大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發(fā) 育有重要影響，嚴(yán)重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之 一。目前，基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞有多種途 徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。植 物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多類蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等與植物耐逆性相關(guān)，但是，有關(guān)MicroRNA與耐 逆性的相關(guān)性報道較少。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為20-24個核巧酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi) 具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。MicroRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA，長度大約為 300-1000個堿基；pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長度大約 為70-90個堿基；pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長約20-24nt的成熟miRNA。
[0004] 在植物中，miRNA在RISC的作用下與祀基因的mRNA結(jié)合后，通過降解mRNA或抑 制翻譯的方式對基因的進(jìn)行調(diào)控。每個HiiRNA可W有多個祀基因，而幾個miRNA也可W調(diào) 節(jié)同一個基因。送種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可W通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可 W通過幾個miRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。植物中已知miRNA通過調(diào)控與植物 開花及花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物生殖發(fā)育及花器官分化。一些miRNA調(diào)控植 株的發(fā)育和耐逆性，例如玉米中鉛脅迫響應(yīng)miRNA與植株的耐鉛脅迫相關(guān)；海南大學(xué)薄維 平等分析了木墓低溫下miRNA的差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供MicroRNA172 (簡稱為miR172)或其編碼核酸分子或含 有其編碼核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌的新用途。
[0006] 本發(fā)明提供了 MicroRNA172或其編碼核酸分子或含有其編碼核酸分子的重組載 體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物和/或提高植物生物量中的應(yīng)用；
[0007] 所述MicroRNA172的核巧酸序列為序列表中序列2或序列3。
[0008] 上述序列表中序列2所示的RNA為pre-miRNA172,序列3所示的RNA為 MicroRNA172, pre-miRNA172 為 MicroRNA172 的前體。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述MicroRNA172編碼核酸分子的核巧酸序列為序列表中序列1，編 碼 pre-miRNA172〇
[0010] 上述應(yīng)用中，所述含有Mi Cr0RNA17 2編碼核酸分子的重組載體為將所述 MicroRNA172編碼核酸分子插入表達(dá)載體得到表達(dá)MicroRNA172的重組載體，在本發(fā)明的 實施例中，表達(dá)載體為地in438,重組載體為將序列表的序列1所示pre-MicroRNA172的編 碼核酸分子插入地in438載體BamHI和化nl酶切位點之間得到的載體，且插入的位置在 CaMV35S啟動子之后，將該重組載體命名為地in438-pre-MicroRNA172〇
[0011] 上述應(yīng)用中，所述耐逆性為耐鹽性；
[0012] 所述提高生物量體現(xiàn)在提高根長、提高株高和/或提高地上部分鮮重。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，在本發(fā)明的實施例中，采用的 雙子葉植物為大豆。
[0014] 本發(fā)明另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0015] 本發(fā)明提供的方法，為將MicroRNA172編碼核酸分子導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因 植物；
[0016] 所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下1)和/或2)特征：
[0017] 1)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物；
[0018] 2)所述轉(zhuǎn)基因植物的生物量大于所述目的植物；
[0019] 所述MicroRNA172的核巧酸序列為序列表中序列2或序列3。
[0020] 上述方法中，所述MicroRNA172編碼核酸分子通過重組載體導(dǎo)入所述目的植物；
[0021] 所述重組載體為將所述MicroRNA172編碼核酸分子插入表達(dá)載體得到表達(dá) MicroRNA172的重組載體；
[0022] 所述MicroRNA172編碼核酸分子的核巧酸序列為序列表中序列1。
[0023] 上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；
[0024] 所述生物量體現(xiàn)在提高根長、提高株高和/或提高地上部分鮮重。
[0025] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物為大豆。
[0026] 上述耐鹽體現(xiàn)在鹽脅迫下提高根長、提高株高、提高地上部分鮮重和/或降低電 導(dǎo)率。
[0027] 使用Pre-miR172構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何 一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花挪菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟 動子扣biquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基 因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，送些增強子區(qū)域 可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，W保 證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可W是天然的， 也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0028] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 蠻光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡郝霉素標(biāo)記物等）或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莽劑基因）等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接W干旱或高鹽處理篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0029] 利用任何一種可W引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的大豆 Pre-miR172導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得對高鹽逆境脅迫耐受力增強、且生物量增加的轉(zhuǎn)基因植 株。攜帶有Pre-miR172的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、化質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA 轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植 物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可W是單子葉植物，也可W是雙子葉植物，如：大 豆、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、首宿等。
[0030] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明過表達(dá)pre-miR172得到轉(zhuǎn)基因大豆，其高于轉(zhuǎn)空載體 大豆或野生型大豆，具體體現(xiàn)在鹽脅迫下生物量高于轉(zhuǎn)空載體或野生型大豆。本發(fā)明對培 育耐鹽且生物量增加的植物品種，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
[0031] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0032] 圖1為miR172在各器官中的表達(dá)
[0033] 圖2為miR172受高鹽/干旱處理誘導(dǎo)
[0034] 圖3為植物表達(dá)載體地in438-miR172的圖譜 [00巧]圖4為轉(zhuǎn)pre-miR172大豆分子鑒定
[0036] 圖5為正常條件下轉(zhuǎn)pre-miR172大豆的表型分析
[0037] 圖6為SOmM化Cl處理時轉(zhuǎn)pre-miR172大豆表性分析
[0038] 圖7為SOmM化Cl處理后轉(zhuǎn)pre-miR172大豆葉片和根表型
[0039] 圖8為轉(zhuǎn)pre-miR172大豆生理指標(biāo)統(tǒng)計
[0040] 圖9為轉(zhuǎn)pre-miR172大豆葉和根的電導(dǎo)率測定
【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實施例中所用引物均由H博生物公司合成。
[0044] 大豆科豐 1 號（Glycine max L. Merr. Kefengl)記載在 W. K. Zhang, Y. J. Wang, G. Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers, Hieor. Appl. Genet, 2004, 108:1131-1139 中，公眾可W從中國科學(xué)院遺 傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；
[004引植物雙元表達(dá)載體pBin438:公眾可W從中國科學(xué)院微生物研究所方榮祥院±實 驗室獲得；參考文獻(xiàn)：李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草的研究[J].中 國科學(xué)（輯），1994, 24 (3) : 276-282。
[0046] 發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 記載在 Attila Kereszt, et al. , Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2(4),549-552)中，公眾可從化ter M Gressnon教授，The University of 如eensland, St Lucia,如eensland4072, Australia,獲得，或經(jīng) F*eter M Gressnon 教授同 意（書面同意書）后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0047] 實施例1、大豆miR172的克隆及其對非生物脅迫的應(yīng)答
[0048] 1、大豆miR172的克隆
[0049] 通過RNA-Seq測序分析獲得了大豆中的部分miRNA序列及其祀基因，建立了大豆 miRNA庫。通過Realtime-PCR檢測數(shù)個miRNA在大豆科豐1號的根、莖、葉、花、果實等不 同器官的表達(dá)模式及在不同脅迫處理下的受誘導(dǎo)情況。Realtime-PCR實驗結(jié)果表明其中 miR172在根、莖、葉、花和果實中均有表達(dá)，其中在根部和莖部表達(dá)量較高（圖1)。miR172 在150mM化Cl和空氣干燥處理下均受到誘導(dǎo)（圖2)。因此對miR172作進(jìn)一步功能鑒定。
[0050] 根據(jù)大豆miRNA數(shù)據(jù)庫，獲得pre-miR172序列，設(shè)計引物，在大豆科豐1號的基因 組DNA中擴增得到miRNA的前體pre-miR172,具體如下：
[0051] 提取科豐1幼苗的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成CDNA作為模板，用如下擴 增引物進(jìn)行PCR擴增：
[0052] Pre-miR172-up ;5, -CGCGGATCCTTAACAGTCGTTATTTGCGGATGTA(序列 3);
[0053] Pre-miR172-dp ;5, -CGGGGTACCGTGAAGTCGTTTATGGCTGATGCA(序列 4)
[0054] 得到約159bpPCR產(chǎn)物。經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物為159bp，具有序列表中序列1所示 的核巧酸，該核巧酸所示為pre-miR172的編碼核酸分子，編碼pre-miR172,該RNA的核巧酸 序列為序列表中序列2, pre-miR172經(jīng)過剪切得到的miR172,其核巧酸序列為序列3。
[00巧]2、逆境脅迫處理下大豆miR172的表達(dá)特征
[0056] 將大豆科豐1種子種在盆中，生長2個星期后取幼苗分別進(jìn)行鹽和滲透脅迫處 理。鹽脅迫處理為在歴石中加入150mM化Cl,干旱處理為將豆苗根部小必的吸去水分，置 于濾紙上暴露