技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一株高產(chǎn)谷胱甘肽的酵母菌株。
背景技術(shù)：
：：谷胱甘肽(gsh)，是l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的生物活性三肽化合物，廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中。其在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，特別是對維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著重要的作用，因而被廣泛應(yīng)用于臨床、食品和化妝品行業(yè)中。gsh的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法等。化學(xué)合成法是以三種前體氨基酸為原料進(jìn)行化學(xué)合成，但因?yàn)樗没钚援a(chǎn)物不易分離致使產(chǎn)品純度不高而限制其應(yīng)用。酶法合成是利用三種底物氨基酸和生物體內(nèi)的gsh合成有關(guān)的酶，通過添加少量atp來合成gsh，該法操作復(fù)雜成本較高。發(fā)酵法可利用廉價(jià)的糖為原料，通過特定的微生物代謝合成gsh，操作簡單，成本較低，且生產(chǎn)速度快，易于擴(kuò)大規(guī)模。因此，發(fā)酵法生產(chǎn)gsh越來越受到人們的重視。在微生物界，gsh產(chǎn)生菌主要集中在真核酵母和革蘭氏陰性菌中。野生釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母本身具有相對較高的gsh含量，并且能夠持續(xù)保持gsh的合成能力，因此他們成為工業(yè)生產(chǎn)gsh最常見的菌種。申請?zhí)枮?01511003961.9的中國發(fā)明專利申請《一種高產(chǎn)谷胱甘肽的釀酒酵母及其用途》公開了一種高產(chǎn)谷胱甘肽的釀酒酵母及其用途。該酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后谷胱甘肽的產(chǎn)量高，且發(fā)酵周期短。該發(fā)明采用流加補(bǔ)料的方式，分別流加碳氮源、維生素、前體氨基酸促進(jìn)谷胱甘肽的合成，使酵母胞內(nèi)谷胱甘肽的含量提升，有效解決了酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘肽含量低的問題。雖然野生釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母本身具有較高的gsh含量，但其產(chǎn)量僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。通過物理誘變或化學(xué)誘變，在特定的培養(yǎng)基上篩選gsh高產(chǎn)菌株是提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。一般情況下，微生物細(xì)胞中的gsh含量不高，僅為細(xì)胞干重的0.1-1％。過高含量的gsh容易破壞細(xì)胞內(nèi)業(yè)已平衡的氧化還原環(huán)境，gsh是胞內(nèi)產(chǎn)物，實(shí)際生產(chǎn)過程中需要提取，較低的含量無疑會大大提高生產(chǎn)成本。因此，如何提高細(xì)胞密度以及細(xì)胞內(nèi)的gsh含量，成為發(fā)酵法生產(chǎn)gsh的關(guān)鍵問題。申請?zhí)枮?00810105972.1的中國專利《一種酵母菌株、富含還原型谷胱甘肽的干酵母及其制備方法》提供了一株通過紫外誘變方法篩選出的還原型谷胱甘肽含量較高性能穩(wěn)定的酵母菌株(cctccm205130)。本發(fā)明的該菌株不進(jìn)行谷胱甘肽的提取和純化，直接和酵母細(xì)胞一起使用，得到富含還原型谷胱甘肽的干酵母。此外，gsh的許多功能主要是由分子中的巰基來體現(xiàn)的，而該巰基在gsh的合成過程中是由l-半胱氨酸提供的，通常情況下細(xì)胞內(nèi)自身合成的l-半胱氨酸量較少，這也成為了胞內(nèi)gsh大量合成的限制性因素，因此通過外源添加l-半胱氨酸的方式對gsh合成速率的提高更為有效。專利號為zl03113418.1的中國發(fā)明專利《一種提高朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量的方法》提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，該方法采用朊假絲酵母為發(fā)酵菌株，經(jīng)過斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加l-半胱氨酸，增加發(fā)酵液中的l-半胱氨酸的供應(yīng)，以提高谷胱甘肽的合成速度和產(chǎn)量。但是過量的l-半光氨酸將影響細(xì)胞的生長?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未出現(xiàn)克服此屏障的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明將提供一株誘變獲得的釀酒酵母菌株，該菌株具有較高的耐高滲能力，可以在高濃度葡萄糖條件下生長，提高細(xì)胞密度，同時(shí)能夠在胞內(nèi)大量積累gsh，提高發(fā)酵生產(chǎn)gsh的產(chǎn)量。所述釀酒酵母菌株具體為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)tlj2016，該菌株已于保藏于2016年7月15日中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12789，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。所述釀酒酵母tlj2016的最適生長ph為6.0-6.5,最適生長溫度為28-35℃；所述釀酒酵母tlj2016是從一株寧夏果園中分離得到的釀酒酵母出發(fā)菌株經(jīng)以下步驟得到：原始出發(fā)菌種→試管活化→硫酸二乙酯(des)誘變→高滲平板篩選→亞硝基胍(ntg)誘變篩選→高滲平板初篩→搖瓶篩選→發(fā)酵復(fù)篩(產(chǎn)gsh能力)→傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。經(jīng)過誘變后獲得的菌株tlj2016其葡萄糖耐受能力以及l(fā)-半胱氨酸耐受能力均得到提高，一方面在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下能夠提高細(xì)胞密度，另一方面l-半胱氨酸耐受能力的提高將有利于gsh在胞內(nèi)大量合成，從而提高菌株大規(guī)模生產(chǎn)gsh的能力。有益效果：1、本發(fā)明所提供的釀酒酵母對葡萄糖的耐受能力達(dá)到300g/l，利于其在高濃度葡萄糖條件下生產(chǎn)gsh；2、本發(fā)明所提供的釀酒酵母在5l發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)gsh終濃度達(dá)到3308mg/l；3、本發(fā)明所提供的釀酒酵母耐受l-半胱氨酸的能力遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株，在5mmol/ll-半胱氨酸作用下仍能緩慢生長，在40mmol/ll-半胱氨酸作用下仍能保持gsh大量合成；4、本發(fā)明所提供的釀酒酵母耐鹽能力達(dá)到18％，有利于擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域。具體實(shí)施方式：實(shí)施例1菌種誘變1.des誘變選育1)在超凈臺上取試管斜面上的出發(fā)菌株1一環(huán)，接入裝有50ml麥芽汁培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，200rpm，30℃培養(yǎng)10h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。2)取5ml菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。3)用ph7.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/ml菌懸液。4)取32mlph7.0的磷酸鉀緩沖液、8ml菌懸液、0.4mldes在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150ml三角瓶中充分混合，使des最終濃度為1％(v/v)。5)在30℃搖床中150rpm反應(yīng)30min，取1ml混合液，加入0.5ml25％na2s2o3溶液中止反應(yīng)。6)稀釋涂布于含150g/lkcl的麥芽汁培養(yǎng)基平皿中，在30℃培養(yǎng)2～3天后挑取菌落最大的菌株1。2.亞硝基胍誘變1)在超凈臺上取試管斜面上的釀酒酵母菌菌株1一環(huán)，接入裝有50ml麥芽汁培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，200rpm，30℃培養(yǎng)10h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。2)取5ml菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。3)用ph6.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/ml菌懸液。4)取10ml菌懸液轉(zhuǎn)移至100ml三角瓶中，加入10mg的ntg，配制成終濃度為10mg/ml的ntg溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于ntg溶解。5)在30℃下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。6)適當(dāng)稀釋涂，取最后稀釋度的菌液0.2ml，涂布于含200g/lkcl的麥芽汁培養(yǎng)基平皿中。在30℃培養(yǎng)2～3天后挑取菌落20支。3.搖瓶初篩1)在超凈臺上分別取上述20支釀酒酵母菌各一環(huán)，分別接入裝有50ml麥芽汁培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，200rpm，30℃培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長中期。2)取5ml菌液，接入裝有50ml高滲麥芽汁培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為300g/l)中的250ml三角瓶中，200rpm，30℃培養(yǎng)3-4天，每天檢測葡萄糖濃度和乙醇濃度變化。發(fā)酵結(jié)束后，比較20株菌種的葡萄糖和乙醇消耗速率、最終殘?zhí)菨舛群鸵掖紳舛?、葡萄糖對乙醇的轉(zhuǎn)化率以及雜酸含量。3)選擇葡萄糖消耗速率快、最終殘?zhí)菨舛鹊秃鸵掖紳舛雀叩?株菌命名為y-1，y-2，y-3，y-4，y-5。4、發(fā)酵復(fù)篩將步驟3中所得的5株菌y-1，y-2，y-3，y-4，y-5以及出發(fā)菌株，分別按照10％接種量，在裝有30ml液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中150rpm,30℃培養(yǎng)30h，取發(fā)酵液測定gsh濃度；液體培養(yǎng)基(g/l)：(nh4)2so46、葡萄糖35、k2hpo4·3h2o3、kh2po40.5、酵母粉11、mnso40.1、kcl0.1、feso40.1、mgso4·7h2o0.1；gsh測定方法：發(fā)酵液離心洗滌后得新鮮酵母，30℃下，40％乙醇處理3h，離心取上清液做gsh測定樣品；采用四氧嘧啶法進(jìn)行g(shù)sh測定：其原理為gsh上的-sh與四氧嘧啶反應(yīng)，生成的物質(zhì)在305nm處有吸收峰，且與谷胱甘肽濃度成線性關(guān)系，故可用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量測定gsh含量。表1：gsh檢測結(jié)果菌株出發(fā)菌株y-1y-2y-3y-4y-5gsh濃度(mg/l)127.9195.7172.3263.2216.5185.2由表1結(jié)果可知，菌株y-3具有最高的gsh發(fā)酵能力，因此確定y-3為最終的生產(chǎn)菌株，并將其命名為tlj2016。5.遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)將tlj2016菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。實(shí)施例2高糖條件下tlj2016發(fā)酵產(chǎn)gsh能力實(shí)驗(yàn)(1)搖瓶培養(yǎng)取tlj2016斜面菌種一環(huán)，接入裝有30ml搖瓶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中150rpm,30℃培養(yǎng)30h得種子液；搖瓶培養(yǎng)基(g/l)：(nh4)2so46、葡萄糖35、k2hpo4·3h2o3、kh2po40.5、酵母粉11、mnso40.1、kcl0.1、feso40.1、mgso4·7h2o0.1，ph6.0；(2)5l發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液按10％接種量，接入裝有3l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃,通氣量6l/min,罐壓0.03mpa，500rpm,恒ph6.0條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至30h時(shí)，一次性添加終濃度為25mmol/l的l-半胱氨酸，總發(fā)酵時(shí)間為50h；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：(nh4)2so410、葡萄糖100、k2hpo4·3h2o8、kh2po40.5、酵母粉11、mnso40.1、kcl0.1、feso40.1、mgso4·7h2o0.1,ph6.0；發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液中g(shù)sh的含量為3308mg/l.實(shí)施例3l-半胱氨酸耐受力實(shí)驗(yàn)將出發(fā)菌株以及tlj2016斜面菌種各一環(huán)，分別接入裝有30ml搖瓶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中150rpm,30℃培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)至12h時(shí)，向搖瓶中加入不同終濃度的l-半胱氨酸，再培養(yǎng)10h，測定細(xì)胞干重，結(jié)果表2、3；搖瓶培養(yǎng)基(g/l)：(nh4)2so46、葡萄糖20、k2hpo4·3h2o3、kh2po40.5、酵母粉11、mnso40.1、kcl0.1、feso40.1、mgso4·7h2o0.1，ph6.0；表2：出發(fā)菌株l-半胱氨酸耐受力l-半胱氨酸濃度mmol/l0510152040出發(fā)菌株干重g/l22.615.710.24.32.20.8gsh濃度(mg/l)35.646.743.240.737.925.3表3tlj2016l-半胱氨酸耐受力l-半胱氨酸濃度mmol/l0510152040tlj2016干重g/l25.728.523.621.220.618.7gsh濃度(mg/l)73.298.3113.5121.7127.5135.8從表2的結(jié)果可以看出，對于出發(fā)菌株，培養(yǎng)基中添加l-半胱氨酸，細(xì)胞停止生長，并且開始自溶，導(dǎo)致gsh增長率隨著l-半胱氨酸濃度的升高而降低；而低濃度l-半胱氨酸下，tlj2016仍能夠緩慢生長，隨著l-半胱氨酸濃度的提高，tlj2016菌株的細(xì)胞干重緩慢下降，而gsh濃度持續(xù)增長，這一結(jié)果將有利于gsh生產(chǎn)過程中通過添加前體氨基酸-l-半胱氨酸提促進(jìn)gsh的生產(chǎn)。實(shí)施例4耐鹽能力實(shí)驗(yàn)取tlj2016菌液1ml接種菌種于含有不同nacl濃度的(含量梯度為0％、2％、5％、10％、15％、18％)的10mlypd液體培養(yǎng)基(ph＝6.5)，置于30℃下分別培養(yǎng)24h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各取1ml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋液于ypd固體平板中涂布，于30℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄計(jì)算平板上的菌數(shù)個(gè)數(shù)。結(jié)果見表4，可知該菌的耐鹽濃度為18％，說明tlj2016不僅可以在常規(guī)環(huán)境中生存，在高鹽條件下依然具有活力，可應(yīng)用于醬油、腌制品等高鹽食品加工過程中耗糖產(chǎn)谷胱甘肽。表4耐鹽能力檢測(×107cfu/ml)nacl含量0％2％5％10％15％18％原始菌株5.16±0.424.38±0.422.15±0.210.12±0.1100tlj20165.33±0.285.10±0.714.83±0.423.98±0.332.57±0.480.83±0.15當(dāng)前第1頁12