專利名稱：一株生產(chǎn)丙酮酸的耐高溫酵母菌及其應用的制作方法
一株生產(chǎn)丙酮酸的耐高溫酵母菌及其應用技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及到一株生產(chǎn)丙酮酸的耐高溫酵母菌，光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No5434和利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法。
背景技術：
丙酮酸是最重要的化工中間體之一，在制藥、食品、化工、農(nóng)用化學品等領域以及科學研究中有廣泛用途?；瘜W法制造丙酮酸不利于環(huán)境的保護，難以滿足經(jīng)濟和社會可持續(xù)發(fā)展的需要。國內(nèi)外多年研究開發(fā)獲得了一系列丙酮酸產(chǎn)量超過50g/L，個別甚至超過100g/L的菌株,使得丙酮酸生物制造的工業(yè)化成為可能(Qiang Hua, Chen Yang, kazuyukiShimizu:J Biosci Bioeng，1999 ;Li Y，Chen J，Lun SY:AppI Microbiol Biotechnol，2001 ；Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang N:Let Appl Microbiol, 2002 ；Causey TB，Shanmugam KT，Yomano LP，Ingram LO:PNAS，2004 ;van Maris AJiGeertman JM，VermeulenA， Groothuizen MK, Winkler AA, Piper MD， van Dijken JP, Pronk JT:Appl EnvironMicrobiol, 2004 ；Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang N:Enzyme Microb Technol，2005 ;ZelicB Bolf N, Vasic-RackiD:Bioprocess Biosyst Eng, 2006 ；Liu L，Xu Q, Li Y，Shi Z，ZhuY，Du G，Chen J:Biotechnol Bioeng,2007 ；Xu P，Qiu J，Gao C，Ma C: J Biosci Bioeng,2008 ；Zhu Y，Eiteman MA, Altman R，Altman E:Appl Environ Microbiol.2008)。丙酮酸生物制造將具有污染少、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點，極具發(fā)展前景。但是高效、經(jīng)濟性地實現(xiàn)丙酮酸的生物制造，仍然有一系列的關鍵技術，其中高性能生產(chǎn)菌株的選育改造是實現(xiàn)丙酮酸生物制造的核心，其他包括發(fā)酵工藝的優(yōu)化和產(chǎn)物的綠色分離純化等也需要進一步的研究和開發(fā)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株能夠耐受高溫、生產(chǎn)丙酮酸的酵母菌和發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的方法及應用。
本發(fā)明所提供的耐高溫丙酮酸生產(chǎn)酵母菌為光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)TIB-G90已于2011年11月3日藏保于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMC`C No5434。
目前已有的利用酵母菌進行丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)都是30V左右的溫度下進行的。由于發(fā)酵生產(chǎn)將產(chǎn)生熱量，在工業(yè)生產(chǎn)過程中需要消耗大量的冷卻水來降低溫度，以維持30°C左右的發(fā)酵過程。初步計算表明利用30°C的丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)，每生產(chǎn)I噸丙酮酸將消耗50-70噸的冷卻水，如果提高發(fā)酵溫度到40°C以上，則冷卻水的用量可降低到25噸以下。所以提高丙酮酸的發(fā)酵生產(chǎn)溫度可以大幅度降低冷卻水用量，減少能量消耗，從而降低丙酮酸生產(chǎn)成本。要實現(xiàn)40°C左右較高溫的丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)，就必須有合適的耐高溫生產(chǎn)菌株。因此提高酵母菌對溫度的耐受性，使其能在高溫環(huán)境下生長良好且丙酮酸的生產(chǎn)水平不會降低對工業(yè)生產(chǎn)的意義十分重大。
為了改善菌株工業(yè)適應性，我們從光滑球擬酵母3672號(CGMCC No0879)出發(fā)，利用適應進化(adaptive evolution)的方法對菌株進行高溫環(huán)境的適應性馴化,得到一株能夠在40°C生長良好，且不影響丙酮酸積累水平的生產(chǎn)丙酮酸的酵母菌TIB-G90 CGMCCNo5434。本發(fā)明的目的是提高了菌株發(fā)酵條件的溫度，使其能夠在高溫環(huán)境下適應生長的同時不影響發(fā)酵時丙酮酸的積累量，該菌株可以在丙酮酸的工業(yè)生產(chǎn)中進行應用。
具體實施
以下為列舉的實施例，以便于更好地理解本發(fā)明。
實施例1 耐溫光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的獲得
光滑球擬酵母3672 CGMCC No0879接種于適應進化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，牛肉膏3%，KH2PO40.1%, MgSO4.7H200.05%,CaC034%。在含有IOmL培養(yǎng)基 的50ml搖瓶中于37°C、220r/min的培養(yǎng)12小時后，然后以0.2個0D600值接種于新鮮的相同培養(yǎng)基中，以相同的方法傳代培養(yǎng)。以此類推，使菌株適應37°C的環(huán)境生長穩(wěn)定后，用相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件逐漸提高生長溫度，進行適應性馴化直到溫度達到40°C，使其仍能夠穩(wěn)定生長，且增長量與出發(fā)菌株在30°C生長量基本相同，從而得到光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No5434。
實施例2 光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672 CGMCC No0879 和(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC 吣5434 的30。〇發(fā)酵對比
光滑球擬酵母3672 CGMCC No0879和TIB-G90 CGMCC No5434分別接種于種子培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，大豆蛋白胨3%，KH2PO40.1 %，MgSO4.7Η200.05 %，CaC0s3 %，在裝有 IOmL 的 50ml 搖瓶中于 30 °C、220r/min的培養(yǎng)24小時后，取5mL種子液接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%, (NH4)2S043%, KH2PO40.1%,MgSO4.7Η200.05%,維生素 Β10.00001 %,維生素 B60.0002 %,煙酸 0.0004 %,生物素0.00002%, CaC034%。在30°C、220r/min的培養(yǎng)36小時，分別用常規(guī)方法測定菌體的生長量及發(fā)酵液中丙酮酸和乙醇的含量。光滑球擬酵母TIB-G90 CGMCC No5434的0D600為36.7，丙酮酸為32.12g/l，乙醇為3.84g/l ;光滑球擬酵母3672 CGMCC No0879的0D600為34.8，丙酮酸為 29.23g/l，乙醇為 5.49g/l。
實施例3 光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) 3672 CGMCC No0879 和 TIB-G90CGMCC No5434的40°C發(fā)酵對比
光滑球擬酵母3672 CGMCC No0879和TIB-G90 CGMCC No5434分別接種于種子培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，大豆蛋白胨3%，KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η200.05 %, CaC0s3 %,在裝有 IOmL 的 50ml 搖瓶中于 40 °C、220r/min的培養(yǎng)12小時后，取5mL種子液接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%, (NH4)2S043%, KH2PO40.1%,MgSO4.7Η200.05%,維生素 Β10.00001 %,維生素 B60.0002 %,煙酸 0.0004 %,生物素0.00002%, CaC034%。在40°C、220r/min的培養(yǎng)24小時，分別用常規(guī)方法測定菌體的生長量及發(fā)酵液中丙酮酸和乙醇的含量。光滑球擬酵母TIB-G90 CGMCC No5434的0D600為40.8，丙酮酸為28.08g/l,乙醇為1.86g/l ;光滑球擬酵母3672 CGMCC No0879的為0D600為21.3，丙酮酸為9.86g/l，乙醇為6.27g/l。
實施例4 光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的 42°C搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸
光滑球擬酵母TIB-G90 CGMCC No5434接種裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的PH為5.4，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，魚蛋白胨3%，KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η200.05 %,維生素 Β10.00001 %,維生素 Β20.0002 %,維生素Β60.0002 %,維生素 Β120.0001 %，葉酸 0.0001 %，煙酸 0.0004 %,生物素 0.00002 %,CaC034%。在42°C、220r/min的搖床發(fā)酵30小時后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測定上清液中含有丙酮酸為49g/l。
實施例5 光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的 5L 發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸
光滑球擬酵母TIB-G90 CGMCC No5434接種裝有500mL種子培養(yǎng)基的3000mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的PH為6，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖5 %，酵母粉I %，CaC0s3 %。，在40 V、220r/min的搖床培養(yǎng)12小時后，把500mL培養(yǎng)液接種有5000mL發(fā)酵培養(yǎng)基7.5L發(fā)酵罐(NBSBioFlo 115)中，該培養(yǎng)基含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖15%,NH4Cl 2%，大豆蛋白胨 I %, KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η20 0.05%，維生素 Β10.00001 %，維生素 Β60.0002%,煙酸0.0004%，生物素0.00002%，通過5Μ的NaOH實時控制pH為5.5左右。在40°C，通氣量為1:1的條件下發(fā)酵48小時后，離心分離菌體， 按常規(guī)方法測定上清液中含有丙酮酸為 76g/l。
權利要求
1.一株能夠耐受高溫的產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母菌(Torulopsis glabrata)TIB-G90CGMCC No5434。
2.根據(jù)權利I要求，菌的生長及發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無機鹽和維生素，pH4.5-6.5。
3.根據(jù)權利要求2所述，其特征在于:所述碳源為質(zhì)量百分含量為5%-40%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質(zhì)水解糖液。
4.根據(jù)權利要求2所述，其特征在于:所述氮源為質(zhì)量百分含量為0.1% -5%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏和/或銨鹽和/或硝酸鹽和/或尿素。
5.根據(jù)權利要求2所述，其特征在于:所述無機鹽包括質(zhì)量百分含量為0.05% -0.5%的 KH2PO4 和 / 或 K2HPO4 和 / 或 0.01 % -0.2 % 的 MgSO4 和 / 或 I % -10 % 的 CaC03。
6.根據(jù)權利要求2所述，其特征在于:所述維生素包括質(zhì)量百分含量為0.000001% -0.01 %維生素BI和/或維生素B2和/或維生素B6和/或維生素B12和/或泛酸和/或煙酸和/或葉酸和/或生物素。
7.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5或6所述，其特征在于:光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)TIB-G90 CGMCC No5434 的生長和發(fā)酵溫度為 25_45°C。
8.根據(jù)權利要求1、2、3、4、5、6或7所述，其特征在于:光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)TIB-G90 CGMCC No5434 的發(fā)酵時間為 20h_80h。
9.根據(jù)權利要求1所述的菌株在丙酮酸生產(chǎn)中的應用。
10.根據(jù)權利要求2、3、4、5、6、7或8所述的配方和方法在光滑球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)TIB-G 90 CGMCC No5434丙酮酸的生產(chǎn)中的應用。
全文摘要
丙酮酸是一種代謝途徑中重要的有機酸，該產(chǎn)品具有廣泛的用途。本發(fā)明利用高溫適應進化的方法，篩選到一株耐受高溫的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No.5434。光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No.5434能夠在40-45℃生長良好，同時不會影響發(fā)酵液中丙酮酸的積累量。耐高溫菌株能夠減少生產(chǎn)過程中用于降低溫度所帶來的生產(chǎn)成本的增加，因此該菌株具有廣泛的工業(yè)應用前景。
文檔編號C12P7/40GK103146589SQ20111043293
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權日2011年12月7日
發(fā)明者王欽宏, 趙博, 涂然, 賀鵬, 江寧 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所