一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法為敲除纖維素酶生產(chǎn)菌株的淀粉酶基因。其中，一種纖維素酶高產(chǎn)菌株為敲除淀粉酶基因的黑曲霉，通過將重組片段淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達(dá)單元-淀粉酶基因的后半部分連接到pCAMBIA1300質(zhì)粒上得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉敲除淀粉酶基因。本發(fā)明利用基因敲除技術(shù)，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，細(xì)胞負(fù)荷減少，從而有利于產(chǎn)生大量的纖維素酶，得到的纖維素酶高產(chǎn)菌株纖維素酶活性達(dá)到21U/g。
【專利說明】一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產(chǎn)生的纖維素達(dá)到100億噸左右，利用纖維素生產(chǎn)生物能源，是緩解能源危機(jī)，實(shí)現(xiàn)人類可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。
[0004]纖維素利用的關(guān)鍵是把纖維素降解為可發(fā)酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內(nèi)切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中內(nèi)切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關(guān)鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色，條件溫和，轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，但是纖維素酶較高的生產(chǎn)成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0005]獲得高產(chǎn)纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產(chǎn)成本成為纖維素酶工業(yè)化利用的必由之路。纖維素酶的生產(chǎn)菌株主要有黑曲霉和里氏木霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認(rèn)為是生產(chǎn)纖維素酶最有應(yīng)用前景的菌株之一，但是纖維素酶的酶活相對于工業(yè)化應(yīng)用的需求而言優(yōu)勢較低，構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶的菌株，成為黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶工業(yè)化利用的途徑之一。構(gòu)建纖維素酶高產(chǎn)菌株有用物理誘變、化學(xué)誘變、基因工程構(gòu)建基因工程菌株等。用物理誘變和化學(xué)誘變的方法具有快捷有效的有點(diǎn)，但是誘變是一個(gè)隨機(jī)的過程，缺乏方向性。基因工程構(gòu)建菌株就有可操控的方向性，已經(jīng)成為構(gòu)建高產(chǎn)菌株的主要手段?；蚯贸?，能打破已有的代謝網(wǎng)絡(luò)，代謝網(wǎng)絡(luò)的改變，有利于獲得更高產(chǎn)量的菌株。
[0006]黑曲霉在生產(chǎn)纖維素酶的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生大量的其它酶類，這些酶類的翻譯和分泌對大量生產(chǎn)纖維素酶不利。因?yàn)檫@些酶類的翻譯和分泌一方面要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，另外一方面其合成和分泌消耗細(xì)胞的大量能源，加重了細(xì)胞負(fù)荷。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種纖維素酶高產(chǎn)菌株。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法，為敲除纖維素酶生產(chǎn)菌株的淀粉酶基因。
[0009]所述的纖維素酶生產(chǎn)菌株優(yōu)選為黑曲霉和里氏木霉。
[0010]一種纖維素酶高產(chǎn)菌株，為敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
[0011]優(yōu)選的，所述的敲除淀粉酶基因的黑曲霉通過包含如下步驟的方法制備得到:
(1)合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達(dá)單元-淀粉酶基因的后半部分的重組片段；將該重組片段連接到PCAMBIA1300質(zhì)粒上得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒；
(2)用淀粉酶基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；(3)將含有淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和黑曲霉混合培養(yǎng)，通過潮霉素B抗性篩選得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
[0012]更優(yōu)選的，步驟(1)為:合成如SEQ ID N0.1所示的重組片段(淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達(dá)單元-淀粉酶基因的后半部分)，用NcoI酶切JfpCAMBIA1300質(zhì)粒用NcoI酶切；將酶切后的重組片段和質(zhì)粒通過DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH5 α得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒pCAMBIA1300-gh。
[0013]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
本發(fā)明利用基因敲除技術(shù)，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶基因后，細(xì)胞負(fù)荷減少，從而有利于產(chǎn)生大量的纖維素酶。
[0014]本發(fā)明通過基因工程的基因敲除技術(shù)得到纖維素酶活性達(dá)到21 U/g的高產(chǎn)菌株，酶活提高了近2倍。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0016]實(shí)施例1
A、淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)重組片段的合成
重組片段由淀粉酶基因的前半部分(SEQ ID N0.2)，潮霉素B抗性基因表達(dá)單元(SEQID N0.3)，淀粉酶基因的后半部分(SEQ ID N0.4)組成，合成的重組片段(SEQ ID N0.1)用NcoI 酶液 2 μ L (TakaRa 購買)，30 °C酶切 16 h。
[0017](2) PCAMBIA1300 提取及酶`切
含有PCAMBIA1300質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli DH5 α于37 1:振蕩培養(yǎng)12 h。取1.5 mL菌體于EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。加0.1 mL溶液1( 1%葡萄糖,50 mM EDTApH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。加入 0.2 mL 溶液 11(0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min。加入0.15 mL預(yù)冷溶液III (5 mo I/L KAc, pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5 min。以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10 min。再以10000 rpm離心20 min，棄上清。用70%乙醇0.5 mL洗滌一次，抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0018]提取的pCAMBIA1300 質(zhì)粒 50 μ L 加入 NcoI 酶液 2 μ L (TakaRa 購買)，30 °〇酶切16 h，酶切后65 °C水浴10 min。
[0019](3)連接
酶切的合成片段100 μ L和酶切的質(zhì)粒20 μ L用5 μ L Τ4 DNA ligase (TakaRa購買)16 °C連接24 h。
[0020]B、感受態(tài)細(xì)胞制備
(I)將E.coli DH5a置于LB培養(yǎng)基上，在37 °C下過夜培養(yǎng)。
[0021](2)高溫滅菌大的離心瓶(250_500mL)以備第二天搖瓶用。
[0022](3)準(zhǔn)備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用。
[0023](4)轉(zhuǎn)移0.2-1 mL過夜培養(yǎng)物至裝有20 mL LB (或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基)的100 mL搖瓶。[0024](5)37 °〇下劇烈振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。
[0025](6)監(jiān)控0.D.600值(培養(yǎng)I小時(shí)后每半小時(shí)測定一次)。
[0026](7)當(dāng)0.D.600值達(dá)到0.5-1.0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0027](8)細(xì)胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0028](9)用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0029]( 10)照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液。
[0030]( 11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。
[0031](12)離心，棄上清液。
[0032](13)用20 mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞。
[0033](14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會(huì)很松散)。
[0034](15)用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2-3 mL。
[0035](16)將細(xì)胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于-80 °C保存。
[0036]C、轉(zhuǎn)化大腸桿菌
(I)在冰上解凍B步驟制得的感受態(tài)細(xì)胞。
[0037](2)每100 UL感受態(tài)細(xì)胞添加10 μ L連接的質(zhì)粒，冰上培育約5分鐘。
`[0038](3)轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2 mm電穿孔容器中。
[0039](4)加載電轉(zhuǎn)化儀，準(zhǔn)備好300 yL LB培養(yǎng)基。
[0040](5)對電穿孔容器進(jìn)行脈沖(200歐姆，25 μ Fd, 2.5千伏)(檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上)。
[0041](6)立即添加300 μ L的LB至電穿孔容器中。
[0042](7)37 °C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至I小時(shí)以復(fù)原。
[0043](8)轉(zhuǎn)移細(xì)胞至含有卡那霉素(100 Pg/mL)選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。長出為含有質(zhì)粒pCAMBIA1300-gh 的轉(zhuǎn)化子。
[0044]D、淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的提取
C步驟得到的轉(zhuǎn)化子37 1:振蕩培養(yǎng)12 h。取1.5 mL菌體于EP管，以4000 rpm離心3 min，棄上清液。加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH
8.0)充分混合。加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。加入0.15 mL預(yù)冷溶液III (5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,冰浴5 min。以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min。再以10000 rpm離心20 min,棄上清。用70%乙醇0.5 mL洗漆一次,抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0045]E、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備:液體保存的農(nóng)桿菌涂布于LB培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)，等到單菌落長出后，挑取單菌落，接種于5 mL的液體培養(yǎng)基，28 0C >150 r/m培養(yǎng)24 h，按照1:10的接種比例接種于5 mL新鮮的液體培養(yǎng)基中，28 0C >150 r/m培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)的菌體冰浴40min, 5000 r/m 離心 5 min,用 10 mL 的 0.02 mol/L CaCl2 菌體重懸菌體。再次 5000 r/m 離心5 min,菌體懸浮于I mL的0.02 mol/L CaCl2溶液,放置于冰上保藏。
[0046]取提取的質(zhì)粒pCAMBIA1300_gh I μ L與40 μ L的農(nóng)桿菌感受態(tài)懸液混合，輕輕搖動(dòng)混合5 min后，在液氮上迅速冰凍5 min，37 °C水浴5 min。加入1 mL液體LB培養(yǎng) 基，28 1：輕輕震蕩4 h。菌體5000 r/m離心5 min，棄去上清液，加入LB培養(yǎng)基50 yL，震 蕩重新懸浮液體。液體涂布于含有100呢/mL卡那霉素的LB平板上，長出的菌落接種于含 有100 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中28 °C、150 r/m培養(yǎng)24 h。
[0047]F、農(nóng)桿介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉敲除淀粉酶基因
黑曲霉（從ATCC購買，菌株編號(hào)ATCC10582，Aspergillus niger)接種于PDA培養(yǎng)基 斜面上，37 °C培養(yǎng)72 h，用滅菌的蒸餾水沖洗下孢子，孢子用蒸餾水稀釋到108個(gè)孢子/ mL。孢子與等體積的含有質(zhì)粒pCAMBIA1300-gh的農(nóng)桿菌混合均勻，加入乙酰丁香酮至200 umol/L,30 1：避光培養(yǎng)24 h。然后把孢子涂布在平板上（200 g 土豆用1 L自來水煮沸 30min，紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g可溶性淀粉、20 g瓊脂、200 y mol頭孢噻 肟、200 mg潮霉素B)，30 °C培養(yǎng)到長出菌落。菌落周圍無透明圈的為基因敲除的菌株，篩 選得到不產(chǎn)淀粉酶的菌株，酶活達(dá)到21.0 U/g。出發(fā)菌株在相同條件下的酶活為10.7 U/ g°
[0048]纖維素酶酶活測定：以濾紙為底物，在50 °C進(jìn)行酶降解反應(yīng)。在25 mL試管中加 A 10 mL pH 5. 0的0. 05 M朽1檬酸緩沖液，加入濾紙條2 g( 1 cmX5 cm),加入發(fā)酵液離心 后上清液2 mL，在水浴鍋中50 °C保溫30 min，然后用沸水煮沸5 min。用DNS法測定還原 糖的含量。酶活定義為：每分鐘釋放出1 Mmol還原糖所需要的酶量。
[0049]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:敲除纖維素酶生產(chǎn)菌株的淀粉酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于:所述的纖維素酶生產(chǎn)菌株為黑曲霉和里氏木霉。
3.—種纖維素酶高產(chǎn)菌株，其特征在于:為敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
4.權(quán)利要求3所述的纖維素酶高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)合成淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達(dá)單元-淀粉酶基因的后半部分的重組片段；將該重組片段連接到PCAMBIA1300質(zhì)粒上得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒； (2)用淀粉酶基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌； (3)將含有淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和黑曲霉混合培養(yǎng)，通過潮霉素B抗性篩選得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的纖維素酶高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于步驟(1)為:合成如SEQ ID N0.1所示的重組片段，用NcoI酶切；將pCAMBIA1300質(zhì)粒用NcoI酶切；將酶切后的重組片段和質(zhì)粒通過DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH5 α得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒pCAMBIA1300-gh。
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK103865949SQ201410084774
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】薛棟升 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)