專利名稱：奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法及所用菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種絮凝劑，特別涉及一種專門用來處理奶牛養(yǎng)殖廢水的微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法；本發(fā)明還涉及該微生物絮凝劑的使用方法。
背景技術：
隨著現(xiàn)代經(jīng)濟的不斷發(fā)展，畜牧業(yè)也得到了快速的發(fā)展，規(guī)?；男竽琉B(yǎng)殖場不斷涌現(xiàn)，其對發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟、提高居民生活水平的同時卻帶來了環(huán)境的惡化——養(yǎng)殖廢水污染。其中，奶牛養(yǎng)殖廢水具有固液混雜、懸浮物多、有機質含量高、碳氮比失調、不易處理等特點，嚴重危害環(huán)境和人類健康。絮凝技術是目前國內(nèi)外用于提高水質處理效率的一種既經(jīng)濟又簡便的水處理技術，其關鍵問題是絮凝劑的選擇。目前，在畜禽養(yǎng)殖廢水處理領域中，無機絮凝劑和有機高分子絮凝劑的使用比較普遍，而其中又以聚合氯化鋁(PAC)和聚丙烯酰胺(PAM)最為常見。 近年來的研究表明無機絮凝劑如PAC在飲用水中使用過多，會導致老年癡呆癥的患者比例升高；有機高分子絮凝劑如PAM使用過程中不易被降解，且殘留單體有神經(jīng)毒性和三致效應(致畸、致癌、致突變)，這兩種類型的絮凝劑在使用過程中都會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染。從化學組成上講，微生物絮凝劑主要成分為具有兩性多聚電解質特性的糖蛋白、 蛋白質、多糖、纖維素和DNA等高分子化合物，它具有生物分解性、安全性、高效、無毒、無二次污染的優(yōu)點，其在國內(nèi)外廢水處理和研究領域顯示出巨大的潛力、展現(xiàn)了良好的前景。因此微生物絮凝劑可以作為新型的絮凝劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的絮凝劑用于水處理。目前，對微生物絮凝劑的研究主要停留在微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及條件優(yōu)化兩個方面。主要有微生物絮凝劑的產(chǎn)生率的影響因素、絮凝劑的分離純化、組成成分、作用機理、活性分析以及相關的應用的研究等。因為在技術工藝方面沒有十分成熟，所以都沒有廣泛的應用于工業(yè)上?，F(xiàn)在很多的研究都處于實驗室階段。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)能夠產(chǎn)生多糖類物質，該菌之前因其能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物來抑制真菌和細菌的活性而被關注與研究。有報道，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的絮凝劑可應用于海水的水質處理。但目前，還未看到解淀粉芽孢桿菌在養(yǎng)殖廢水領域，特別是奶牛養(yǎng)殖廢水處理中得到應用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種微生物絮凝劑，該絮凝劑專門用來處理奶牛養(yǎng)殖廢水，有助于解決奶牛養(yǎng)殖廢水處理中出現(xiàn)的成本高、易造成二次污染等技術難題。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌ZE8#Bacillus amyloliquefaciens，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2011年11月M日，保藏號CCTCC No: M2011419。本發(fā)明還同時提供了上述解淀粉芽孢桿菌的用途用于制備奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑。本發(fā)明還同時提供了上述奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法，包括如下步驟1)、制備種子液將解淀粉芽孢桿菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#CCTCC No M2011419接種于特制液體培養(yǎng)基中，于28 32°C下150 250r/min振蕩培養(yǎng)M 30小時，得種子液；2)、將種子液以2. 0 3. 0 100的體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 32°C、搖床轉速為180 250r/min的條件下培養(yǎng)36 48h，獲得發(fā)酵液；3)、將發(fā)酵液離心，所得的上清液為奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑。作為本發(fā)明的奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法的改進特制液體培養(yǎng)基為在每L的基礎液體培養(yǎng)基上添加90 IlOml COD濃度為1000 10000mg/L的奶牛養(yǎng)殖廢水；然后調節(jié)pH至7. 4 7. 6。作為本發(fā)明的奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法的進一步改進發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為將奶牛養(yǎng)殖廢水稀釋至COD為4000 6000mg/L，得稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水；在每升稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水中加入葡萄糖0. 1 5g、磷酸二氫鉀1 2g、硫酸銨0. 1 lg、硫酸鎂0. 1 0. 3g和氯化鈉0.01 0. lg，然后調節(jié)pH至7 8。本發(fā)明具體包括如下內(nèi)容1)、絮凝劑產(chǎn)生菌的分離取奶牛養(yǎng)殖廢水處理池活性污泥樣品，經(jīng)稀釋、涂板于特制的NA固體培養(yǎng)基上， 用30°C的電熱恒溫培養(yǎng)箱平板富集培養(yǎng)，挑選生長旺盛、表面光滑、有點透明的、粘稠的單個菌落，反復劃線獲取單個菌落，再進行多次劃線分離，直至獲得較純的單菌落。利用絮凝效果實驗對初篩的菌株進行復篩。最后獲得該菌株，并鑒定為解淀粉芽孢桿菌。上述特制的NA固體培養(yǎng)基由基礎NA培養(yǎng)基和奶牛養(yǎng)殖廢水組成，基礎NA培養(yǎng)基的成分組成為蛋白胨9 llg，牛肉膏2. 5 3. 5g，NaCl 4. 5 5. 5g，瓊脂15 20g和 H2O 1000ml，在上述每升的基礎NA培養(yǎng)基上添加90 110ml COD濃度為1000 IOOOOmg/ L的奶牛養(yǎng)殖廢水，并調節(jié)pH = 7. 4 7. 6 (例如可用lmol/L的NaOH進行調節(jié))，得特制的NA培養(yǎng)基。2)、微生物絮凝劑的獲得用特制液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離到解淀粉芽孢桿菌種子液，菌株種子液以 3.0) 100的體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH值為7 8(為自然值，非人為調節(jié))， 溫度為28 32°C，搖床轉速為150 250r/min，培養(yǎng)36 48h，獲得發(fā)酵液，取其上清液即為微生物絮凝劑產(chǎn)品。上述所用的特制液體培養(yǎng)基是由上述特制的NA固體培養(yǎng)基改變獲得，即不加瓊脂，其余成分和用量相同。即，基礎液體培養(yǎng)基的成分組成為蛋白胨9 llg，牛肉膏 2. 5 3. 5g，NaCl 4. 5 5. 5g和H2O 1000ml，在上述每升的基礎液體培養(yǎng)基上添加90 110ml COD濃度為1000 10000mg/L的奶牛養(yǎng)殖廢水，并調節(jié)pH = 7. 4 7. 6 (例如可用 lmol/L的NaOH進行調節(jié))，得特制液體培養(yǎng)基。
3)處理養(yǎng)殖廢水將得到的微生物絮凝劑與奶牛養(yǎng)殖廢水按1 40 60的體積比相混合，充分混勻30 45min分鐘后，經(jīng)200 300目篩進行過濾，去除濾渣。經(jīng)處理后，廢水的化學需氧量、生物需氧量和濁度等的下降程度可達無機絮凝劑聚合氯化鋁(PAC)85 90%，處理效果具有較好的優(yōu)勢。本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，奶牛養(yǎng)殖廢水在培養(yǎng)基里充當碳源和氮源，這樣就減少了一般培養(yǎng)基中50%以上的碳源和氮源，使微生物絮凝劑的成本降低50% 80%。同時利用微生物絮凝劑進行水處理，操作簡便，效果好，無毒，無二次污染，可以在自然條件下降解， 且對人畜無害。
具體實施例方式實施例1、絮凝劑產(chǎn)生菌的分離將奶牛養(yǎng)殖場所取的活性污泥IOg加入IOOOml蒸餾水進行稀釋，將上述蘇稀釋后的活性污泥用特制的NA培養(yǎng)基平板富集培養(yǎng)于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間為30小時。 挑選生長旺盛、表面光滑、有點透明的、粘稠的單個菌落，反復劃線分離獲取單菌落，直到用鏡檢確定所得的菌為較純的單菌落。上述特制的NA培養(yǎng)基平板由基礎NA培養(yǎng)基和奶牛養(yǎng)殖廢水組成，基礎NA培養(yǎng)基的成分組成為蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂20g*H20 1000ml，在上述每升的基礎 NA培養(yǎng)基上添加100ml COD濃度為5000mg/L的奶牛養(yǎng)殖廢水，并調節(jié)pH = 7. 4 7. 6 (例如可用Imo 1/L的NaOH進行調節(jié))。對所得的上述較純的單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)，溫度為30°C，搖床轉速為220r/min， 培養(yǎng)48h ；得發(fā)酵液。所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水1L(即，將奶牛養(yǎng)殖廢水經(jīng)水1 1的體積比稀釋，COD :4880mg/L)，葡萄糖3g，磷酸二氫鉀1. 5g，硫酸銨0. 5g，硫酸鎂0. 2g，氯化鈉0. 05g,用lmol/L的NaOH調節(jié)pH = 7 8。利用高嶺土懸濁液和奶牛養(yǎng)殖廢水對所篩菌株的絮凝效果實驗進行復篩，具體如下1)、利用高嶺土懸濁液的復篩在IOOml量筒中加入80ml蒸餾水，0.4g高嶺土， 5ml 1% (質量濃度)的CaCl2溶液，2ml發(fā)酵液，再加蒸餾水至100ml，調節(jié)pH值至7.0，然后倒入150ml燒杯中，放在磁力攪拌器上快速攪拌lmin，慢速攪拌5min，靜置lOmin。空白對照為將“2ml發(fā)酵液”改為“2ml發(fā)酵培養(yǎng)基”。結果觀察到有4株菌株使高嶺土懸濁液分層，包括，初步判定這4株菌株有絮凝功能。2)、利用奶牛養(yǎng)殖廢水的復篩在IOOml量筒中加入IOml奶牛養(yǎng)殖廢水，5ml 1 % 的CaC12溶液，2ml發(fā)酵液，再加蒸餾水至100ml，調節(jié)pH值至7. 0，然后倒入150ml燒杯中， 放在磁力攪拌器上快速攪拌lmin，慢速攪拌5min，靜置lOmin?？瞻讓φ諡閷ⅰ?ml發(fā)酵液”改為“2ml發(fā)酵培養(yǎng)基”。結果觀察到只有ZJ28#使奶牛養(yǎng)殖廢水分層，故確定該菌株為絮凝劑產(chǎn)生菌。該菌株利用染色觀察、生理生化鑒定以及核酸序列(如序列表所述)分析，最后確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。
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將所獲取絮凝活性最高的菌株進行保藏，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌 ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2011年11月M日，保藏號CCTCC No :M2011419。實施例2、一種微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法1)、種子液培養(yǎng)將分離到的解淀粉芽孢桿菌ZE8#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#CCTCC No :M2011419取一環(huán)接種于裝有IOOml特制液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于 300C以200r/min轉速振蕩培養(yǎng)30h，得菌株種子液。上述所用的特制液體培養(yǎng)基是由基礎液體培養(yǎng)基和奶牛養(yǎng)殖廢水組成，基礎液體培養(yǎng)基的成分組成為蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 58和H2OlOOOml,在上述每L基礎液體培養(yǎng)基上添加100ml COD濃度為7000 8000mg/L的奶牛養(yǎng)殖廢水，并用lmol/L的NaOH 調節(jié)pH = 7. 4 7. 6，得特制液體培養(yǎng)基。2)、菌株種子液以2.0 100的體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH值為7.3(為自然PH值)，溫度為30°C，搖床轉速為220r/min，培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵液。上述所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為取奶牛養(yǎng)殖廢水與水按照1 1的體積比稀釋，得稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水；經(jīng)檢測，該稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水的COD 4880mg/L。在每升稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水中加入葡萄糖3g，磷酸二氫鉀1. 5g，硫酸銨0. 5g，硫酸鎂0. 2g，氯化鈉0. 05g,用lmol/L的NaOH調節(jié) pH = 7 8。3)、將發(fā)酵液于10000 12000r/min離心15min，取其上清液即為微生物絮凝劑。 所微生物絮凝劑使高嶺土的絮凝率可達87%左右。實驗1、微生物絮凝劑的使用方法將得到的微生物絮凝劑(實施例2所得)與奶牛養(yǎng)殖廢水按1 40的體積比相混合，充分混勻30min后，經(jīng)200目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6280mg/L降至890mg/L，生物需氧量(BOD) 由 4150mg/L 降至 7Mmg/L，懸浮物(SS)由 2730mg/L 降至 332mg/L0對比實驗1 將無機絮凝劑聚合氯化鋁與奶牛養(yǎng)殖廢水1 40的體積比相混合， 充分混勻30min后，經(jīng)200目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6280mg/L降至255mg/L，生物需氧量(BOD) 由 4150mg/L 降至 18%ig/L，懸浮物(SS)由 2730mg/L 降至 76mg/L。上述數(shù)據(jù)均為養(yǎng)殖廢水的檢測數(shù)據(jù)。結果可見，微生物絮凝劑對COD、BOD和SS的去除效果分別達到了無機絮凝劑的 85. 8%,84. 6%,90. 4%。實驗2 將得到的微生物絮凝劑(實施例2所得)與奶牛養(yǎng)殖廢水按1 50的體積比相混合，充分混勻40min后，經(jīng)250目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6530mg/L降至93ang/L，生物需氧量(BOD) 由 4530mg/L 降至 812mg/L，懸浮物(SS)由 2810mg/L 降至 364mg/L。對比實驗2 將無機絮凝劑聚合氯化鋁與奶牛養(yǎng)殖廢水1 50的體積比相混合， 充分混勻40min后，經(jīng)200目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6530mg/L降至325mg/L，生物需氧量(BOD)由 4530mg/L 降至 207mg/L，懸浮物(SS)由 2810mg/L 降至 87mg/L。上述數(shù)據(jù)均為養(yǎng)殖廢水的檢測數(shù)據(jù)。結果可見，微生物絮凝劑對COD、BOD和SS的去除效果分別達到了無機絮凝劑的
89.6%,86. 0%,89. 8% 0實驗3、將得到的微生物絮凝劑(實施例2所得)與奶牛養(yǎng)殖廢水按1 60的體積比相混合，充分混勻45min后，經(jīng)300目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6880mg/L降至945mg/L，生物需氧量(BOD) 由 4750mg/L 降至 832mg/L，懸浮物(SQ 由 ^40mg/L 降至 389mg/L。對比實驗3 將無機絮凝劑聚合氯化鋁與奶牛養(yǎng)殖廢水1 60的體積比相混合， 充分混勻45min后，經(jīng)300目篩進行過濾，去除濾渣。所得的處理水的化學需氧量(COD)由6880mg/L降至335mg/L，生物需氧量(BOD) 由 4750mg/L 降至 224mg/L，懸浮物(SQ 由 ^40mg/L 降至 95mg/L。上述數(shù)據(jù)均為養(yǎng)殖廢水的檢測數(shù)據(jù)。結果可見，微生物絮凝劑對COD、BOD和SS的去除效果分別達到了無機絮凝劑的
90.7%,86. 6%,89. 7%0最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌，其特征是保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌ZESifflacillus amyloliquefaciens ZE8#，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期:2011年11月24日，保藏號=CCTCC No :M2011419。
2.如根據(jù)權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的用途，其特征是用于制備奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑。
3.如權利要求2所述的奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法，其特征是包括如下步驟1)、制備種子液將解淀粉芽孢桿菌 ZD8#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#CCTCC No :M2011419 接種于特制液體培養(yǎng)基中，于28 32°C下150 250r/min振蕩培養(yǎng)M 30小時，得種子液；2)、將種子液以2.0 3.0 100的體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于^ 32°C、搖床轉速為180 250r/min的條件下培養(yǎng)36 48h，獲得發(fā)酵液；3)、將發(fā)酵液離心，所得的上清液為奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑。
4.根據(jù)權利要求3所述的奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法，其特征是所述特制液體培養(yǎng)基為在每L的基礎液體培養(yǎng)基上添加90 IlOml COD濃度為1000 10000mg/L的奶牛養(yǎng)殖廢水；然后調節(jié)pH至7. 4 7. 6。
5.根據(jù)權利要求4所述的奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為將奶牛養(yǎng)殖廢水稀釋至COD為4000 6000mg/L，得稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水；在每升稀釋后的奶牛養(yǎng)殖廢水中加入葡萄糖0. 1 5g、磷酸二氫鉀1 2g、硫酸銨0. 1 lg、硫酸鎂 0. 1 0. 3g和氯化鈉0.01 0. lg，然后調節(jié)PH至7 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國 武漢 武漢大學；保藏日期2011年11月24日，保藏號CCTCC NoM2011419。本發(fā)明還同時公開了上述解淀粉芽孢桿菌的用途用于制備奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑。本發(fā)明還同時公開了上述奶牛養(yǎng)殖廢水專用微生物絮凝劑的制備方法。該絮凝劑專門用來處理奶牛養(yǎng)殖廢水，有助于解決奶牛養(yǎng)殖廢水處理中出現(xiàn)的成本高、易造成二次污染等技術難題。
文檔編號C12P19/04GK102433284SQ20111043193
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權日2011年12月21日
發(fā)明者劉瓊瑤, 盧燕, 曹爭易, 胡秀芳, 趙凱鵬, 黃志成 申請人:浙江理工大學