本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺(pcn)的基因工程菌株、制備方法及其用途，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過6000種包含吩嗪結(jié)構(gòu)的化合物，它們中絕大多數(shù)都是化學(xué)合成的，從生物體內(nèi)分離得到的還不到100種。但是從生物體內(nèi)分離到的吩嗪化合物多具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌等植物、動(dòng)物病源菌的能力。例如，吩嗪-1-羧酸(pca)能夠抑制引起小麥根部腐蝕的小麥全蝕病，吩嗪-1-甲酰胺則對(duì)西紅柿枯萎病等病原菌有顯著的抑制作用，而有些吩嗪衍生物則顯示出了在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途，已經(jīng)有越來越多的學(xué)者正在研究其作用機(jī)理。天然吩嗪化合物多產(chǎn)自細(xì)菌，人工培養(yǎng)時(shí)在合適的條件下它們中多能大量合成并分泌吩嗪及其衍生物，產(chǎn)量在毫克每升到克每升的水平。這些優(yōu)良性能都顯示了吩嗪及其類似物大規(guī)模推廣應(yīng)用的巨大潛力。

假單胞菌中吩嗪的合成和調(diào)控基因均較為保守。早在1970年代，使用放射性同位素標(biāo)記法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)吩嗪的生物合成途徑與分枝酸(shikimicacid)途徑有密切的關(guān)系(turnerjm,messengeraj.occurrence,biochemistryandphysiologyofphenazinepigmentproduction.advmicrobphysiol,1986,27：211-275)。通過對(duì)比不同吩嗪產(chǎn)生菌的合成序列發(fā)現(xiàn)，吩嗪的合成至少需要編碼phza、phzd、phze、phzf和phzg蛋白的基因。多數(shù)吩嗪合成基因簇還包含一個(gè)編碼3-脫氧-a-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate，dahp)合成酶phzc的基因，它可以催化分樹酸途徑的第一步，使dahp脫磷酸進(jìn)而環(huán)化成苯環(huán)，經(jīng)脫水、加氫反應(yīng)形成莽草酸，進(jìn)一步被修飾形成分支酸。phzc可促使初級(jí)代謝產(chǎn)物向吩嗪合成方向轉(zhuǎn)化，其所催化的反應(yīng)與芳香簇氨基酸合成途徑類似。

整個(gè)吩嗪基因座除包含一套由7個(gè)基因組成的吩嗪合成基因外，還存在復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在假單胞菌中，吩嗪次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控可分為轉(zhuǎn)錄調(diào)控(transcriptionalcontrol)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(post-transcriptionalcontrol)兩部分。比如群感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在熒光與綠針假單胞菌中這兩個(gè)基因被命名為phzi/phzr，并直接位于吩嗪合成基因的上游。中國(guó)專利zl200610023459.9通過改變銅綠假單胞菌m18中全局調(diào)控子gaca基因的表達(dá)，大幅提高了吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量。本課題申報(bào)的專利zl201310566864.5，通過敲除綠針假單胞菌ht66中吩嗪合成的調(diào)控基因psra或rpea基因，也顯著提高了吩嗪-1-甲酰胺的產(chǎn)量。由于微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，不同調(diào)控基因相互作用，僅依靠改變調(diào)控基因，難以進(jìn)一步提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本發(fā)明專利旨在通過敲除代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因，改變細(xì)胞中相關(guān)物質(zhì)的代謝流向，從而使中間代謝產(chǎn)物朝著吩嗪合成的方向積累，從而促進(jìn)吩嗪類次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)pcn的基因工程菌株及其制備方法和用途。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，是敲除了綠針假單胞菌(psedunomonaschlororaphis)ht66cctccno:m2013467及其衍生物基因組中的pyka基因，即得。

作為優(yōu)選方案，所述pyka基因的堿基序列如seqidno.1所示。

作為優(yōu)選方案，所述pyka基因的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno.2所示。

第二方面，本發(fā)明提供了一種如前述的高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制備方法，包括插入突變法和無痕敲除法。

作為優(yōu)選方案，所述插入突變法敲除pyka基因包括如下步驟：

s1、擴(kuò)增pyka基因片段，并插入pex18tc質(zhì)粒中；

s2、擴(kuò)增卡那霉素或慶大霉素等抗性基因，插入pyka基因中間，使pyka基因發(fā)生插入突變；

s3、將突變后的pyka基因與ht66基因組中的pyka基因發(fā)生同源重組，根據(jù)抗性篩選出陽(yáng)性克隆，即可。

作為優(yōu)選方案，所述無痕敲除pyka基因法包括如下步驟：

a1、擴(kuò)增pyka基因片段的上下游同源臂；

a2、融合pcr法連接上下游同源臂并插入pk18mobsacb質(zhì)粒中；

a3、使重組質(zhì)粒上的pyka基因的上下游同源臂片段與ht66基因組發(fā)生同源重組，利用蔗糖壓力和抗性篩選出陽(yáng)性克隆，即可。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種用于培養(yǎng)前述的基因工程菌株的培養(yǎng)基，其包括如下組分：甘油、蛋白胨、酵母提取物、硫酸鎂、磷酸氫二鉀。

作為優(yōu)選方案，所述的培養(yǎng)基包括按重量份數(shù)計(jì)的如下組分：

第四方面，本發(fā)明又提供了一種如前述的高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺中的用途。

其中，所述基因工程菌株在制備吩嗪-1-甲酰胺時(shí)的條件為：好氧培養(yǎng)；溫度：28～32攝氏度；ph：6～8；轉(zhuǎn)速200～350rpm。。

本發(fā)明的基本原理為：pyka是編碼丙酮酸激酶的基因，在不同種屬的微生物中相對(duì)比較保守。丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移將磷酸烯醇式丙酮酸(pep)轉(zhuǎn)化成丙酮酸從而進(jìn)入tca循環(huán)或其他途徑。由于pep和丙酮酸處于細(xì)胞內(nèi)糖、氨基酸和脂代謝的關(guān)鍵位置，且pep是莽草酸合成途徑中的初始底物之一(赤蘚糖-4-磷酸(e4p)是另一個(gè)底物)，莽草酸途徑的終產(chǎn)物分支酸是吩嗪-1-甲酰胺(pcn)合成的直接底物，故敲除pyka基因能夠減弱pep轉(zhuǎn)化成丙酮酸的反應(yīng)，使更多的碳源流向莽草酸途徑，從而提高pcn產(chǎn)量。

因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

采用全新的調(diào)控策略，改變細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)流向，大幅度提高了pcn的產(chǎn)量；該基因工程菌株安全可靠，穩(wěn)定性好，可顯著促進(jìn)pcn的工農(nóng)業(yè)應(yīng)用。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為不同菌株中pyka基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖(l1為空白對(duì)照，l2:以野生株ht66的基因組為模板，l3:以突變株ht66δpyka的基因組為模板)；

圖2為野生株ht66與突變菌株ht66δpyka的生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖；

圖3為不同菌株中pyka基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖(l1為空白對(duì)照，l2:以菌株p3的基因組為模板，l3:以突變株p3δpyka的基因組為模板)

圖4為菌株p3和突變株p3δpyka的生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖；

圖5為野生株ht66和突變株ht66δpyka的pcn發(fā)酵曲線；

圖6為菌株p3和突變菌株p3δpyka的pcn發(fā)酵曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的綠針假單胞菌(psedunomonaschlororaphis)ht66，該菌株已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc)保藏，保藏單位地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編為：430072，保藏日期為：2013年10月12日，保藏編號(hào)為：cctccno∶m2013467。菌株p3為ht66經(jīng)過多重突變后獲得的pcn高產(chǎn)菌株【張平原,彭華松,沈雪梅,等.高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的綠針假單胞菌的誘變與基因工程育種.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2015,33(2):90-94.】。

實(shí)施例1

本實(shí)施例涉及一種以ht66基因組為模板，利用插入突變法制備ht66δpyka基因工程菌株的方法，包括如下步驟：

1.引物設(shè)計(jì)

以pyka基因序列為參考，利用primer5設(shè)計(jì)引物并合成，引物序列如下，下劃線表示限制性內(nèi)切酶hindiii和saci的酶切位點(diǎn)。

pyka1:ccaagcttatgtccgtccgtcgtaccaa(seqidno.3)

pyka2:acgagctctcagaccattgggtcgcca(seqidno.4)

以質(zhì)粒pbbb5k為模板，設(shè)計(jì)卡那抗性基因(kan)的引物并合成，引物序列如下，下劃線表示限制性內(nèi)切酶xhoi的酶切位點(diǎn)。

pbb-kan-f:ccctcgagggaattgccagctggggcgcseqidno.5

pbb-kan-r:ccctcgagtcagaagaactcgtcaagaagseqidno.6

2.插入突變重組質(zhì)粒構(gòu)建

以ht66基因組和pbbb5k質(zhì)粒為模板，利用pyka1/2和pbb-kan-f/r引物通過pcr分別擴(kuò)增pyka基因(1452bp)和kan基因(1000bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，kan基因pcr產(chǎn)物先置于-20°冰箱保存。將pyka基因和pex18tc質(zhì)粒利用hindiii和saci分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系切膠回收，16℃連接并轉(zhuǎn)化e.colidh5a感受態(tài)細(xì)胞，通過tc(20ppm)抗性平板篩選獲得陽(yáng)性克隆。提取pex-pyka質(zhì)粒，與kan基因一起分別進(jìn)行xhoi單酶切，割膠回收后16℃連接過夜并轉(zhuǎn)化dh5a，使用含tc(20ppm)，kan(50ppm)的抗性平板篩選重組子獲得陽(yáng)性克隆，提取獲得的質(zhì)粒pex-pyka-kan，轉(zhuǎn)入e.colism10感受態(tài)細(xì)胞。

3.插入突變菌株篩選

將轉(zhuǎn)入pex-pyka-kan質(zhì)粒的sm10與菌株ht66進(jìn)行雙親雜交，通過tc(150ppm)，kan(50ppm)，sp(100ppm)的lb抗性平板進(jìn)行單交換篩選，含15％蔗糖和kan(50ppm)，sp(100ppm)的lb平板進(jìn)行雙交換篩選，外部引物(pyka1/2)pcr驗(yàn)證，提基因組擴(kuò)增送測(cè)序，最后獲得插入突變株ht66δpyka。

利用pyka1和pyka2引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證，插入突變菌株可擴(kuò)增出長(zhǎng)約2500bp的片段(pyka和kan基因大小之和)，而未敲除的野生菌株則可擴(kuò)增出長(zhǎng)約1500bp的片段(pyka大小為1452bp)，結(jié)果如圖1所示。圖1中：m為marker，l1為空白對(duì)照，l2:以菌株ht66的基因組為模板，l3:以菌株ht66δpyka的基因組為模板。

通過液體培養(yǎng)，測(cè)定菌株ht66和ht66δpyka生長(zhǎng)曲線如圖2所示。結(jié)果顯示在ht66中敲除pyka基因不會(huì)影響其生長(zhǎng)，表明該基因工程菌的穩(wěn)定性好，有利于對(duì)該菌進(jìn)行進(jìn)一步改造。

實(shí)施例2

本實(shí)施例涉及一種高產(chǎn)pcn的基因工程菌株的制備，出發(fā)菌株p3是綠針假單胞菌ht66經(jīng)過多重突變后獲得的高產(chǎn)pcn的菌株。具體包括如下步驟：

1、引物設(shè)計(jì)：

以pyka基因上下游序列為參考，利用primer5設(shè)計(jì)敲除引物并合成，引物序列如下(下劃線表示xbai和hindiii酶切位點(diǎn))：

pykaf1:ccggggatcctctagaaagatcgttacaacgcggtcg(seqidno.7)

pykar1:tggtacgacggacggacatg(seqidno.8)

pykaf2:tgtccgtccgtcgtaccaacccaatggtctgagccacc(seqidno.9)

pykar2:ggccagtgccaagcttcgagttcggttccagcctg(seqidno.10)

2、重組質(zhì)粒構(gòu)建：

以p3基因組為模板，利用pykaf1、pykar1和pykaf2、pykar2通過pcr擴(kuò)增pyka上下游同源臂片段，pcr產(chǎn)物純化后，利用in-fusionhdcloningkit方法將該上下游同源臂連接至已進(jìn)行酶切過的pk18mobsacb質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化e.colidh5a，通過藍(lán)白斑篩選，白斑菌落利用引物pykaf1和pykar2進(jìn)行pcr驗(yàn)證后送測(cè)序。

3、突變菌株篩選：

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pk18-pyka轉(zhuǎn)化至e.colis17，與菌株p3進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移，通過kan和amp抗性平板單交換篩選，15％(w/v)蔗糖板雙交換篩選，外部引物pcr驗(yàn)證，提基因組擴(kuò)增送測(cè)序，最后獲得菌株p3的pyka敲除突變株，命名為p3δpyka，利用pykaf1和pykar2引物pcr擴(kuò)增，敲除菌株可擴(kuò)增出長(zhǎng)約1100bp的pyka上下游同源臂片段，而未敲除的野生菌株則可擴(kuò)增出長(zhǎng)約2500bp的片段(pyka大小為1452bp)，表明pyka基因成功敲除，結(jié)果如圖3所示。圖3中，l1為空白對(duì)照，l2:以菌株p3的基因組為模板，l3:以突變株p3δpyka的基因組為模板。

通過在kb培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)定菌株p3和p3δpyka生長(zhǎng)曲線，如圖4所示。結(jié)果表明，在菌株p3中敲除pyka基因不會(huì)影響其生長(zhǎng)，表明此基因工程菌株穩(wěn)定性非常好，有利于其工業(yè)化應(yīng)用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例涉及一種利用實(shí)施例1制備的基因工程菌株合成pcn的方法，包括如下步驟：

分別將菌株ht66δpyka和ht66wt(野生株ht66作為對(duì)照)分別在kb固體平板上活化兩次，然后接至5mlkb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以2％的比例轉(zhuǎn)接至裝有60mlkb培養(yǎng)基的三角瓶進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為28℃，180rpm。定時(shí)取樣，以hplc測(cè)定菌株pcn產(chǎn)量。

hplc檢測(cè)條件：

流動(dòng)相為乙腈-25mm乙酸銨，色譜柱為wondasilc18-wrreversephasecolumn(5μm；4.6×250mm,shimadzu,japan)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，檢測(cè)條件：0-2min，8％乙腈-92％25mm乙酸銨，2-20min，乙腈濃度從8％升至60％，乙酸銨濃度從92％下降至40％，20-21min，8％乙腈-92％25mm乙酸銨。

分別測(cè)定菌株ht66和菌株ht66δpyka的pcn產(chǎn)量，結(jié)果如圖5所示。從圖可見，敲除pyka基因可以明顯提高pcn產(chǎn)量，對(duì)照株ht66的pcn產(chǎn)量為552mg/l，而突變株在48h時(shí)其pcn產(chǎn)量為1038mg/l，相比提高了88％。由此可見，在綠針假單胞菌ht66中敲除pyka基因能夠有效改變物質(zhì)的流向，有利于積累pcn。

實(shí)施例4

本實(shí)施例涉及一種利用實(shí)施例2制備的基因工程菌株生產(chǎn)pcn的方法，包括如下步驟：

首先將菌株p3δpyka和p3(對(duì)照)分別在kb固體平板上活化，然后將其接至5mlkb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后分別接種至裝有60mlkb培養(yǎng)基的三角瓶進(jìn)行發(fā)酵。初始接種量od600為0.02。發(fā)酵條件為28℃，180rpm。定時(shí)取樣，分別測(cè)定菌株p3δpyka和p3發(fā)酵液中的pcn產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示。

從圖可見，敲除pyka基因可以明顯提高pcn產(chǎn)量，在36h時(shí)其pcn產(chǎn)量為3594mg/l，與同樣條件下對(duì)照株p3的pcn產(chǎn)量(1923mg/l)相比，提高了71.3％。該結(jié)果表明，在綠針假單胞菌p3中敲除pyka基因能夠有效的再分配細(xì)胞碳、氮源的流向，使其流向莽草酸途徑，進(jìn)而流向pcn合成。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。