)提高1,3-PD和L-LAC的摩爾轉(zhuǎn)化率和減少副產(chǎn)物。

使用產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，以甘油為底物，進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，得到的發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物1,3-PD和L-LAC濃度高，副產(chǎn)物種類少且濃度低，此外，產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186易于離心和過濾，這些優(yōu)勢都有利于1,3-PD和L-LAC的高效生物法生產(chǎn)，同時(shí)有利于產(chǎn)物的提取，說明本發(fā)明的產(chǎn)酸克雷伯氏菌PLL CCTCC M 2016186，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例11：外源引入1,3-PD合成途徑

(1)菌株選擇：選用大腸桿菌K12；

(2)基因工程改造，在K12中引入外源1,3-PD合成途徑

選用產(chǎn)酸克雷伯氏菌中的1,3-PD合成途徑中的甘油脫水酶編碼基因dhaB及1,3-PD氧化還原酶編碼基因dhaT，進(jìn)行PCR克隆后連接到質(zhì)粒DNA pet-Duet上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12中。該菌確定為K12-dhaBdhaT。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。