基于磁珠法提取游離dna的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁珠法的在全血中提取游離DNA的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA是遺傳信息的載體，是主要的分子生物學(xué)研究對象之一，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入及基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，基因測序所需的時間及成本快速下降，在基因水平上對疾病進行診斷已經(jīng)成為臨床診斷的一項基本技術(shù)手段，基于基因測序的精準醫(yī)療正逐漸成為重大疾病診斷、個性化醫(yī)療、胎兒遺傳病學(xué)分析以及個體識別等領(lǐng)域的重要方式。
[0003]正常細胞、腫瘤細胞或胎兒組織細胞分裂后，細胞中的DNA會釋放到人體體液中，游離在細胞之外，其中進入到血液的這部分DNA統(tǒng)稱為血液游離DNA，也稱作血楽游離DNA，即cell free DNA，簡稱cfDNAxfDNA片段長度主要集中在100?240bp之間，大部分在160?200bp之間。
[0004]血液中來自腫瘤細胞分裂釋放的DNA稱為CtDNA，為cfDNA的一部分，對于不同患病階段的腫瘤患者，ctDNA含量及種類不盡相同，這對腫瘤診斷具有重大臨床意義;對于孕婦而言，對來自于嬰兒部分的CfDNA進行提取及檢測也正逐漸成為孕婦產(chǎn)前診斷的重要手段。但cfDNA含量極低，血液總cfDNA含量大約在10-200ng/ml，其中對孕婦而言來自嬰兒細胞的cfDNA約占血液總cfDNA含量的10 %左右，對腫瘤患者而言，來自腫瘤細胞的ctDNA僅占血液總cfDNA含量的千分之一到萬分之一;此外，cfDNA為小片段DNA，使得cfDNA提取非常困難。
[0005]傳統(tǒng)血液cfDNA的提取主要包括2個步驟:I)多級離心獲取血漿;2)從血漿中提取獲得cfDNA。目前主流的cfDNA提取試劑盒主要是柱式法，柱式法所用的硅羥基柱膜，其孔徑一般在微米級別，對于小片段DNA截留效果較差，并且需要跟離心機配合使用，在這一提取過程中，核酸和硅羥基柱膜的結(jié)合為瞬間作用，作用時間短，使得利用柱式法提取純化cfDNA顯得尤為困難。近幾年來，磁珠法開始應(yīng)用于DNA的提取工作中，磁珠法中所采用磁珠一般都在納米級別，擁有大比表面積，另外，磁珠表面修飾有特殊化學(xué)基團，在不同條件下可以對DNA分子形成特異性吸附或者解吸附作用，磁珠和小片段DNA的相互作用時間可控，再加上其本身擁有順磁性的特性，富集DNA后與母液分離操作非常方便，這些特點都使得磁珠法能夠成為更加便捷的cfDNA提純方法。
[0006]目前，磁珠法提取cfDNA大多只能在血漿或血清中進行，從全血中提純cfDNA依舊存在多種困難，例如，血液不可凍融還必須經(jīng)過較為復(fù)雜的多級處理方可得到適合提取cfDNA的血漿，需要3-6°C、1600g初步離心8-12min，之后上清液再次3-6°C、16000g離心8-12min后才可得到血漿，操作非常復(fù)雜;盡管如此，按照上述方法得到的血清中也不能完全將殘留的基因組DNA以及一些較大片段的DNA去除。并且，其中會混有240-800bp的DNA片段，且未能去除基因組的干擾。雖然有現(xiàn)有技術(shù)能夠提供一種從血清中提取小于500bp DNA片段的方法，但是依舊需要將血液經(jīng)過復(fù)雜的多級處理獲得血漿或血清，過程復(fù)雜。
[0007]因此有必要開發(fā)一種更加便捷從血漿、血清、甚至是全血中提取cfDNA的試劑盒和方法，同時可以配合核酸提取儀和工作站實現(xiàn)高通量、自動化操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒及其使用方法。將游離DNA提取純化的部分工作向前整合到血樣處理步驟中，直接從全血中對游離DNA進行吸附富集，并在外加磁場的作用下使之與血液中其它雜質(zhì)實現(xiàn)分離，之后利用特定的基因組DNA去除液將微量基因組DNA去除，只保留游離DNA。
[0009]本試劑盒和提取方法將傳統(tǒng)的需要對血液進行多級預(yù)處理得到血清之后才能用來提取游離DNA，直接擴展到可以直接從全血樣本中提取游離DNA，這一過程中DNA固定結(jié)合液的使用，既保證基因組DNA不降解，也促使含量極低的游離DNA被有效富集到磁珠上，隨后在一定的條件下再重新釋放到液體中；基因組DNA去除液特異性的除去微量基因組DNA，只保留游離DNA，保證了游離的高純度及完整性，整個操作簡單便捷，效果穩(wěn)定，提取效率高。此外，如有需要可將基因組DNA以副產(chǎn)物的形式產(chǎn)出。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0011 ] 一種基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其包括有分別獨立分裝的DNA固定結(jié)合液、第一磁珠懸浮液，清洗液、基因組DNA去除液、第二磁珠懸浮液和洗脫液；
[0012]其中，所述DNA固定結(jié)合液包括有:尿素、Tri s堿、亞硫酸鈉、離液鹽、螯合劑、去垢劑和醋酸鹽;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合;所述去垢劑選自Triton X-100,Tween-20,NP-40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合;所述醋酸鹽選自醋酸鉀、醋酸鈉或其組合；
[0013]所述第一磁珠懸浮液中包括有表面包覆硅羥基的第一磁珠，所述第一磁珠的粒徑為50_300nm;
[0014]所述清洗液包括異丙醇、離液鹽、螯合劑和去垢劑;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合；所述去垢劑選自Triton X-100、Tween-20,NP-40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合；
[0015]所述基因組去除液包括碳酸鉀、醋酸鈉、碳酸氫銨、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、硫酸鈉、離鹽液和去垢劑;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述去垢劑選自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合；
[0016]所述第二磁珠懸浮液中包括有表面包覆硅羥基的第二磁珠，所述第二磁珠的粒徑為100_500nm;
[0017]所述洗脫液為Tris堿或去離子水。
[0018]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，所述DNA固定結(jié)合液中尿素濃度為0.05-0.2mol/L，Tris堿濃度為20-100mmol/L，亞硫酸鈉濃度為0.l~2wt %，離液鹽濃度為2-811101/1，螯合劑濃度為1-20011111101/1，去垢劑的體積分數(shù)為0.01-5%，醋酸鹽濃度為 0.05-lmol/Lo
[0019]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，所述第一磁珠分散液中第一磁珠的濃度為25-65mg/mL。
[0020]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，所述清洗液中，異丙醇的體積分數(shù)為45-65%，離液鹽的濃度為0.1-0.511101/1，螯合劑的濃度為10-10011111101/1，去垢劑的體積分數(shù)為0.01-1 %。
[0021]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，所述基因組DNA去除液中碳酸鉀濃度為Ο.Ι-lmol/L，醋酸鈉濃度為0.05-lmol/L，碳酸氫銨的濃度為0.5mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉濃度為10-100mmol/L，氯化鈉的濃度為3mol/L，硫酸鈉的濃度為lmol/L，離液鹽濃度為l_6mol/L，去垢劑的體積分數(shù)為0.01-3%。
[0022]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，所述第二磁珠懸浮液中第二磁珠的濃度為10-40mg/mL。
[0023]優(yōu)選的是，所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其中，當(dāng)所述洗脫液為Tris喊時，Tris喊的濃度為0.9-1.lmmol/L。
[0024]—種如上述方案中任一項所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒的使用方法，其中，包括:
[0025]步驟I)將血液樣本轉(zhuǎn)移進EP管(離心管)中，加入DNA固定結(jié)合液，混均；
[0026]步驟2)向EP管加入第一磁珠懸浮液，振蕩混勻；
[0027]步驟3)將EP管置于磁力架裝置中，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去EP管中的液體；
[0028]步驟4)在EP管中加入清洗液，振蕩EP管使第一磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去清洗液；
[0029]步驟5)向EP管中加入基因組DNA去除液，振蕩EP管使第一磁珠懸浮均勻，磁性分離，靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中；
[0030]步驟6)向裝有上清液的新的EP管中加入第二磁珠懸浮液，混勻，振蕩結(jié)合;靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去EP管中的液體；
[0031 ]步驟7)向新的EP管中加入乙醇溶液，振蕩EP管使第二磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離，去除上清液；
[0032]步驟8)將新的EP管放入干燥箱中干燥，除去乙醇，在新的EP管中加入洗脫液，振蕩EP管使第二磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離去除第二磁珠，在新的EP管中的洗脫液中即含有目標游尚DNA。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034]1、本案可以實現(xiàn)直接從全血樣本中提取游離DNA ；將提取純化游離DNA的對象由血清或者血漿擴大到全血樣本，將提取游離DNA的步驟向前延伸到血液的前期處理，大大減少了血液原先提取游離DNA的步驟;另外，該試劑盒同樣也可以兼容從血漿或血清樣本中提取純化游離DNA。
[0035]2、可以去除基因組DNA干擾?？梢詫⑷?、血漿或血清中混入的微量基因組DNA去除，降低后續(xù)試驗干擾;該試劑盒中的不同試劑的配合，使得游離DNA的提取效率和純度得到最大程度的保障。
[0036]3、操作簡單便捷，所需裝置要求低，從最初的血液獲得開始到最后的洗脫游離DNA，全程不需要離心操作，節(jié)省時間和成本。
[0037]4、提供一種高效、低成本的游離DNA提取方案，并可以配合核酸提取儀以及工作站完成自動化和高通量操作。
【附圖說明】
[0038]圖1是采用實施例1中試劑盒從血液樣本中提取到的游離DNA的瓊脂糖電泳鑒定膠圖。(圖1中磁珠I代表第一磁珠懸浮液中的磁珠，磁珠2代表第二磁珠懸浮液中的磁珠)
[0039]圖2是采用實施例2中試劑盒從血液樣本中提取到的游離DNA的瓊脂糖電泳鑒定膠圖。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0041 ] 實施例1:
[0042]一種磁珠法血液游離DNA提取試劑盒包括分別獨立分裝的:
[0043]DNA固定結(jié)合液:0.05mol/L尿素，Tris堿濃度為100mmol/L，亞硫酸鈉濃度為1%，lmol/L鹽酸胍，3mol/L硫氰酸胍，2mol/L高氯酸鈉，10mmoI/L乙二胺四乙酸二鈉，0.01 %Triton X-100，I % NP-40,0.5% 十二烷基硫酸鈉，0.lmol/L 醋酸鉀和 0.lmol/L 醋酸鈉。
[O O44 ]第一磁珠懸浮液:磁珠濃度為4 O m g / m L的磁珠混懸液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe3O4)，表面包覆了硅羥基層。具體配制方法:稱取4g磁珠，加入到10mL去離子水中，超聲分散均勻。
[0045]清洗液:60