本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的生產(chǎn)二元有機(jī)酸的工程菌，以及利用其制備二元有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
：鑒于石油基化學(xué)品或燃料需求的飛速增長(zhǎng)，以及它們?nèi)找嫔叩某杀?，同時(shí)考慮到地緣政治的不穩(wěn)定對(duì)原油價(jià)格的影響以及溫室氣體排放對(duì)全球氣候的影響，急需開(kāi)發(fā)一種可再生、可持續(xù)的綠色新型工藝來(lái)生產(chǎn)這些石油基化學(xué)品或燃料。這些因素都大大的促進(jìn)了利用來(lái)源于儲(chǔ)量巨大的生物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)化學(xué)品或燃料的研究，尤其是非糧可再生資源為原料的應(yīng)用(第二代生物煉制)。目前，生物質(zhì)利用的常用工藝多分為生物質(zhì)預(yù)處理、酶解和發(fā)酵三個(gè)部分。其中預(yù)處理過(guò)程仍需要高溫、高壓、酸堿處理等高能耗、高污染工藝。另外，盡管纖維素水解酶的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到100g/L以上水平，但酶解中所應(yīng)用的纖維素酶的成本仍然過(guò)高，而且在整個(gè)工藝成本中占有極大比重，不符合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的基本要求。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，生物質(zhì)基產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝更綠色、更可持續(xù)、更符合現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)，但其生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于石油基產(chǎn)品，經(jīng)濟(jì)因素嚴(yán)重地制約著生物煉制產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。有機(jī)二元酸，以蘋(píng)果酸為例，傳統(tǒng)生產(chǎn)基于石油基材料化工催化合成，生產(chǎn)的產(chǎn)品為DL-蘋(píng)果酸，限制了其在醫(yī)藥和食品行業(yè)的應(yīng)用，需通過(guò)光學(xué)拆分來(lái)得到L-蘋(píng)果酸，以微生物發(fā)酵生產(chǎn)單一旋光性的L-蘋(píng)果酸受到人們廣泛關(guān)注和高度重視。目前，蘋(píng)果酸發(fā)酵仍存在著不少問(wèn)題，例如蘋(píng)果酸所需的發(fā)酵溫度低，常規(guī)發(fā)酵過(guò)程由于產(chǎn)熱過(guò)多，因此需要在冷卻后才能繼續(xù)發(fā)酵反應(yīng)，這不僅制約了發(fā)酵效率，而且對(duì)能源也造成了浪費(fèi)；又如，底物是葡萄糖，成本較高，而廉價(jià)的底物并不能獲得生產(chǎn)量的蘋(píng)果酸。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種利用廉價(jià)底物就能有效獲得有機(jī)二元酸，尤其是蘋(píng)果酸的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種新的用于高產(chǎn)率合成二元有機(jī)酸的工程菌株及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明第一方面，提供了一種遺傳改造的用于二元有機(jī)酸合成的工程菌株，所述的工程菌株導(dǎo)入了外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因，和/或下調(diào)了二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因，且所述的工程菌株與其出發(fā)菌株相比，二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力顯著提高，其中，所述的二元有機(jī)酸包括蘋(píng)果酸、琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸、戊二酸、己二酸。在另一優(yōu)選例中，所述的二元有機(jī)酸為蘋(píng)果酸。在另一優(yōu)選例中，所述的二元有機(jī)酸為C4-C6的二元酸。在另一優(yōu)選例中，所述的二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力為工業(yè)生產(chǎn)級(jí)。在另一優(yōu)選例中，所述工程菌株的出發(fā)菌株包括毀絲霉屬(Myceliophthora)菌株、梭孢殼霉屬(Thielavia)、曲霉屬(Aspergillus)或根霉屬(Rhizopus)；較佳地，所 述毀絲霉屬包括嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)，或異梭毀絲霉Myceliophthoraheterothallica；優(yōu)選為嗜熱毀絲霉；所述梭孢殼霉屬(Thielavia)，包括太瑞斯梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)；所述曲霉屬(Aspergillus)，包括米曲霉(Aspergillusoryzae)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、醬油曲霉(Aspergillussojae)；所述根霉屬包括米根霉(RhizopusoryzaeWentetPr.Geerl.)。在另一優(yōu)選例中，所述出發(fā)菌株基因組之間，每個(gè)相應(yīng)的二元有機(jī)酸合成正和/或負(fù)調(diào)控基因具有至少92％，較佳地至少95％，更佳地至少98％、99％的同源性。在另一優(yōu)選例中，所述的顯著提高是指，工程菌株與其出發(fā)菌株相比，二元有機(jī)酸發(fā)酵產(chǎn)量按每升發(fā)酵液的體積計(jì)，至少超過(guò)10克/升，較佳地至少10-50克/升；更佳地，至少50-300克/升；和/或所述的顯著提高是指，所述工程菌株與其出發(fā)菌株相比，二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力增強(qiáng)或提高了至少10％；較佳地至少10-50％；更佳地，至少50％-500％。在另一優(yōu)選例中，所述的正調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物包括一種或多種選自下組的多肽或其衍生多肽：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和/或所述的負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物包括一種或多種選自下組的多肽或其衍生多肽：琥珀酰輔酶A合酶、蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶如SEQIDNO.:4所示。在另一優(yōu)選例中，谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如SEQIDNO.:6所示。在另一優(yōu)選例中，蘋(píng)果酸脫氫酶如SEQIDNO.:10所示。在另一優(yōu)選例中，琥珀酰輔酶A合酶如SEQIDNO.:2所示。在另一優(yōu)選例中，蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如SEQIDNO.:8所示。在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌株同時(shí)導(dǎo)入了外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因，并下調(diào)了二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因。在另一優(yōu)選例中，所述的正調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)物還包括一種或多種選自下組的多肽或其衍生多肽：C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、丙酮酸羧化酶、蘋(píng)果酸脫氫酶或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌株通過(guò)以下方法獲得：向出發(fā)菌株中導(dǎo)入外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因；和/或下調(diào)出發(fā)菌株中二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽或其衍生多肽選自下組：(I)SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的序列一種或多種；(II)將SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能使工程菌株具有二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的一種或多種由(I)衍生的多肽；和(III)氨基酸序列與SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％、更佳地≥98％)、能使工程菌株具有二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的一種或多種多肽。在另一優(yōu)選例中，編碼所述多肽或其衍生多肽的多核苷酸序列包括：(i)編碼SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、或30所示序列的多核苷酸；(ii)SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示序列的多核苷酸；或(iii)核苷酸序列與SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)的多核苷酸；或(iv)如SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示多核苷酸的5’端和/或端截短或添加1-60個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-10個(gè))核苷酸的多核苷 酸；(v)與(i)-(iv)的任一序列互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，導(dǎo)入了外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因的工程菌株與其出發(fā)菌株(野生型)相比，所述的正調(diào)控基因在工程菌株中的表達(dá)量至少提高了50％，更佳地，至少提高了60％、70％、80％、90％、或100％。在另一優(yōu)選例中，下調(diào)了二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因的工程菌株與其出發(fā)菌株(野生型)相比，所述的負(fù)調(diào)控基因在工程菌株中的表達(dá)量至少降低了50％，更佳地，至少降低了60％、70％、80％、90％、或100％。本發(fā)明第二方面，提供了一種制備二元有機(jī)酸的方法，包括步驟：(i)提供本發(fā)明第一方面所述的工程菌株；(ii)在底物的存在下，培養(yǎng)(i)中所述的工程菌株，從而獲得含二元有機(jī)酸的發(fā)酵產(chǎn)物；和，任選地(iii)從(ii)中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，從而進(jìn)一步獲得二元有機(jī)酸。在另一優(yōu)選例中，所述的底物包括單糖、多糖、聚糖、植物生物質(zhì)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的多糖包括蔗糖，麥芽糖,纖維二糖，纖維寡糖，木二糖，木寡糖或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的單糖包括葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的聚糖包括所述的聚糖包括纖維素、結(jié)晶纖維素、半纖維素、淀粉或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述工程菌株的培養(yǎng)溫度為25-60℃，較佳地為40-55℃，更佳地，為45-50℃。本發(fā)明第三方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述工程菌株、和/或賦予或增強(qiáng)毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的方法，包括步驟：向出發(fā)菌株中導(dǎo)入外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因；和/或下調(diào)出發(fā)菌株中二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因，從而制備本發(fā)明第一方面所述的工程菌株、和/或使毀絲霉屬菌株合成二元有機(jī)酸。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟：(a1)提供攜帶外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體；(b1)將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中；(c1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；和/或所述的方法包括步驟：(a2)敲除宿主細(xì)胞中二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因；(b2)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞。本發(fā)明第四方面，提供了二元有機(jī)酸生產(chǎn)調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物的組合，所述表達(dá)產(chǎn)物的組合含有至少兩種選自下組的多肽：(Ia)SEQIDNO.:4、6、10所示的序列或其組合；或(IIa)將SEQIDNO.:4、6、10所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能賦予和/或提高毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的由(Ia)衍生的多肽；和任選的(Ib)SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、26、28、或30所示的序列或其組合；(IIb)將SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、26、28、或30所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能賦予和/或提高毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的由(Ib)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的組合至少包括SEQIDNO.:4和6所示的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的組合至少包括SEQIDNO.:6和10所示的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的組合至少包括SEQIDNO.:4和10所示的序列。本發(fā)明第五方面，提供了二元有機(jī)酸生產(chǎn)調(diào)控基因組合，所述的基因組合含有至少兩種分別編碼本發(fā)明第四方面所述表達(dá)產(chǎn)物組合中的表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸。本發(fā)明第六方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第五方面所述基因組合，和/或所述的載體含有抑制二元有機(jī)酸生產(chǎn)負(fù)調(diào)控基因的抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑為二元有機(jī)酸生產(chǎn)負(fù)調(diào)控基因(如琥珀酰輔酶A合酶)的干擾RNA、或反義核酸。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾RNA序列如SEQIDNO.:74、75所示。在另一優(yōu)選例中，所述的載體為一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞具有選自下組的特征：(a1)含有本發(fā)明第一方面所述的載體；(b1)所述的宿主細(xì)胞的染色體整合有外源的編碼SEQIDNO.:4、6、10所示的多肽的多核苷酸；或所述的宿主細(xì)胞的染色體中編碼SEQIDNO.:2、和/或8所示多肽的基因被敲除或減弱；和任選地所述的宿主細(xì)胞的染色體整合有一種或多種選自SEQIDNO.:4、6、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的多肽的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為本發(fā)明第一方面所述的工程菌株。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為毀絲霉屬菌株，較佳地為嗜熱毀絲霉。本發(fā)明第八方面，提供了本發(fā)明第四方面所述組合的用途，用于制備本發(fā)明第一方面所述工程菌株、和/或用于賦予或增強(qiáng)毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力。在另一優(yōu)選例中，所述“賦予”或“增強(qiáng)”二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力指的是經(jīng)過(guò)改造后，原先不具備二元有機(jī)酸生產(chǎn)和/或積累能力的菌株具有了二元有機(jī)酸工業(yè)化生產(chǎn)能力，和/或院系二元有機(jī)酸生產(chǎn)和/或積累能力較差的菌株具有了增強(qiáng)的二元有機(jī)酸工業(yè)化生產(chǎn)能力。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1為mae基因表達(dá)載體pAN52-mae的物理圖譜。圖2為表達(dá)載體pAN52-TB-Ptef的物理圖譜。圖3為mae基因與pyc基因共表達(dá)載體pAN52-mae-pyc的物理圖譜。圖4為mdh基因表達(dá)載體pAN52-mdh的物理圖譜。圖5為雙元載體pAN52-SCLsilent-A的物理圖譜。圖6為雙元載體pAN52-SCLsilent-B的物理圖譜。圖7為敲除載體pPK2sur-barGFP::odc的物理圖譜。圖8為質(zhì)粒pMF272的物理圖譜。圖9為不同菌株以結(jié)晶纖維素為碳源時(shí)第八天時(shí)蘋(píng)果酸產(chǎn)量圖。圖10為M.thermophila過(guò)表達(dá)不同C2-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)單邊時(shí)蘋(píng)果酸產(chǎn)量圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了一組能夠?qū)z狀真菌尤其是毀絲霉屬菌株(例如嗜熱毀絲霉)生產(chǎn)或合成二元有機(jī)酸的調(diào)控基因。其中，具有正調(diào)控作用的基因包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋(píng)果酸脫氫酶、C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,丙酮酸羧化酶,或其組合，具有負(fù)調(diào)控作用的基因包括琥珀酰輔酶 A合酶、蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其組合。發(fā)明人還通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過(guò)上調(diào)一種或多種所述正調(diào)控基因和/或下調(diào)一種或多種所述負(fù)調(diào)控基因的遺傳改造工程菌株，能夠耐受高溫，并有效地利用單糖、多糖、聚糖或混合糖，尤其是能夠利用廉價(jià)多糖(如纖維素等)，高產(chǎn)率地合成出二元有機(jī)酸，例如蘋(píng)果酸、琥珀酸等。此外，發(fā)明人還通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種調(diào)控作用具有相對(duì)的菌株種屬特異性。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。二元有機(jī)酸如本文所用，術(shù)語(yǔ)“二元有機(jī)酸”指的是每個(gè)分子在水中能且只能電離出兩個(gè)氫離子的有機(jī)酸?？捎糜诒景l(fā)明的二元有機(jī)酸包括C4-C6的二元有機(jī)酸，優(yōu)選為C4-C5的二元有機(jī)酸，例如蘋(píng)果酸、琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸，戊二酸，或己二酸。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的二元有機(jī)酸包括蘋(píng)果酸、琥珀酸。以蘋(píng)果酸為例，L-蘋(píng)果酸是一種重要的天然有機(jī)酸，廣泛用于食品、飲料、香料、醫(yī)藥保健、化工、塑料等行業(yè)。在食品工業(yè)中，L-蘋(píng)果酸可作為酸味調(diào)節(jié)劑、食品保鮮劑、食品除腥脫臭劑、面食強(qiáng)化劑等，在醫(yī)藥行業(yè)中，可添加在藥物注射液、制劑、片劑、糖漿中添加L-蘋(píng)果酸，有助于提高藥物的利用率。在日用化工領(lǐng)域，可用做除臭劑和洗滌劑成分等。蘋(píng)果酸在有機(jī)酸工業(yè)中具有重要的地位和作用，近年來(lái)國(guó)際市場(chǎng)對(duì)蘋(píng)果酸的需求量快速增加，市場(chǎng)前景廣闊。傳統(tǒng)的蘋(píng)果酸生產(chǎn)基于石油基材料化工催化合成，生產(chǎn)的產(chǎn)品為DL-蘋(píng)果酸，限制了其在醫(yī)藥和食品行業(yè)的應(yīng)用，需通過(guò)光學(xué)拆分來(lái)得到L-蘋(píng)果酸，以微生物發(fā)酵生產(chǎn)單一旋光性的L-蘋(píng)果酸受到人們廣泛關(guān)注和高度重視。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控多個(gè)新基因，不同可以提高毀絲霉屬蘋(píng)果酸(乃至有機(jī)酸)發(fā)酵，還可以通過(guò)基因改造改善具有有機(jī)酸積累能力的毀絲霉屬以外菌株，包括曲霉屬(優(yōu)選米曲霉，醬油曲霉，土曲霉，黑曲霉)，根霉屬(優(yōu)選米根霉)的有機(jī)酸生產(chǎn)能力。本發(fā)明“有機(jī)酸生產(chǎn)能力”指的是工業(yè)化的有機(jī)酸生產(chǎn)能力，即等同于術(shù)語(yǔ)二元有機(jī)酸的“工業(yè)生產(chǎn)級(jí)”、“工業(yè)化潛力”、“工業(yè)生產(chǎn)能力”、“有機(jī)酸生產(chǎn)能力”可互換使用，指的是發(fā)酵液的總體積計(jì)，發(fā)酵產(chǎn)量至少為10克/升，較佳地至少15-40克/升；更佳地，至少50-300克/升，以及在此范圍中的任意整數(shù)和非整數(shù)值，在此不再一一例舉。對(duì)于蘋(píng)果酸等有機(jī)酸發(fā)酵，傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌株為曲霉屬菌株。此外，還有些傳統(tǒng)有機(jī)酸的優(yōu)勢(shì)菌株包括但不限于：檸檬酸-黑曲霉，蘋(píng)果酸-黃曲霉、米曲霉，乳酸-米根霉。但毀絲霉屬并不屬于常見(jiàn)積累有機(jī)酸菌株，本發(fā)明試驗(yàn)表明，對(duì)天然條件下沒(méi)有明顯有機(jī)酸積累(通常不大于克級(jí)/升)的菌株(比如粗糙脈孢霉，里氏木霉)而言，通過(guò)改造其有機(jī)酸(比如蘋(píng)果酸)合成途徑，并不能有效提高其產(chǎn)量至潛在工業(yè)化能力(10克/升或以上),然而在不積累有機(jī)酸的菌株中，毀絲霉菌株(嗜熱毀絲霉,異梭毀絲霉),經(jīng)過(guò)基因改造顯著提高了有機(jī)酸(蘋(píng)果酸)合成能力(10克/升或以上),是非常令人意外的。底物如本文所用，術(shù)語(yǔ)“底物”為可在絲狀真菌存在下產(chǎn)生二元有機(jī)酸的糖類物質(zhì)，包括單糖、多糖、聚糖、以及植物生物質(zhì)或其組合，其中術(shù)語(yǔ)“單糖”包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其組合；“多糖”包括但不限于蔗糖、纖維二糖、纖維寡糖、木二糖、木寡糖或其組合，其中“聚糖”包括但不限于纖維素，半纖維素、或其組合等；植物生物質(zhì)包括但不限于農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物、能源植物或其組合等。優(yōu)選的底物的例子如下所述：葡萄糖，木糖和阿拉伯糖是三種重要的單糖。葡萄糖(Glucose)(化學(xué)式C6H12O6)又稱為玉米葡糖、玉蜀黍糖，簡(jiǎn)稱為葡糖。是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，葡萄糖在生物學(xué)領(lǐng)域具有重要地位，是活細(xì)胞的能量來(lái)源和新陳代謝中間產(chǎn)物，即生物的主要供能物質(zhì)。在糖果制造業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。工業(yè)上可以通過(guò)玉米， 木薯等為原料大量制備。木糖是一種五碳戊糖，是半纖維素組成的主要單糖，因此，木糖也廣泛的存在于玉米的穗軸、秸稈、棉桃的外皮等農(nóng)產(chǎn)品廢棄部分中?？梢杂芍参锷镔|(zhì)中半纖維素水解而來(lái)。阿拉伯糖又稱果膠糖，常與其他單糖結(jié)合，以雜多糖的形式存。阿拉伯糖在玉米皮、玉米棒芯、稻子、麥子等谷類以及甜菜、蘋(píng)果等植物細(xì)胞壁的半纖維素和果膠質(zhì)中。木糖和阿拉伯糖是生物質(zhì)降解或預(yù)處理后獲得的最主要的五碳糖，微生物通常情況下難以利用，也是生物質(zhì)全糖利用的困難所在。蔗糖，纖維二糖和木二糖是三種重要的二糖。蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，廣泛分布于植物體內(nèi)，特別是甜菜、甘蔗和水果中含量極高。蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖脫水縮合形成.被廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵行業(yè)的二糖，是多種制品的原料，如酒精、檸檬酸、乳酸、甘油、醇類、藥品等。而纖維二糖是纖維素組成的單元，可由纖維素降解而來(lái)，可進(jìn)一步水解為兩分子葡萄糖。木二糖是2個(gè)木糖由β-1，4-糖苷鍵連接而成的木寡糖，是一種直鏈二糖?？捎砂肜w維素水解而來(lái)，可進(jìn)一步分解為兩個(gè)木糖。纖維寡糖和木寡糖是兩種重要的寡糖。纖維寡糖通常是指由葡萄糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵相連而成的低聚糖。木寡糖亦為低聚木糖，是由2-7個(gè)D-木糖通過(guò)β-1，4-糖苷鍵結(jié)合而成的低聚糖，部分還可能含有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等側(cè)鏈。木二塘、木寡糖、纖維寡糖、纖維二糖主要由植物纖維素(玉米芯、甘蔗渣、秸稈等)中的纖維素、半纖維素水解后生成的產(chǎn)物。植物生物質(zhì)是自然界通過(guò)光合作用合成的有機(jī)分子組合，主要包括纖維素，半纖維素和木質(zhì)素。各類農(nóng)作物和能源植物秸稈(玉米秸稈，小麥秸稈，水稻秸稈，高粱秸稈，甘蔗渣，芒草等)，林業(yè)廢棄物(鋸末，樹(shù)枝樹(shù)葉)等都屬于重要的生物質(zhì)資源。在一定條件下，可以降解為聚糖(如木聚糖，葡聚糖)，寡糖，單糖被部分微生物發(fā)酵利用。開(kāi)發(fā)可利用生物質(zhì)水解產(chǎn)物甚至直接利用簡(jiǎn)單預(yù)處理的生物質(zhì)為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)化工產(chǎn)品(乙醇，有機(jī)酸等)是國(guó)內(nèi)外重要研發(fā)內(nèi)容。二元有機(jī)酸合成調(diào)控基因及其表達(dá)產(chǎn)物如本文所用，術(shù)語(yǔ)“二元有機(jī)酸合成調(diào)控基因”、“本發(fā)明多肽編碼多核苷酸”可互換使用，包括了“二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因和負(fù)調(diào)控基因。其中，術(shù)語(yǔ)“二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因”、“正調(diào)控基因”、“過(guò)表達(dá)基因”可互換使用，指的是一種或多種在絲狀真菌(例如毀絲霉菌、米曲霉菌、醬油曲霉菌、土曲霉菌等)中，能夠?qū)Χ袡C(jī)酸合成具有促進(jìn)或提高作用的正向基因，而術(shù)語(yǔ)“二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因”、“負(fù)調(diào)控基因”指的是一種或多種在絲狀真菌中能夠?qū)Χ袡C(jī)酸合成具有抑制或降低作用的負(fù)向基因，對(duì)其中，經(jīng)遺傳改造高表達(dá)或過(guò)表達(dá)正調(diào)控基因、或低表達(dá)或敲除負(fù)調(diào)控基因，能夠使改造后的菌株與其出發(fā)菌株相比，二元有機(jī)酸的生產(chǎn)能力具有顯著的提高。優(yōu)選地，所述正調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物包括一種或多種選自下組的本發(fā)明多肽或其衍生多肽：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋(píng)果酸脫氫酶、或丙酮酸羧化酶。所述的負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物包括一種或多種選自下組的本發(fā)明多肽或其衍生多肽：琥珀酰輔酶A合酶、蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。更優(yōu)選地，本發(fā)明多肽或其衍生多肽選自下組：(I)SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的序列；(II)將SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能使工程菌株具有二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的由(I)衍生的多肽；和(III)氨基酸序列與SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％、更佳地≥98％)、能使工程菌株具有二元有 機(jī)酸生產(chǎn)能力的多肽。所述的衍生多肽包括能使出發(fā)菌株具有二元有機(jī)酸合成能力的、SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或26所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：1-3個(gè)(通常為1-2個(gè)，更佳地1個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為3個(gè)以內(nèi)，較佳地為2個(gè)以內(nèi)，更佳地為1個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持能使出發(fā)菌株具有二元有機(jī)酸合成能力的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或幾個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)本發(fā)明多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多3個(gè)，較佳地至多2個(gè)，更佳地至多1個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu在另一優(yōu)選例中，編碼本發(fā)明多肽或其衍生多肽的多核苷酸(本發(fā)明多核苷酸)序列包括：(i)編碼SEQIDNO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、或 30所示序列的多核苷酸；(ii)SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示序列的多核苷酸；或(iii)核苷酸序列與SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)的多核苷酸；或(iv)如SEQIDNO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或25所示多核苷酸的5’端和/或端截短或添加1-60個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-10個(gè))核苷酸的多核苷酸；(v)與(i)-(iv)的任一序列互補(bǔ)的多核苷酸。本發(fā)明多核苷酸的全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種優(yōu)選的獲得本發(fā)明多核苷酸的方法一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：(1).用編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明多肽及其編碼多核苷酸序列對(duì)應(yīng)如表2所示：表2工程菌株及其制備方法本發(fā)明“工程菌”、“工程菌株”“遺傳改造菌株”可互換使用，均指的導(dǎo)入了外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因，和/或下調(diào)了二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因的工程菌株。其中，本發(fā)明工程菌與其出發(fā)菌株相比，二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力顯著提高，其中，所述的二元有機(jī)酸包括蘋(píng)果酸、琥珀酸、富馬酸、草酰乙酸，戊二酸或己二酸?？捎糜诟脑鞛楸景l(fā)明工程菌株的出發(fā)菌株通常為絲狀真菌，尤其是毀絲霉屬的絲狀真菌，例如嗜熱毀絲霉、異梭毀絲霉，優(yōu)選為嗜熱毀絲霉。野生的出發(fā)菌株通常不具備二元有機(jī)酸的合成能力，或不具備工業(yè)所需量的二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力。通常，自然狀態(tài)下可生成二元有機(jī)酸、但很快進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為下游代謝物(即無(wú)法形成二元有機(jī)酸積聚)的出發(fā)菌也在本發(fā)明出發(fā)菌的范圍內(nèi)。而經(jīng)過(guò)遺傳改造后，本發(fā)明工程菌株生產(chǎn)二元有機(jī)酸的能力顯著提高，包括原先不具備二元有機(jī)酸合成能力的菌株具備了此能力，或與出發(fā)菌株相比，該能力大幅上升。優(yōu)選地，所述“顯著提高”指的是與其出發(fā)菌株相比，工程菌的二 元有機(jī)酸生產(chǎn)能力增強(qiáng)或提高了至少10％；較佳地至少10-50％；更佳地，至少50％-500％。此外，可作改造為本發(fā)明工程菌株的出發(fā)菌株還可以包括梭孢殼霉屬(Thielavia)，較佳地，包括太瑞斯梭孢殼霉(Thielaviaterrestris)；曲霉屬(Aspergillus)，較佳地，包括米曲霉(Aspergillusoryzae)，黃曲霉(Aspergillusflavus)，醬油曲霉(Aspergillussojae)；以及米根霉屬(Rhizopus)。本發(fā)明的工程菌可采用以下方法制備獲得：(a1)提供攜帶外源性二元有機(jī)酸合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體；(b1)將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中；(c1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；和/或所述的方法包括步驟：(a2)敲除宿主細(xì)胞中二元有機(jī)酸合成負(fù)調(diào)控基因；(b2)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；其中，所述的宿主細(xì)胞為所述的出發(fā)菌株?？刹捎靡种曝?fù)調(diào)控基因的表達(dá)和/或活性的基因工程手段或物質(zhì)對(duì)本發(fā)明負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行敲除或下調(diào)，從而獲得新的轉(zhuǎn)基因工程菌。這一類物質(zhì)被稱為“本發(fā)明抑制劑”或“負(fù)調(diào)控基因抑制劑”。例如，所述的抑制劑包括負(fù)調(diào)控基因的抗體、抑制性mRNA、反義RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及鋅指轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制劑。一種優(yōu)選的抑制劑為負(fù)調(diào)控基因的siRNA，例如針對(duì)SEQIDNO.:1所示的序列。根據(jù)本發(fā)明提供的SEQIDNO.:1所示的序列，可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)抑制其表達(dá)的siRNA，優(yōu)選的siRNA基因如SEQIDNO.:74和75所示。二元有機(jī)酸生產(chǎn)調(diào)控基因或其表達(dá)產(chǎn)物的組合本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明多肽或其編碼多核苷酸的組合。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明組合同時(shí)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行改造，能夠更有效地改善菌株的二元有機(jī)酸的生產(chǎn)能力。其中，所述本發(fā)明調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)物的組合分別可以包括至少兩種選自下組的多肽：(Ia)SEQIDNO.:4、6、或10所示的序列或其組合；或(IIa)將SEQIDNO.:4、6或10所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能賦予和/或提高毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的由(Ia)衍生的多肽；和任選的(Ib)SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、26、28、或30所示的序列或其組合；(IIb)將SEQIDNO.:12、14、16、18、20、22、26、28、或30所示的序列經(jīng)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、添加或取代而形成的、能賦予和/或提高毀絲霉屬菌株二元有機(jī)酸生產(chǎn)能力的由(Ib)衍生的多肽。而本發(fā)明二元有機(jī)酸生產(chǎn)調(diào)控基因組合中所含有至少兩個(gè)多核苷酸，且所述的多核苷酸則分別對(duì)應(yīng)編碼本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物的組合中的多肽。此外，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因組合的載體，以及含有載體、或染色體整合有二元有機(jī)酸生產(chǎn)正調(diào)控基因和/或下調(diào)了二元有機(jī)酸生產(chǎn)負(fù)調(diào)控基因的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明宿主細(xì)胞的染色體整合有外源的編碼SEQIDNO.:4、6和/或10所示的多肽的多核苷酸；或所述的宿主細(xì)胞的染色體中編碼SEQIDNO.:2、和/或8所示多肽的基因被敲除或減弱；和任選地所述的宿主細(xì)胞的染色體整合有一種或多種選自SEQIDNO.:4、6、10、12、14、16、18、20、22、或26所示的多肽的多核苷酸。本發(fā)明有益效果(a)利用原生質(zhì)體或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染方法向出發(fā)菌株穩(wěn)定引入異源或同源的核酸序列，所述的核酸序列與表達(dá)調(diào)控區(qū)可操作鏈接，也包括敲除或突變或減弱表達(dá)，以及利用綠色熒光蛋白輔助篩選基因敲除轉(zhuǎn)化子。嗜熱毀絲霉目前沒(méi)有成熟的遺傳操作技術(shù)體系.本發(fā)明是首次利用遺傳工程技術(shù)，改造嗜熱毀絲霉發(fā)酵生產(chǎn)二元酸。(b)發(fā)現(xiàn)了一組絲狀真菌中影響二元酸發(fā)酵水平的新的關(guān)鍵基因，并通過(guò)在毀絲霉中進(jìn)行遺傳改造，提高了二元酸(尤其是蘋(píng)果酸)的發(fā)酵水平，包括琥珀酰輔酶A合酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蘋(píng)果酸脫氫酶。(c)在一定條件下使所述重組菌株以多種碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)二元酸，包括生物質(zhì)資源，大大降低了生物質(zhì)來(lái)源化學(xué)品發(fā)酵成本，微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸(及其他二元有機(jī)酸甚至更多的化學(xué)品成為可能)。(d)發(fā)酵溫度高，可以在40-50度(優(yōu)先45度)條件下發(fā)酵，顯著節(jié)省發(fā)酵時(shí)的冷凝費(fèi)用，降低發(fā)酵成本。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例1、在嗜熱毀絲霉中過(guò)表達(dá)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因mae1，使其獲得生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力1、mae過(guò)表達(dá)載體(pAN52-mae)的構(gòu)建以pAN52-TB-Intron(LiuQ,LiJ,YingS,WangJ,SunW,TianC,FengM.2014.Unveilingequalimportanceoftwo14-3-3proteinsformorphogenesis,conidiation,stresstoleranceandvirulenceofaninsectpathogen.EnvironMicrobiol.doi:10.1111/1462-2920.12634)為骨架構(gòu)建表達(dá)載體，以質(zhì)粒pCSN44(購(gòu)自fungalgeneticsstockcenter)為模板，在引物的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增出在TrpC啟動(dòng)子調(diào)控下潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(hph)，引物序列如下所示：hph-F:(SEQIDNO.:23)GCTCTAGACAGAAGATGATATTGAAGGAGChph-R:(SEQIDNO.:24)CCCAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGhph.PCR反應(yīng)體系為：5×phusionHFbuffer10μl，10mMdNTPs1μL，GLT-F2.5μl，GLT-R2.5μl，cDNA1μL，PhusionDNApolymerase0.5μl，水32.5μl。PCR反應(yīng)條件為：先98℃30s；然后98℃10s，65℃30s，72℃1.5min，34個(gè)循環(huán)；最后72℃10min，4℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)XbaI和HindIII酶切，連接入經(jīng)同樣酶雙酶切的線性化載體pAN52-TB-Intron，將連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明hph的核苷酸序列如SEQIDNO.:27所示，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶hph基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pAN52-hph。在引物的引導(dǎo)下以米曲霉DSM1863(DSMZ，購(gòu)自德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)有限公司)的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因mae(XM_001820829.2，SEQIDNO.:11)，經(jīng)BglII酶切后，連接入經(jīng)BglII及EcoRV酶切后線性化載體pAN52-hph，將連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，得到攜帶mae基因的載體，命名為 pAN52-hph-mae。引物如下所示：mae-F:5’(SEQIDNO.:43)：GGAAGATCTTAATTAACTCGAGCGGCCGCGTTTAAACACTAGTATGCTGACACCTCCCAAGTTTGmae-R:5’(SEQIDNO.:44)ATCCTAATCAGATACATCCTCATCTTTA以出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉ATCC42464(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，Americantypeculturecollection)基因?yàn)槟０澹琍CR擴(kuò)增出翻譯延長(zhǎng)因子編碼閱讀框(MYCTH_2298136)上游1.4kb的啟動(dòng)子(命名為Ptef啟動(dòng)子)，采用引物擴(kuò)增出SEQIDNO.:28所示的序列。引物如下所示：tef-F:(SEQIDNO.:29)CCTTAATTAACATGTACCTTGACGTCCTCCGAGtef-R：(SEQIDNO.:30)GGACTAGTTCTGAAGAACGAAACTGGCGACTPCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)PacI和SpeI酶切，連接入經(jīng)同樣酶雙酶切的線性化載體pAN52-hph-mae，將連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，得到在啟動(dòng)子tef調(diào)控下mae基因表達(dá)載體，命名為pAN52-mae，表達(dá)載體的物理圖譜如圖1所示。2、將表達(dá)載體(pAN52-mae)導(dǎo)入嗜熱毀絲霉2.1將嗜熱毀絲霉ATCC42464在MM斜面培養(yǎng)基[50×Vogel’s鹽20mL，蔗糖20g，瓊脂15g，組氨酸(50mg/mL)20mL，定容體積到1L，高壓滅菌。50×Vogel’s鹽(1L)：檸檬酸三鈉(1/2H2O)150g，無(wú)水KH2PO4250g，無(wú)水NH4NO3100g，MgSO4·7H2O10g，CaCl2·2H2O5g，微量元素鹽溶液5mL，生物素(0.1mg/mL)2.5mL，定容體積到1L。]上45℃培養(yǎng)10天后待用2.2嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化1)菌絲體準(zhǔn)備將成熟的嗜熱毀絲霉孢子，用0.05％吐溫80滅菌水收集，經(jīng)擦鏡紙過(guò)濾出去菌絲后，涂布于鋪有玻璃紙的MM平板，45℃培養(yǎng)14h。2)原生質(zhì)體制備將帶有菌絲的玻璃紙放置于30mL裂解液(配方：0.15g裂解酶，無(wú)菌操作加入30mL溶液A，過(guò)濾除菌；溶液A:1.0361g磷酸二氫鉀，21.864g山梨醇，溶于90mL去離子水，氫氧化鉀調(diào)PH到5.6，定量至100mL，高溫滅菌)中，28℃裂解2h，每隔20min輕輕搖動(dòng)。而后經(jīng)過(guò)玻璃紙過(guò)濾后，2000rpm4℃離心10min，棄上清，加入4mL溶液B(0，735g氯化鈣，18，22g山梨醇，1mLTrisHCl1MpH7.5，溶于90mL去離子水，鹽酸調(diào)PH到7.6，定量至100mL，高溫滅菌)，2000rpm4℃離心10min；棄上清，按200uL/質(zhì)粒加入一定體積溶液B。3)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化預(yù)冷的15ml離心管，依次加入50ul預(yù)冷PEG(12.5gPEG6000，0，368g氯化鈣，500ulTrisHCl1MpH7.5。)，10ul用HindIII線性化的質(zhì)粒pAN52-mae，200uL原生質(zhì)體。放置冰上20min后加入2mL預(yù)冷PEG，室溫5min，加入4mL溶液B，輕輕混勻。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相應(yīng)抗生素MM培養(yǎng)基中，置于平板中，45℃培養(yǎng)，2d-4d后于體式顯微鏡下挑取單個(gè)菌絲體于相應(yīng)抗性平板生長(zhǎng)2.3嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證1)基因組提取采用酚氯仿法從上述轉(zhuǎn)化過(guò)程中挑選的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，具體包括以下操作：1)2.0mL的無(wú)菌的DNA提取管中加入200mg的鋯珠及1mL的裂解液(lysis buffer，配方：0.2MTris·HCl(pH7.5)，0.5MNaCl，10mMEDTA，1％SDS(w/v))，挑取平板中生長(zhǎng)的嗜熱毀絲霉菌絲于DNA提取管中。2)將所有DNA提取管置于助磨器上，最大轉(zhuǎn)速振蕩30s，重復(fù)兩次。3)65℃水浴30分，在水浴過(guò)程中每個(gè)幾分鐘取出漩渦振蕩。4)水浴結(jié)束后取出，每管加入80μlpH7.5的1M的Tris·HCl中和。5)加入400μl的酚：氯仿(1:1)，13000rpm離心5分鐘。6)取300μl上清液于新的1.5mLEP管中，加入600μl95％的乙醇(DNA級(jí))。7)冰上孵育一小時(shí)，隨后4℃、13000rpm離心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。8)用75％的酒精(DNA級(jí))400μl清洗，4度13000rpm離心，輕輕取出上清液。9)將EP管置于真空濃縮儀中，真空干燥酒精。10)加入50μlddH2O溶解DNA，用NanoDrop測(cè)DNA濃度，測(cè)完濃度后將提取的DNA置于-20冰箱保存，以備下一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證2)PCR驗(yàn)證嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子以提取的基因組DNA為模版，用引物tef-F及mea-R對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系為：5×phusionGCbuffer4μl，10mMdNTPs0.2μl，引物各1μL，基因組1μL，DMSO0.6μL，PhusionDNApolymerase0.1μL，水12.1μL。PCR反應(yīng)條件為：先98℃30s；然后98℃10s，62℃30s，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min，4℃10min.3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(110V電壓，30分鐘)，在凝膠成像系統(tǒng)下看基因擴(kuò)增條帶，顯示在上游引物tef-F和下游引物mae-R引導(dǎo)下經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了2360bp目的條帶，該條帶表明經(jīng)hindIII線性化的pAN52-mae整合到了嗜熱毀絲霉基因組中。3、嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)蘋(píng)果酸能力測(cè)定將上述驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方：碳源75g/L，蛋白胨6.0g/L，0.15g/LKH2PO4，0.15g/LK2HPO4，0.10g/LCaCl2·2H2O，0.10g/LMgSO4·7H2O，碳酸鈣80.0g/L，1mL/L0.5g/L生物素，1ml/L微量元素液；微量元素配方(100mL)：5gC6H8O·7H2O，5gZnSO4·7H2O，1gFe(NH4)2(SO4)·6H2O，0.25gCuSO4·5H2O，0.05gMnSO4·H2O，0.05gH3BO3，0.05gNaMoO4·2H2O，溶于水中，定容至100mL)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣測(cè)定蘋(píng)果酸含量。1)樣品處理：取1mL發(fā)酵液于15mL離心管中，并添加1mL1MH2SO4，而后80℃下放置30min，每個(gè)隔0min進(jìn)行充分震蕩。之后將2mL雙蒸水添加至離心管中，充分震蕩后，取1mL液體于1.5mL離心管中，12000rpm離心10min，取上清液測(cè)定蘋(píng)果酸含量。2)蘋(píng)果酸含量測(cè)定處理后的樣品用高效液相色譜測(cè)定蘋(píng)果酸含量，其中檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，5mMH2SO4為流動(dòng)相，流速為0.5mL/min。結(jié)果顯示mae在嗜熱毀絲霉中過(guò)表達(dá)時(shí)，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最高的菌株命名為JG141，第八天在相應(yīng)碳源時(shí)蘋(píng)果酸產(chǎn)量為42g/L(如圖9)。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明嗜熱毀絲霉經(jīng)過(guò)遺傳改造后可以利用包括結(jié)晶纖維素在內(nèi)的碳源進(jìn)行蘋(píng)果酸發(fā)酵。實(shí)施例2將不同來(lái)源的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因在嗜熱毀絲霉中過(guò)表達(dá)，獲得重組微生物能夠顯著提高蘋(píng)果酸生產(chǎn)能力。1.C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性比對(duì)分析本實(shí)施例選取來(lái)自米曲霉NRRL3488的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AO090023000318，mae，SEQIDNO.:12)與粗糙脈孢菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XP_958365，NCmae，SEQIDNO.:14)、里氏木霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XP_006963989，Trmae，SEQIDNO.:16)、嗜熱毀絲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XP_003663832，Mtmae，SEQIDNO.:18)、黑曲霉NRRL599C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XM_001398094，Anmae，SEQIDNO.:20)、醬油曲霉NBRC4239C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Asmae，SEQIDNO.:22)。2.C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)載體啟動(dòng)子構(gòu)建以出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉ATCC42464基因?yàn)槟０澹琍CR擴(kuò)增出翻譯延長(zhǎng)因子編碼閱讀框tef(MYCTH_2298136)上游1.0kb的啟動(dòng)子，其反應(yīng)體系和條件見(jiàn)實(shí)施例1步驟1。根據(jù)構(gòu)建的質(zhì)粒不同，PCR擴(kuò)增所用引物為：tef-2F:GAAGATCTCATGTACCTTGACGTCCTCCGAG(SEQIDNO.:55)tef-2R:GGACTAGTTCTGAAGAACGAAACTGGCGACT(SEQIDNO.:56)PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)BglⅡ與SpeI酶切，連接入經(jīng)同樣酶雙酶切的線性化載體pAN52-TB-Intron，將連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，得到的重組載體，命名為pAN52-TB-Ptef，其物理圖譜見(jiàn)圖2.3.C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建3.1以粗糙脈孢菌(購(gòu)自FGSC)基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Ncmae(SEQIDNO.:13)，PCR擴(kuò)增所用引物為：NCmae-F：GGACTAGTATGGGCAGCCAGCCTCCCATGC(SEQIDNO.:45)NCmae-R：CGGAATTCCTAATGATCCTCCACATCCTCA(SEQIDNO.:46)3.2以里氏木霉(購(gòu)自ATCC)基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Trma(SEQIDNO.:15)，PCR擴(kuò)增所用引物為：Trmae-F：GGACTAGTATGAAAGCGGCATTCCCTCATGC(SEQIDNO.:47)Trmae-R：CGGAATTCTCAGTGATCCTCCACATTCTCATC(SEQIDNO.:48)3.3以嗜熱毀絲霉ATCC42464(購(gòu)自ATCC)基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Mtmae(SEQIDNO.:17)，PCR擴(kuò)增所用引物為：Mtmae-F：CGGACTAGTATGTCAACACCGCGGCGAAG(SEQIDNO.:49)Mtmae-R：CCGGAATTCTTAATGATCCTCCACGTCCTC(SEQIDNO.:50)3.4以黑曲霉NRRL599基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Anmae(XM_001398094)(SEQIDNO.:19)，PCR擴(kuò)增所用引物為：Anmae-F：GGACTAGTATGAACGTTGAAACGAGC(SEQIDNO.:51)Anmae-R：CGGAATTCTCATTCAGACACATCCTCAT(SEQIDNO.:52)3.5以醬油曲霉NBRC4239基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Asmae(SEQIDNO.:21)，PCR擴(kuò)增所用引物為：Asmae-F：GCTCTAGAATGCTGACACCTCCCAAGTTTGAGGATG(SEQIDNO.:53)Asmae-RCCTTAATTAACTAATCAGATACATCCTCATCTTTACCC(SEQIDNO.:54)上述經(jīng)PCR擴(kuò)增并分析獲得的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因片段，使用限制性核酸內(nèi)切酶SpeI與EcoRI酶切PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pAN52EF-Intron。然后采用T4DNA連接酶連接，獲得了表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pAN52-Ptef-Ncmae、pAN52-Ptef-Trmae、pAN52-Ptef-Mtmae、pAN52-Ptef-Anmae、pAN52-Ptef-Asmae。4.嗜熱毀絲霉重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)蘋(píng)果酸分析(1)獲得嗜熱毀絲霉重組轉(zhuǎn)化子將構(gòu)建的基因表達(dá)載體(pAN52-Ptef-Ncmae、pAN52-Ptef-Trmae、pAN52-Ptef-Mtmae、pAN52-Ptef-Anmae、pAN52-Ptef-Asmae)，整合至出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉菌株基因組，以終濃度為100ug/mL草銨膦為篩選抗生素，其方法見(jiàn)實(shí)施例1 步驟2。利用引物tef-2F和對(duì)應(yīng)基因克隆的下游引物，驗(yàn)證得到轉(zhuǎn)化子，PCR體系及方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟1.3。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉中過(guò)表達(dá)來(lái)自不同物種C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其蘋(píng)果酸的產(chǎn)量分別可達(dá)到(如圖10)：37.9g/L(Ncmae)，26.1g/L(Mtmae)，16.6g/L(Trmae)，0.24g/L(Anmae)和59.4g/L(Asmae)。說(shuō)明粗糙脈孢菌C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嗜熱毀絲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、里氏木霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、醬油曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、可以用于構(gòu)建嗜熱毀絲霉蘋(píng)果酸工業(yè)化發(fā)酵菌株。但值得注意的是，雖然黑曲霉和米曲霉的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性較高(約90％左右)，但在本實(shí)驗(yàn)中來(lái)自黑曲霉的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在嗜熱毀絲霉中表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)化子沒(méi)有表現(xiàn)出適用于工業(yè)應(yīng)用的蘋(píng)果酸生產(chǎn)能力。由此可見(jiàn)，即使在本身就具有蘋(píng)果酸累積能力的曲霉屬菌株中，其所含有的高同源性的蛋白也無(wú)法均使其他菌株具備更優(yōu)異的蘋(píng)果酸生產(chǎn)能力。而對(duì)于來(lái)自不同屬菌株的基因，本發(fā)明人則進(jìn)行了更多的實(shí)驗(yàn)以探索，包括來(lái)自有機(jī)酸積累非優(yōu)勢(shì)菌株(粗糙脈孢霉、里氏木霉等)的基因，是否能夠通過(guò)代謝工程方法，利用這些基因，提高自身或其他菌株二元酸生產(chǎn)能力。實(shí)施例3、在嗜熱毀絲霉中同時(shí)過(guò)表達(dá)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因mae及丙酮酸羧化酶pyc，加強(qiáng)其生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力1、mae及pyc共表達(dá)載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pAN52-TB-Intron為模板，在引物的介導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增出構(gòu)巢曲霉gpdA的啟動(dòng)子，PCR條件及體系見(jiàn)實(shí)施例1步驟1，命名為AngpdA(SEQIDNO.:84)。引物如下ANgpadA-F：(SEQIDNO.:61)CCTTAATTAAGTCCAGATCATGGTTGACCGGTGANgpdA-R：(SEQIDNO.:62)GAACCTCCTTCAGAGAGGTTCGTGTTTAAACTGATGTCTGCTCAAGCGGGGTA而后利用引物以出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉基因組為模板，PCR擴(kuò)增出纖維二糖水解酶編碼基因cbh(MYCTH_109566)終止子(SEQIDNO.:85)。引物如下：CBH-F：(SEQIDNO.:63)ACCCCGCTTGAGCAGACATCAGTTTAAACACGAACCTCTCTGAAGGAGGTTCCBH-R：(SEQIDNO.:64)CCCAAGCTTCTAATAGGGATAATAAGCTAGGGTC采用融合PCR的方法將序列g(shù)pdA啟動(dòng)子及cbh終止子連接在一起，具體方法為采用基因重疊延伸(SOE)方法，由Hortonetal.1989發(fā)明(HortonRM，HuntHD，HoSN，PullenJK，PeaseLR.1989.Engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicing-by-overlapextension.Gene77:61-68)。將An_gpdA啟動(dòng)子及cbh終止子通過(guò)HindIII酶切得到粘性末端，連入經(jīng)同樣酶雙酶切的pAN52-mae體中得到重組載體：pAN52-mae-PgpdA-Tcbh。以米曲霉DSM1863的cDNA為模板，在引物PYC-F(SEQIDNO.:57)和PYC-R(SEQIDNO.:58)的介導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增丙酮酸羧化酶編碼基因pyc(XM_001820829.2，SEQIDNO.:25)，經(jīng)PmeI酶切后，連入經(jīng)同樣酶酶切的pAN52-mae-PgpdA-Tcbh中，將重組質(zhì)粒用引物PYC-F和PYC-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，再進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果確認(rèn)為pyc基因的核苷酸序列，表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶pyc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，命 名為pAN52-mae-pyc，表達(dá)載體的物理圖譜如圖3示。2、嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子利用結(jié)晶纖維素生產(chǎn)蘋(píng)果酸能力的測(cè)定將mae及pyc共表達(dá)載體pAN52-mae-pyc經(jīng)BglII線性化后整合至出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉基因組，其方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟2。利用引物mae-F(SEQIDNO.:43)和mae-R(SEQIDNO.:44)(驗(yàn)證mea整合在基因組中)，PYC-F和PYC-R(驗(yàn)證pyc整合到基因組中)，驗(yàn)證得到轉(zhuǎn)化子，PCR體系及方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟1.3。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以葡萄糖，D-木糖，纖維二糖，木聚糖，結(jié)晶纖維素，蔗糖，可溶性淀粉，玉米芯木糖渣，玉米芯脫木素為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉中同時(shí)過(guò)表達(dá)mae與pyc在時(shí)，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其中一株菌株命名為JG207，第八天時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)化子利用各種碳源發(fā)酵時(shí)的蘋(píng)果酸的產(chǎn)量：62g/L(葡萄糖)，28g/L(D-木糖)，78.7g/L(纖維二糖)，61.3g/L(木聚糖)，63g/L(結(jié)晶纖維素)，36.3g/L(蔗糖)，46.3g/L(可溶性淀粉)，36.8g/L(玉米芯木糖渣)，55.15g/L(玉米芯脫木素)。實(shí)施例4、在嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子中過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因mdh，進(jìn)一步加強(qiáng)其生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力1、mdh過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建以pAN52-TB-Intron為模板，在引物的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增出在來(lái)自構(gòu)巢曲霉的色氨酸合成酶編碼基因的啟動(dòng)子PtrpC(SEQIDNO.:86)。引物如下：Trpc-F:CTTTCTAGACGACGTTAACTGATATTGAAGGAGC(SEQIDNO.:65)Trpc-R:CGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATTTGGATGCTTGGGTAGAATAGGTAA(SEQIDNO.:66)利用引物以質(zhì)粒pEGFP-N2為模板，PCR擴(kuò)增出新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因neo(GI:339515868)，反應(yīng)體系及條件見(jiàn)實(shí)施例1步驟1。引物如下：NEO-F：(SEQIDNO.:67)TTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGNEO-R:(SEQIDNO.:68)AAAAAAAGCTTGGTACCATCGATGCGGCCGCCCGCGGTCAGAAGAACTCGTCAA。采用融合PCR的方法將序列PtrpC及neo連接在一起，具體方法為采用基因重疊延伸(SOE)方法。將PtrpC及neo通過(guò)XbaI和HindIII酶切得到粘性末端，連入經(jīng)同樣酶雙酶切的pAN52-TN-Intron中，得到能以neo為篩選標(biāo)記的重組載體，命名為：pAN52-TN。將出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因上游1.5K的啟動(dòng)子MtPgpdA進(jìn)行序列優(yōu)化，以除去酶切位點(diǎn)，人工合成后如序列SEQIDNO.:69)。以此為模板，在引物的介導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增出MtPgpdA，經(jīng)BglII和BamHI酶解后，連入用相同酶雙酶切線性化的載體pAN52-TN，從而得到含有g(shù)pdA啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒：pAN52-TN-MtPgpdA。引物如下：MtPgpdA-F：(SEQIDNO.:70)TGCAGATCTTTAATTAACTCGAGTGACGGTGCTTTTCACCTCTCMtPgpdA-R:(SEQIDNO.:71)AGTGGATCCGAATTCGATATCGTTTAAACACTAGTTTTGATTTCTGTGATGTGG以出發(fā)菌株嗜熱毀絲霉cDNA為模板，利用引物PCR擴(kuò)增出嗜熱毀絲霉中蘋(píng)果酸脫氫酶編碼基因mdh(MYCTH_2315052)。引物如下：MtMDH-F:CGGACTAGTATGGTCAAAGCTGTCGTTGCTG(SEQIDNO.:59)MtMDH-R:CGCGGATCCTCACTTCTGGGGGGGGTTGTG(SEQIDNO.:60)。用SpeI和BamHI后，連如用同樣酶雙酶切的線性化質(zhì)粒pAN52-TN-MtPgpdA，從而得到mdh表達(dá)重組載體，命名為：pAN52-mdh，表達(dá)載體的物理圖譜如圖4所示。2、嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)蘋(píng)果酸能力的測(cè)定將mdh過(guò)表達(dá)載體pAN52-mdh經(jīng)BglII線性化后整合至嗜熱毀絲霉JG207菌株基因組，以終濃度為100ug/mLG418為篩選抗生素，其方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟2。利用引物MtPgpdA-F和MtMDH-R，驗(yàn)證得到轉(zhuǎn)化子，PCR體系及方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟1.3。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉中同時(shí)過(guò)表達(dá)mae與pyc在時(shí)，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其中一株菌株命名為JG319，第八天時(shí)蘋(píng)果酸產(chǎn)量為75g/L(如圖9)，轉(zhuǎn)化率達(dá)1.0g/gAvicel。實(shí)施例5、利用RNA干擾技術(shù)抑制琥珀酰輔酶A合酶的表達(dá)，提高蘋(píng)果酸發(fā)酵水平1、干擾載體的構(gòu)建上游的啟動(dòng)子，分別命名為P1和P2啟動(dòng)子SEQIDNO.:72和73)，用BglII和PmeI酶解后，分別連入用相同酶雙酶切線性化的載體pAN52-TB-Intron，得到含的重組質(zhì)粒分別命名為pAN52-TB-Psilent-A和pAN52-TB-Psilent-B.利用引物PCR擴(kuò)增出嗜熱毀絲霉琥珀酰輔酶A合酶編碼基因scl的第一段干擾序列SCL-S1(SEQIDNO.:74)，引物如下：SCL1-F:CCATCGATCATCAAGAACCTGTACCGCATC(SEQIDNO.:31)SCL1-R:GGGTTTAAACCAATGATGGGGATCTTCAGGTC(SEQIDNO.:32)。利用引物PCR擴(kuò)增出嗜熱毀絲霉琥珀酰輔酶A合酶編碼基因scl的第二條干擾序列SCL-S2(SEQIDNO.:75)。SCL2-F:CGCGGATCCCAATGATGGGGATCTTCAGGTC(SEQIDNO.:33)SCL2-R:CGCGGATCCGTTTAAACCATCAAGAACCTGTACCGCATC(SEQIDNO.:34)。將scl的兩段干擾序列分別用ClaI/PmeI和BamHI酶解后，依次連接至用同樣酶酶切的線性化質(zhì)粒pAN52-TB-Psilent-A和pAN52-TB-Psilent-B，從而得到了含有SCL基因干擾序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄元件和篩選標(biāo)記bar基因的雙元載體：pAN52-SCLsilent-A和pAN52-SCLsilent-B，其物理圖譜如圖5和圖62、干擾琥珀酰輔酶A合酶的表達(dá)顯著提高微生物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力將含有SCL基因干擾序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄元件和篩選標(biāo)記bar基因的雙元載體pAN52-SCLsilent-A和pAN52-SCLsilent-B，分別整合至嗜熱毀絲霉JG207菌株基因組，以終濃度為100ug/mL草銨膦為篩選抗生素，其方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟2。利用引物Intron-F(AGCTGTTTACTCATTATTAC，SEQIDNO.:76)和SCL2-R(SEQIDNO.:34)，驗(yàn)證得到轉(zhuǎn)化子，PCR體系及方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟1.3。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉JG207中整合pAN52-SCLsilent-A后，其蘋(píng)果酸產(chǎn)量與其起始菌株JG207相似，第八天時(shí)蘋(píng)果酸產(chǎn)量為68g/L。而嗜熱毀絲霉JG207中整合pAN52-SCLsilent-B后，其蘋(píng)果酸產(chǎn)量與其起始菌株JG207相比有了顯著的提高，其中產(chǎn)量最高的菌株命名為JG207S，蘋(píng)果酸最終產(chǎn)量(發(fā)酵第八天)為74.8g/L(如圖 9)，相比JG207菌株提高了15.3％。本實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)時(shí)間調(diào)控啟動(dòng)子控制的RNA干擾序列發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄，干擾TCA循環(huán)關(guān)鍵酶編碼基因的翻譯，從而減弱三羧酸循環(huán)，顯著提高微生物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力。此后，發(fā)明人以粗糙脈孢霉為宿主，利用其單基因突變體篩選除了新的微生物蘋(píng)果酸生產(chǎn)的關(guān)鍵基因，即天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在以下實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人對(duì)這些新發(fā)現(xiàn)的與二元酸合成相關(guān)的基因進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)施例6調(diào)控嗜熱毀絲霉蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭途徑中的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，可以顯著提高微生物合成蘋(píng)果酸的能力1.天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體的構(gòu)建在已公開(kāi)的嗜熱毀絲霉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息(http://genome.jgi.doe.gov/Spoth2/Spoth2.home.html)，查找編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，設(shè)計(jì)引物對(duì)以嗜熱毀絲霉基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶核酸序列CI7941(MYCTH_2314321)(SEQIDNO.:3)。用BSpeI與EcoRI酶解后，連入用相同酶雙酶切線性化的載體pAN52-TN-MtPgpdA，得到的重組質(zhì)粒分別命名為pAN52gpdA-CI7941，引物如下：CI7941-F：GGACTAGTATGGCGCCGACGTCAACAACG(SEQIDNO.:35)CI7941-R：CGGAATTCTCATTGCACCTCCCGAACCAC(SEQIDNO.:36)2.嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)蘋(píng)果酸能力的測(cè)定將天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)載體pAN52gpdA-CI7941整合至嗜熱毀絲霉AS2菌株(整合來(lái)自醬油曲霉的Asmae過(guò)表達(dá)載體的嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子，詳細(xì)見(jiàn)實(shí)施例2)基因組，以終濃度為100ug/mLG418為篩選抗生素，其方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟2。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉AS2基礎(chǔ)上整合有該天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最高的一株菌株命名為CN201，第八天時(shí)蘋(píng)果酸的最產(chǎn)量為69.2g/L(如圖9)，以對(duì)照菌株AS2相比提高超過(guò)了10％。本實(shí)施例說(shuō)明蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭途徑相關(guān)基因天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的過(guò)表達(dá)，能夠提高微生物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力。實(shí)施例7調(diào)控嗜熱毀絲霉蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭途徑中的谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以顯著提高微生物合成蘋(píng)果酸的能力1.谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建在已公開(kāi)的嗜熱毀絲霉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息(http://genome.jgi.doe.gov/Spoth2/Spoth2.home.html)，查找編碼谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，設(shè)計(jì)引物對(duì)：CI1241-F：GGACTAGTATGTCCAAGGCCGCAACTGTC(SEQIDNO.:35)CI1241-R：CGGAATTCCTACGCCGTCTTTGCGTTCATC(SEQIDNO.:36)以嗜熱毀絲霉基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶核酸序列CI1241(MYCTH_2300593)(SEQIDNO.:5)。用BSpeI與EcoRI酶解后，連入用相同酶雙酶切線性化的載體pAN52-TN-MtPgpdA，得到的重組質(zhì)粒分別命名為pAN52gpdA-CI1241。2、嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)蘋(píng)果酸能力的測(cè)定將谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)載體pAN52gpdA-CI1241整合至嗜熱毀絲霉AS2菌株(整合來(lái)自醬油曲霉的Asmae過(guò)表達(dá)載體的嗜熱毀絲霉轉(zhuǎn)化子，詳細(xì)見(jiàn)實(shí)施例2)基因組，以終濃度為100ug/mLG418為篩選抗生素，其方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟2。將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以結(jié)晶纖維素(Avicel)為碳源培養(yǎng)基中(配方見(jiàn)實(shí)施例1步驟3)，接種量為2.5*105個(gè)/mL，45℃，150rpm培養(yǎng)，第八天取樣。樣品經(jīng)實(shí)施例1步驟3.2所述方法進(jìn)行處理后，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在嗜熱毀絲霉中同時(shí)過(guò)表達(dá)醬油曲霉Asmae和嗜熱毀絲霉谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CI1241)，能顯著促進(jìn)蘋(píng)果酸的生產(chǎn)，其中一株菌株命名為CN202，第八天時(shí)蘋(píng)果酸的最產(chǎn)量為66.9g/L(如圖9)，以對(duì)照菌株AS2相比提高超過(guò)了10％。本實(shí)施例說(shuō)明蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭途徑相關(guān)基因谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá)，能夠提高微生物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力。實(shí)施例8蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因缺失能夠提高嗜熱毀絲霉菌株CN2生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力(1)蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其上下游同源臂核酸片段擴(kuò)增在已公開(kāi)的嗜熱毀絲霉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息(http://genome.jgi.doe.gov/Spoth2/Spoth2.home.html)，查找編碼蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MYCTH_2081554,SEQIDNO.:91)及其上下游同源臂核酸序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)：CI4837-UF：GCTCTAGATGCTTGCAGGAACTCTCTGTGAAACC(SEQIDNO.:39)CI4837-UR：GCGTTAACCCCACAGTTTGGAGAGACGACATCG(SEQIDNO.:40)CI4837-DF：CCTTAATTAATGTATATACGGGGCGAATACGAAGG(SEQIDNO.:41)CI4837-DR：CGGAATTCTTCCTCCTGCAAACTCAGCTTGAG(SEQIDNO.:42)。以嗜熱毀絲霉基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因上下游同源臂核酸序列UL和DL，經(jīng)北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序并經(jīng)NCBIBlast比對(duì)分析。(2)蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除載體構(gòu)建以質(zhì)粒pPK2surGFP為模板，采用引物對(duì)擴(kuò)增Sur基因片段(GI:2547090)擴(kuò)增Sur基因片段,引物如下：Sur-F:GCTCTAGAGTTAACGCGGCCGCGACTAGATCTGTGCCAACGCCACAG(SEQIDNO.:77)Sur-R:CGGAATTCGTTTAAACTTAATTAACCGACGGAATTGAGGATATCAGTCAC(SEQIDNO.:78)使用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI與EcoRI酶PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pPK2barGFP，然后采用T4DNA連接酶連接，獲得了質(zhì)粒pPK2sur-barGFP。上述經(jīng)PCR擴(kuò)增并測(cè)序分析獲得的蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因上下游同源臂片段，使用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI與HpaI酶切上游同源臂PCR產(chǎn)物，PacI與EcoRI酶切下游同源臂PCR產(chǎn)物。采用相同的酶酶切質(zhì)粒pPK2sur-barGFP，采用T4DNA連接酶連接，依次將上下游同源臂連接于載體pPK2sur-barGFP，獲得了敲除載體：pPK2sur-barGFP::odc(如圖7)。(3)基因敲除載體pPK2sur-barGFP::odc轉(zhuǎn)化嗜熱毀絲霉AS2，獲得轉(zhuǎn)化子用PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子，用位于嗜熱毀絲霉蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因5`端上游同源臂外端的引物CI4837－F2和位于sur基因內(nèi)部的Sur-R2對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物序列如下：CI4837－F2：CAGACTGTGTGGTTCTGCAACAGG(SEQIDNO.:87)Sur-R2：GGCCAACAGTACGAAGCATTTCG(SEQIDNO.:88)PCR結(jié)果顯示，用CI4837－F2和Sur-R能夠擴(kuò)增出大小為3kb的片段，說(shuō)明 Sur基因已經(jīng)替換了蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因CI4837。同時(shí)用蘋(píng)果酸-α酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因doc的ORF擴(kuò)增引物CI4837-F與CI4837-R對(duì)轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下：CI4837-F：ATGGCGTCAGCAAAGGAGAAGG(SEQIDNO.:89)CI4837-R：CTACGCCTCGCCATCCCTAATC(SEQIDNO.:90)PCR結(jié)果顯示，用引物CI4837-F與CI4837-R未能擴(kuò)增出任何片段，說(shuō)明所得到的轉(zhuǎn)化子為純核。(4)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵生產(chǎn)蘋(píng)果酸以250ml三角燒瓶做為發(fā)酵容器，每瓶發(fā)酵體系為50ml。蘋(píng)果酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：微晶纖維素7.5％，蛋白胨6.0g/L，0.15g/LKH2PO4，0.15g/LK2HPO4，0.10g/LCaCl2.2H2O，0.10g/LMgSO4.7H2O，碳酸鈣80.0g/L，1ml/L微量元素液(5gNaCl，5gFeSO4·7H2O，1gcitricacid/L水)。采用生理鹽水溶液收集獲得的32株轉(zhuǎn)化子，經(jīng)2層擦鏡紙過(guò)濾后，計(jì)算孢子的數(shù)量，接種量均為2.5*105個(gè)/ml。于45℃，150rpm振蕩培養(yǎng)，分別在第4天、第6天和第8天取樣，樣品處理后，進(jìn)行HPLC分析蘋(píng)果酸含量。其中一株菌株命名為CN203第8天蘋(píng)果酸產(chǎn)量為70.5克/升(如圖9)，相比對(duì)照菌株菌株AS2，蘋(píng)果酸產(chǎn)量提高超過(guò)了10％。實(shí)施例9在粗糙脈孢霉中過(guò)表達(dá)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，未能獲得工業(yè)生產(chǎn)級(jí)的蘋(píng)果酸的能力1.C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建以粗糙脈孢菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因核酸序列Ncmae(NCU07517)(SEQIDNO.:13)。PCR擴(kuò)增所用引物NCU7517-F：GCTCTAGAATGGGCAGCCAGCCTCCCATGC(SEQIDNO.:79)和NCU7517-R：CCTTAATTAACTAATGATCCTCCACATCCTCA(SEQIDNO.:80)。以米曲霉DSM1863基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因核酸序列mae(SEQIDNO.:11)。PCR擴(kuò)增所用引物為Asmae-F：GCTCTAGAATGCTGACACCTCCCAAGTTTGAGGATG(SEQIDNO.:53)mae-2R：CCTTAATTAACTAATCAGATACATCCTCATCTTTACCC(SEQIDNO.:81)上述經(jīng)PCR擴(kuò)增分析獲得的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因片段，使用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI與PacI酶切PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pMF272(其物理圖譜如圖8)。然后采用T4DNA連接酶連接，獲得表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pMF272-Nrmae、pMF272-mae。2.將C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因整合至粗糙脈孢霉基因組中C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)載體pMF272-Nrmae和pMF272-mae轉(zhuǎn)入粗糙脈孢霉FGSC9015后，將驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子全部接種至250mL三角瓶中的50mL以D-葡萄糖為碳源培養(yǎng)基中(配方：葡萄糖100.0g/L，蛋白胨6.0g/L，0.15g/LKH2PO4，0.15g/LK2HPO4，0.10g/LCaCl2.2H2O，0.10g/LMgSO4.7H2O，碳酸鈣80.0g/L，1ml/L微量元素液(5gNaCl，5gFeSO4·7H2O，1gcitricacid/L水)，接種量為1*106個(gè)/mL，25℃，200rpm培養(yǎng)，第4天取上清液，測(cè)定發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量。結(jié)果顯示在粗糙脈孢霉FGSC9015表達(dá)來(lái)自粗糙脈孢霉的Ncmae后，其蘋(píng)果酸的最高產(chǎn)量為2.7g/L；在粗糙脈孢霉FGSC9015表達(dá)來(lái)自米曲霉的mae后，其蘋(píng)果酸的最高產(chǎn)量為2.5g/L。與對(duì)照菌株粗糙脈孢霉FGSC9015(產(chǎn)量為1.5g/L)相比，C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)雖然有所上升，但無(wú)法滿足工業(yè)應(yīng)用需要。本試驗(yàn)表明，對(duì)于有機(jī)酸積累非優(yōu)勢(shì)菌株，比如粗糙脈孢菌，通過(guò)改造蘋(píng)果酸合成途徑(比如過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)不能有效提高其蘋(píng)果酸合成能力至工業(yè)化生產(chǎn)能力。盡管有報(bào)導(dǎo)表明在有機(jī)酸積累優(yōu)勢(shì)菌株曲霉屬菌株，通過(guò)改造蘋(píng)果酸合成途徑可以提高有機(jī)酸合成至工業(yè)化水平，但這在有機(jī)酸積累非優(yōu)勢(shì)菌株中并不具備推廣 性。實(shí)施例10.在里氏木霉中過(guò)表達(dá)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，未能提高微生物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力1、米曲霉C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SEQIDNO.:11)過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建從曲霉DSM1863的cDNA中PCR擴(kuò)增C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的編碼閱讀框mae(SEQIDNO.:11)，引物如下：Amae-F：TTCCAACTAGTATGCTGACACCTCCCAAG(SEQIDNO.:82)Amae-R：AATGGTTAACCTAATCAGATACATCCTC(SEQIDNO.:83)PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用限制性內(nèi)切酶SpeI和HpaI消化PCR產(chǎn)物，并將其插入到質(zhì)粒pCY01(含有潮霉素抗性基因，在多克隆酶切位點(diǎn)兩邊分別是嗜熱毀絲霉的延長(zhǎng)因子的啟動(dòng)子和曲霉trpC終止子)SpeI和HpaI酶切位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pNEO-Amae。將質(zhì)粒pNEO-Amae利用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)入里氏木霉QM6a中，所得轉(zhuǎn)化子為QM6a-Amae。2、里氏木霉過(guò)表達(dá)C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重組菌株的產(chǎn)酸能力檢測(cè)培養(yǎng)基如實(shí)施例1所述，將1.25×107個(gè)孢子接種至50ml產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，150rpm，28度培養(yǎng)8天，取1ml發(fā)酵液加入到1ml2M的硫酸中，80度反應(yīng)20min，加2ml水，混勻后，14000rpm離心10min，取上清，按照實(shí)施例1的方法，利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)上清中的蘋(píng)果酸含量。出發(fā)菌2.5±0.6g/L，轉(zhuǎn)化子最高蘋(píng)果酸產(chǎn)量為2.4±0.4g/L。結(jié)果顯示C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在里氏木霉中的表達(dá)未能顯著提高其合成蘋(píng)果酸發(fā)酵工業(yè)化能力。本試驗(yàn)表明，對(duì)于有機(jī)酸積累非優(yōu)勢(shì)菌株，比如里氏木霉，通過(guò)改造蘋(píng)果酸合成途徑(比如過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)不能有效提高其蘋(píng)果酸合成能力至工業(yè)化生產(chǎn)能力。盡管有報(bào)導(dǎo)表明在有機(jī)酸積累優(yōu)勢(shì)菌株曲霉屬菌株，通過(guò)改造蘋(píng)果酸合成途徑可以提高有機(jī)酸合成至工業(yè)化能力，但這在有機(jī)酸積累非優(yōu)勢(shì)菌株中并不具備推廣性。實(shí)施例11、在嗜熱型真菌Myceliophthoraheterothallica中過(guò)表達(dá)mae和pyc，使其獲得生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力本實(shí)施例說(shuō)明丙酮酸羧化酶和C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在嗜熱性真菌(M.heterothallica)中表達(dá)，獲得的重組微生物能夠顯著提高蘋(píng)果酸生產(chǎn)能力。表達(dá)mae基因和pyc基因的載體pAN52-mar-pyc(構(gòu)建方法見(jiàn)實(shí)施例1步驟1)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化菌株M.heterothallicaCBS202.75，以潮霉素基因hph為選擇性標(biāo)記，篩選獲得多株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子以7.5％微晶纖維素Avicel為底物進(jìn)行蘋(píng)果酸發(fā)酵，其培養(yǎng)基成份見(jiàn)實(shí)施例1步驟3，結(jié)果如下圖。以出發(fā)菌株M.heterothallicaCBS202.75作為參照，其中，27號(hào)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵第八天轉(zhuǎn)化子的蘋(píng)果酸產(chǎn)量提高到47.4g/L。本試驗(yàn)表明，通過(guò)代謝工程改造，可以顯著提高異梭毀絲霉蘋(píng)果酸合成能力，與本發(fā)明實(shí)施例9，10比較可以發(fā)現(xiàn)，毀絲霉屬菌株改造后可以大副提高有機(jī)酸(蘋(píng)果酸)合成，而這一發(fā)現(xiàn)不具備可預(yù)見(jiàn)性。實(shí)施例12、重組嗜熱毀絲霉蘋(píng)果酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝建立1.孢子培養(yǎng):將重組嗜熱毀絲霉JG207在5L發(fā)酵罐(BIOTECH-5JG，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中進(jìn)行發(fā)酵，方法如下：重組嗜熱毀絲霉JG207接種到MM平板培養(yǎng)基，將平板放在45℃培養(yǎng)箱生長(zhǎng)8d。用0.8％NaCl和0.1％Tween-80洗孢子并計(jì)數(shù)。2.種子液培養(yǎng):將2.5×107個(gè)孢子轉(zhuǎn)接到含100ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，45℃，150rpm培養(yǎng)24h后的菌液即為發(fā)酵的種子。采用合成培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn) 行發(fā)酵。5L發(fā)酵罐裝3.3L發(fā)酵培養(yǎng)基，400ml種子液。MM固體培養(yǎng)基(每升)成分為20g蔗糖、20ml50×Vogel’ssalt、15g瓊脂。50×Vogel’ssalt(g/L)成分為：125gNa3citrate·2H2O、250gKH2PO4、100gNH4NO3、10gMgSO4·7H2O、0.1gCaC12·2H2O、5ml微量元素溶液、2.5mlBiotin、755ml水。種子培養(yǎng)基(每升)成分為10g葡萄糖、0.15gK2HPO4、0.15gKH2PO4、0.1gMgSO4·7H2O、0.1gCaC12、6gBactopeptone、1ml微量元素溶液。微量元素溶液的成分(g/L)為：5gCitricacid·1H2O、5gZnSO4·7H2O、1gFe(NH4)2(SO4)2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、0.05gMnSO4·1H2O、0.05gH3BO3、0.05gNa2MoO4·2H2O。發(fā)酵培養(yǎng)基(每升)成分為75g碳源、80gCaCO3、0.15gK2HPO4、0.15gKH2PO4、0.1gMgSO4·7H2O、0.1gCaC12、6gBactopeptone、0.5mlBiotin、1ml微量元素溶液。補(bǔ)料培養(yǎng)基(每升)成分為：0.45gK2HPO4、0.45gKH2PO4、0.3gMgSO4·7H2O、0.3gCaC12、18gBactopeptone、1.5mlBiotin、3ml微量元素溶液。3.發(fā)酵工藝:發(fā)酵溫度45℃，空氣流量4L/min，溶氧控制在30％。為了使溶氧控制在30％，轉(zhuǎn)速需與溶氧偶聯(lián)，轉(zhuǎn)速保持在200-800rpm。發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加碳酸鈣將pH控制在6.0以上。發(fā)酵第48h采用模擬指數(shù)流加補(bǔ)料方式開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，平均補(bǔ)料速度是8ml/h。發(fā)酵的第72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h分別補(bǔ)加60g碳源。自發(fā)酵48h后，每隔24h取1ml菌液，加入1ml2MH2SO4混勻后于80℃高溫處理25min，再加入1ml無(wú)菌水，14000rpm離心10min，取上清使用HPLC(Waterse2695高效液相色譜儀)測(cè)蘋(píng)果酸含量。發(fā)酵周期是240h-264h，蘋(píng)果酸產(chǎn)量可一直增加。重組嗜熱毀絲霉菌株以多種碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)蘋(píng)果酸的方法跟上述方法一致。以葡萄糖為碳源，蘋(píng)果酸產(chǎn)量是230g/L。以Avicel為碳源，蘋(píng)果酸產(chǎn)量是168g/L。以秸稈為碳源，蘋(píng)果酸產(chǎn)量是95g/L。實(shí)施例13、蘋(píng)果酸的分離制備蘋(píng)果酸的分離制備一般分為蘋(píng)果酸的提取粗制、精制和結(jié)晶三個(gè)步驟。1.蘋(píng)果酸的提取粗制:發(fā)酵液經(jīng)過(guò)酸解、過(guò)濾、中和、過(guò)濾、酸解、過(guò)濾等六個(gè)步驟處理，得到粗制蘋(píng)果酸溶液。將發(fā)酵液放入酸解槽中，用硫酸酸解至PH1.6，酸解要在攪拌下緩慢進(jìn)行。酸解完成后，用板框壓濾機(jī)濾除石膏渣、菌體及其他沉淀物。將濾液放入中和槽中，加入CaCO3固體和石灰乳，將PH調(diào)到7.5。中和液放入沉淀濾槽中，靜置7h，讓溶液中的蘋(píng)果酸鈣鹽充分結(jié)晶沉淀下來(lái)。上述鈣鹽體系澄清之后，除去上清液，再放開(kāi)濾槽的假底，過(guò)濾，用少量冷水洗滌濾餅，除去大部分可溶雜質(zhì)。將蘋(píng)果酸鈣轉(zhuǎn)到酸解槽中，加入2倍重量的溫水，攪拌成懸浮液，加入硫酸酸化至PH1.6，繼續(xù)攪拌約半小時(shí)，再靜置數(shù)小時(shí)讓石膏渣沉淀充分析出。用壓濾機(jī)濾去上述體系中的石膏渣，這時(shí)的濾液為粗制蘋(píng)果酸溶液，其中還含有微量丁二酸等有機(jī)酸，以及Ca2+、Mg2+等金屬離子和色素等，下一步進(jìn)行精制。2.蘋(píng)果酸的精制:采用離子交換和活性炭聯(lián)合處理法。蘋(píng)果酸母液依次經(jīng)過(guò)CAL型粒狀活性炭脫色柱、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂732、陰離子交換樹(shù)脂D315、BPL型柱狀活性炭吸附柱和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的5柱純化系統(tǒng)。處理時(shí)，粗制蘋(píng)果酸溶液依次通過(guò)上述5柱系統(tǒng)，液流都是有上而下，流速用7～8L/min，流出液用紫外吸收分析儀監(jiān)測(cè)不飽和脂肪酸含量。如果有不飽和脂肪酸流出，則要返回陰離子交換樹(shù)脂D315柱重新處理。CAL型粒狀活性炭脫色柱的作用是脫色，并能除去部分不飽和脂肪酸。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂732除去金屬離子。陰離子交換樹(shù)脂D315除去丁二酸等陰離子。將上述純度較高的蘋(píng)果酸溶液在70℃下減壓濃縮。再冷卻到20℃，加入適量晶 種，在緩慢攪拌下結(jié)晶，3h使蘋(píng)果酸結(jié)晶出來(lái)。蘋(píng)果酸晶體的干燥在真空條件下進(jìn)行，溫度控制在40～50℃。實(shí)施例14對(duì)具有有機(jī)酸積累的野生菌株進(jìn)行改造并檢測(cè)其有機(jī)酸生產(chǎn)能力在本實(shí)驗(yàn)中，分別構(gòu)建了蘋(píng)果酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化了具有有機(jī)酸積累能力的曲霉屬(包括黑曲霉、醬油曲霉、米曲霉)，構(gòu)成了多個(gè)轉(zhuǎn)化子并采用葡萄糖作為反應(yīng)底物，方法見(jiàn)上述實(shí)施例中各轉(zhuǎn)化子構(gòu)建方法的組合，并對(duì)其產(chǎn)物及產(chǎn)量進(jìn)行了鑒定。其中轉(zhuǎn)化后的工程菌株編號(hào)及產(chǎn)物如表3所示：表3鑒定結(jié)果表明，在改造了相應(yīng)基因后，醬油曲霉、米曲霉的蘋(píng)果酸生產(chǎn)能力均有顯著提升，分別達(dá)到了20-60克/升以上，其中改善了兩種基因的PM102菌株獲得了更佳的表現(xiàn)?？梢?jiàn)，本發(fā)明基因?qū)τ诔霭l(fā)菌株就具有二元酸累積作用的菌株而言，均能顯著有效提高其二元酸生產(chǎn)能力。小結(jié)對(duì)于蘋(píng)果酸等有機(jī)酸發(fā)酵,傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌株為曲霉屬菌株(優(yōu)選黑曲霉-檸檬酸,衣糠酸-土曲霉,蘋(píng)果酸-黃曲霉,米曲霉)以及根霉屬菌株(米根霉-乳酸).但木霉屬和脈孢霉菌株不屬于常見(jiàn)積累有機(jī)酸菌株,試驗(yàn)表明,對(duì)這些天然條件下沒(méi)有明顯有機(jī)酸積累的菌株而言,通過(guò)改造其有機(jī)酸(比如蘋(píng)果酸)合成途徑,通常不能有效提高其產(chǎn)量至潛在工業(yè)化能力(10克/升或以上).說(shuō)明曲霉屬有機(jī)酸合成途徑改造顯著提高有機(jī)酸合成結(jié)論不能推廣到整個(gè)絲狀真菌，尤其是非有機(jī)酸積累菌株，包括毀絲霉屬等是否具有有機(jī)酸合成工業(yè)化能力，不具備推測(cè)能力，需要具體試驗(yàn)探索。出乎預(yù)料的是,本發(fā)明人首次表明毀絲霉屬菌雖然天然條件下培養(yǎng)基中并不大量積累有機(jī)酸(通常不能超過(guò)克級(jí)/升),但通過(guò)改造可以具備工業(yè)化發(fā)酵蘋(píng)果酸能力(10-100克/升及以上),因此本發(fā)明具有很大偶然性和創(chuàng)新性。同時(shí),發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控多個(gè)新基因,不僅可以提高毀絲霉屬蘋(píng)果酸(乃至有機(jī)酸)發(fā)酵,這些基因改造在具有有機(jī)酸積累能力的毀絲霉屬以外菌株,包括曲霉屬(優(yōu)選米曲霉,醬油曲霉,土曲霉,黑曲霉),根霉屬(優(yōu)選米根霉)等可以提高有機(jī)酸發(fā)酵生產(chǎn)能力。另外,發(fā)明人建立和優(yōu)化了嗜熱毀絲霉高溫發(fā)酵工藝,包括葡萄糖發(fā)酵和固體生物質(zhì)發(fā)酵補(bǔ)料工藝。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單 獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3