%異丙醇，50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，0.2mol/L鹽酸胍和0.5mol/L異硫氛酸狐，0.01 %十一■燒基硫酸納。
[0046]基因組DNA去除液:lmol/L碳酸鉀，lmol/L醋酸鈉，lmol/L碳酸氫銨，50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，3moI/L氯化鈉，Imo 1/L硫酸鈉，3mol/L鹽酸胍，ImoI/L異硫氰酸胍，0.01 %NP-40和I %十二烷基硫酸鈉。
[O O4 7 ]第二磁珠懸浮液:磁珠濃度為2 O m g / m L的磁珠混懸液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe3O4)，表面包覆了硅羥基層。具體配制方法:稱取2g磁珠，加入到10mL去離子水中，超聲分散均勻。
[0048]洗脫液:ImM的Tris堿水溶液，pH值為8.0。
[0049]本實(shí)施例針對(duì)2份模擬樣本(向血液中人為加入濃度為80ng/mL200bp片段DNA模擬游離DNA)，利用簡單的磁力裝置，在EP管中手動(dòng)法操作提取其中的游離DNA(即其中的200bp片段DNA)，包括如下步驟:
[0050]步驟I)吸取0.2mL血液樣本到1.5ml EP管中，加入DNA固定結(jié)合液200ul以及蛋白酶K 20ul，上下顛倒混勻，58°C溫浴1min ；
[0051 ] 所述蛋白酶K溶液為20mg/ml。
[0052]步驟2)向步驟I)中的EP管加入磁珠懸浮液I 50ul以及異丙醇400ul，顛倒混勻數(shù)次，并振蕩結(jié)合5min;
[0053]步驟3)將EP管置于簡易磁力架裝置中，磁性分離30?90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去其它血液雜質(zhì)；
[0054]步驟4)在步驟3)后的EP管中加入清洗緩沖液800ul，用手輕搖10?60s，磁性分離30?90s，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去清洗液；
[0055]步驟5)向步驟4)裝有磁珠的EP管中加入基因組去除液200ul，用手輕搖10?30s，靜置5-10min;磁性分離30?90s，待磁珠被完全吸附后，吸取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中；
[0056]步驟6)向步驟5)中裝有上清的EP管中加入磁珠懸浮液2 10ul以及異丙醇200ul，顛倒混勾數(shù)次，振蕩結(jié)合5?I Om i η;
[0057]步驟7)清洗:在EP管中加入700uL 80 %乙醇水溶液，將用手輕搖10?60s，磁性分離，去除上清液，用80 %乙醇水溶液重復(fù)清洗一次。
[0058]步驟8)除醇和洗脫:將上述含有磁珠的管放入45°C的真空干燥箱干燥5?lOmin，除去乙醇，在EP管中加入20?200uL的洗脫液，800?1200rpm下振動(dòng)lmin，磁性分離去除磁珠，EP管洗脫液中即獲得目標(biāo)200bp片段DNA。
[0059]實(shí)施例2:
[0060]本實(shí)施例使用實(shí)施例1中相同的試劑盒，在48孔板中同時(shí)進(jìn)行多分樣品的平行實(shí)驗(yàn)。
[0061 ]本實(shí)施例同時(shí)針對(duì)8份模擬樣本(向血液中人為加入濃度為100ng/mL200bp片段DNA模擬游離DNA)進(jìn)行提取，包括如下步驟:
[0062]步驟I):用多通道自動(dòng)移液器向48孔板中加入200yL血樣、20yL蛋白酶k溶液和200UL DNA固定結(jié)合液，平行8份樣品，渦旋振蕩30秒充分混勻，置于水浴鍋中消化10分鐘。渦旋混合儀的振動(dòng)頻率設(shè)定為1150rpm ；
[0063]步驟2):取出48孔板，用多通道自動(dòng)移液器向8個(gè)樣品孔中分別加入50yL第一磁珠分散液、400yL異丙醇之后，將48孔板置于渦旋混合儀振蕩5分鐘，將48孔板放置到48孔板用磁板架上靜置20秒至磁珠吸附完全，保持48孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀態(tài)置于吸水紙上，徹底去除上清液殘留；
[0064]步驟3):將48孔板從磁板底座上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣品孔中分別加入SOOyL清洗液，之后將48孔板置于渦旋混合儀上振蕩60秒，將48孔板重新裝回磁板架上靜置20秒至磁珠吸附完全，保持48孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液；
[0065]步驟4):將48孔板從磁板底座上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣品孔中分別加入200yL基因組DNA去除液，之后將48孔板置于渦旋混合儀上振蕩60秒，將48孔板靜置5分鐘之后，置于磁力架上至磁珠吸附完全，保持48孔板固定于磁板架上，吸取上清液到一塊新的48孔板，徹底棄去磁珠；
[0066]步驟5):用多通道自動(dòng)移液器向新的48孔板上的8個(gè)樣品孔中分別加入10yL第二磁珠分散液、200yL異丙醇之后，將48孔板置于渦旋混合儀振蕩5分鐘，將48孔板放置到48孔板用磁板架上靜置20秒至磁珠吸附完全，保持48孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀態(tài)置于吸水紙上，徹底去除上清液殘留；
[0067]步驟6):將48孔板從磁板底座上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣品孔中分別加入700yL 80%乙醇，之后將48孔板置于渦旋混合儀上振蕩25秒，將48孔板重新裝回磁板架上靜置20秒至磁珠吸附完全，保持48孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液;并重復(fù)利用步驟6) 一次；
[0068]步驟7):將清洗完畢的48孔板連同磁板架一起置于45°C真空烘箱中真空干燥3分鐘，取出48孔板并從磁板底座上取下，用多通道自動(dòng)移液器向樣品孔中分別加入10yL洗脫液，將48孔板置于渦旋混合儀上振蕩I分鐘后，將48孔板放于55°C水浴鍋中靜置5分鐘；
[0069]步驟8):將48孔板放置于磁板架上靜置20秒，保持48孔板固定于磁板架上，用多通道自動(dòng)移液器轉(zhuǎn)移洗脫液至PCR板中，獲得目標(biāo)DNA產(chǎn)物于澄清的洗脫液中(圖2為提取的樣本經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后的膠圖)。
[0070]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，包括有分別獨(dú)立分裝的DNA固定結(jié)合液、第一磁珠懸浮液，清洗液、基因組DNA去除液、第二磁珠懸浮液和洗脫液； 其中，所述DNA固定結(jié)合液包括有:尿素、Tris堿、亞硫酸鈉、離液鹽、螯合劑、去垢劑和醋酸鹽;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合;所述去垢劑選自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合;所述醋酸鹽選自醋酸鉀、醋酸鈉或其組合； 所述第一磁珠懸浮液中包括有表面包覆娃輕基的第一磁珠，所述第一磁珠的粒徑為50_300nm; 所述清洗液包括異丙醇、離液鹽、螯合劑和去垢劑;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀或其組合;所述去垢劑選自Triton X-100、Tween-20、NP_40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合； 所述基因組去除液包括碳酸鉀、醋酸鈉、碳酸氫銨、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、硫酸鈉、離鹽液和去垢劑;所述離液鹽選自鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉或其組合;所述去垢劑選自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉或其組合； 所述第二磁珠懸浮液中包括有表面包覆硅羥基的第二磁珠，所述第二磁珠的粒徑為100_500nm; 所述洗脫液為Tr i s堿或去離子水。2.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述DNA固定結(jié)合液中尿素濃度為0.05-0.2mol/L，Tris堿濃度為20-100mmol/L，亞硫酸鈉濃度為0.1-2wt%，離液鹽濃度為2-8mOl/L，螯合劑濃度為l-200mmOl/L，去垢劑的體積分?jǐn)?shù)為0.01-5%，醋酸鹽濃度為0.05-lmol/L。3.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述第一磁珠分散液中第一磁珠的濃度為25-65mg/mL。4.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述清洗液中，異丙醇的體積分?jǐn)?shù)為45-65 %，離液鹽的濃度為0.1-0.5mol/L，螯合劑的濃度為10-100mmol/L，去垢劑的體積分?jǐn)?shù)為0.01-1 %。5.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述基因組DNA去除液中碳酸鉀濃度為0.1-11110 1/1^，醋酸鈉濃度為0.05-11110 1/1^，碳酸氫錢的濃度為0.5mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉濃度為10-100mmol/L，氯化鈉的濃度為3mol/L，硫酸鈉的濃度為Imo I /L，離液鹽濃度為1-6mo I /L，去垢劑的體積分?jǐn)?shù)為0.01-3%。6.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述第二磁珠懸浮液中第二磁珠的濃度為10-40mg/ mL。7.如權(quán)利要求1所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒，其特征在于，當(dāng)所述洗脫液為Tris堿時(shí)，Tris堿的濃度為0.9-1.lmmol/L。8.—種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括: 步驟I)將血液樣本轉(zhuǎn)移進(jìn)EP管中，加入DNA固定結(jié)合液，混均； 步驟2)向EP管加入第一磁珠懸浮液，振蕩混勻； 步驟3)將EP管置于磁力架裝置中，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去EP管中的液體； 步驟4)在EP管中加入清洗液，振蕩EP管使第一磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去清洗液； 步驟5)向EP管中加入基因組DNA去除液，振蕩EP管使第一磁珠懸浮均勾，磁性分離，靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中； 步驟6)向裝有上清液的新的EP管中加入第二磁珠懸浮液，混勻，振蕩結(jié)合;靜置，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，傾倒棄去EP管中的液體； 步驟7)向新的EP管中加入乙醇溶液，振蕩EP管使第二磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離，去除上清液； 步驟8)將新的EP管放入干燥箱中干燥，除去乙醇，在新的EP管中加入洗脫液，振蕩EP管使第二磁珠懸浮均勻，靜置，磁性分離去除第二磁珠，在新的EP管中的洗脫液中即含有目標(biāo)游離DNA。
【專利摘要】本案涉及基于磁珠法提取游離DNA的試劑盒及使用方法，試劑盒包括有分別獨(dú)立分裝的DNA固定結(jié)合液、第一磁珠懸浮液，清洗液、基因組DNA去除液、第二磁珠懸浮液和洗脫液。本案可以實(shí)現(xiàn)直接從全血樣本中提取游離DNA；將提取純化游離DNA的對(duì)象由血清或者血漿擴(kuò)大到全血樣本，將提取游離DNA的步驟向前延伸到血液的前期處理，大大減少了血液原先提取游離DNA的步驟；另外，該試劑盒同樣也可以兼容從血漿或血清樣本中提取純化游離DNA；本案可以去除基因組DNA干擾；可以將全血、血漿或血清中混入的微量基因組DNA去除，降低后續(xù)試驗(yàn)干擾；該試劑盒中的不同試劑的配合，使得游離DNA的提取效率和純度得到最大程度的保障。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號(hào)】CN105695450
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610206263
【發(fā)明人】吳巧, 曲峰, 尚春慶
【申請(qǐng)人】蘇州英芮誠生化科技有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日