本發(fā)明涉及DNA重組制備蛋白多肽技術，具體涉及一種GLP-1及其類似物與標簽蛋白的融合表達，GLP以及利用上述技術在生物合成分離制備GLP-1及其類似物多肽方面的應用。

背景技術：

上世紀60年代，麥金太爾((McIntyre)和埃爾里克(Elrick)等人發(fā)現(xiàn)，口服葡萄糖對胰島素分泌的促進作用明顯高于靜脈注射，這種額外的效應被稱為“腸促胰素效應”。隨著細胞和分子生物學的發(fā)展，研究證實腸促胰素是人體內一種腸源性激素，在進食后該類激素可促進胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。

腸促胰素主要由胰高血糖素-1(GLP-1)和糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)組成，其中GLP-1在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用。研究表明，一方面GLP-1可通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來降低血糖；另一方面，GLP-1還有減緩β細胞凋亡，促進其再生的獨特作用。

1983年Mclntyre等在分析胰高血糖素前體——胰高血糖素原(proglucagon，PG)的基因序列時發(fā)現(xiàn)了GLP-1。GLP-1基因在胰腺α細胞、腸道L細胞表達。完整的GLP-1多肽由37個氨基酸構成，其1-37肽序列結構為：

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG；

GLP-1多肽在體內的生物活性形式為GLP-1(7-37)多肽和GLP-1(7-36)酰胺，其中約80％的GLP-1循環(huán)活性來自GLP-1(7-36)酰胺。根據(jù)本領域習慣，GLP-1(7-37)OH的氨基末端指定為7號，而羧基末端指定為37號。關于GLP-1類似物和衍生物的更詳細描述見Hoffmann，J.A.[WO99/29336，1999年6月17日公布]和Knudsen，L.B.等[J.Med.Chem.43：1664-1669(2000)]。GLP-1(1-37)在體內生成后，通過兩步酶切，分別去除N端6個氨基酸及形成C端酰胺化，最終生成具有高度活性的GLP-1(7-36)酰胺(也稱GLP-1片段)。

GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R，屬于β受體家族的G偶聯(lián)蛋白)結合發(fā)揮作用。GLP-1結合GLP-1R后，激活細胞膜內環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。胰島成熟β細胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉錄和胰島素原生物合成，降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強細胞對胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。通過激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、MAPK通道，調節(jié)凋亡前蛋白及誘導抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-xL的表達以減緩β細胞凋亡，增進其再生，促使胰島β細胞分化并增殖。此外，GLP-1還能減慢胃排空速度；通過作用下丘腦，抑制食欲。

目前GLP-1及其類似物等多肽多采用基因重組方法制備。基因重組制備蛋白、多肽常采用大腸桿菌和酵母作為宿主。

利用酵母作為宿主制備多肽，多采用分泌表達，既在多肽的N端融合酵母信號肽(如α因子信號肽等)，在信號肽的引導下，多肽分泌到培養(yǎng)基中。該方案表達量高，后續(xù)分離純化方便，但存在表達產(chǎn)物易降解的問題。Egel-Mitani等人(Egel-Mitani,2000)在利用釀酒酵母表達GLP-1時發(fā)現(xiàn)，GLP-1分泌到培養(yǎng)基中后，極易被降解成多個片段，導致后續(xù)純化過程收率降低。

除了酵母外，大腸桿菌也是一類常用的蛋白表達宿主。然而GLP-1及其類似物等多肽，由于長度較短，在大腸桿菌細胞內極易降解，在表達時一般采用融合表達。采用融合表達方案，為得到具有生物活性的多肽，需要在純化出融合蛋白后，去除多肽之外的其余肽段，此時可通過化學切割或者酶切割等方法實現(xiàn)。亦可通過內含肽的方法，通過蛋白自切割釋放多肽，如Esipov等(Esipov 2006)采用Intein融合方案表達GLP-1，然而次方案表達出的融合蛋白為包涵體，表達量較低，后續(xù)處理成本高。采用化學切割，純在切割反應不完全，導致收率較低。采用酶切割，則酶制劑成本較高。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術不足,本發(fā)明的目的是提供一種可用于大規(guī)模、低成本制備GLP-1或其類似物的生物制備方法。

為此發(fā)明目的，發(fā)明首先提供了一種可用于制備GLP-1或其類似物多肽的先導融合蛋白及編碼該先導融合蛋白的融合基因。所述的融合基因具有形如A-B-C結構的基因序列，其中A為伴侶蛋白基因，B為編碼包含酶切位點的連接肽的核苷酸序列，C為編碼GLP-1或其類似物的基因。

所述融合基因中，A部分的伴侶蛋白基因可選自TrxA、DsbA、DsbC、Sumo、GST，Intein等，優(yōu)選TrxA蛋白。TrxA蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.8所示，編碼基因的序列如Seq ID No.7所示。

所述融合基因中，B部分的酶切位點連接肽可選自腸激酶、凝血酶、SUMO Protease等，優(yōu)選腸激酶酶切位點連接肽。腸激酶酶切位點連接肽的序列如Seq ID No.6所示，編碼基因的序列如Seq ID No.5所示。

所述融合基因中，C部分為編碼GLP-1或其類似物的基因序列，所述的GLP-1或其類似物可選自GLP-1(7-37),GLP-1(8-37),GLP-1(9-37),GLP-1(10-37),GLP-1(11-37),GLP-1(12-37),GLP-1(13-37),GLP-1(14-37),GLP-1(15-37)或GLP-1多肽類似物,包括:

Arg³⁴-GLP-1(7-37),Arg²⁶-GLP-1(7-37),Lys³⁶-GLP-1(7-37),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40),Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37),Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37),Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39),Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40),Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39),Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40),Gly⁸Arg²⁶-GLP-1(7-37),Gly⁸Arg³⁴-GLP-1(7-37),Gly⁸Lys³⁶-GLP-1(7-37),Gly⁸Arg^26,34Lys³⁶-GLP-1(7-37),Gly⁸Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39),Gly⁸Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40),Gly⁸Arg²⁶Lys³⁶-GLP-1(7-37),Gly⁸Arg³⁴Lys³⁶-GLP-1(7-37),Gly⁸Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39),Gly⁸Arg³⁴Lys⁴⁰-GLP-1(7-40),Gly⁸Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39),Gly⁸Arg^26,34Lys^36,40-GLP-1(7-40),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(7-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(7-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(7-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(7-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(7-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(7-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(7-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(1-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(1-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(1-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(1-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(1-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(1-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(1-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(1-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(2-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(2-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(2-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(2-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(2-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(2-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(2-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(2-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(3-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(3-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(3-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(3-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(3-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(3-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(3-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(3-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(4-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(4-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(4-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(4-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(4-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(4-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(4-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(4-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(5-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(5-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(5-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(5-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(5-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(5-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(5-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(5-45),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(6-38),Arg^26,34Lys³⁹-GLP-1(6-39),Arg^26,34Lys⁴⁰-GLP-1(6-40),Arg^26,34Lys⁴¹-GLP-1(6-41),Arg^26,34Lys⁴²-GLP-1(6-42),Arg^26,34Lys⁴³-GLP-1(6-43),Arg^26,34Lys⁴⁴-GLP-1(6-44),Arg^26,34Lys⁴⁵-GLP-1(6-45),Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(1-38),Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(1-38),Arg^26,34Lys^36,38-GLP-1(1-38),Arg²⁶Lys³⁸-GLP-1(7-38),Arg³⁴Lys³⁸-GLP-1(7-38),Arg^26,34Lys^36,38-GLP-1(7-38),Arg^26,34Lys³⁸-GLP-1(7-38),Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(1-39),Arg³⁴Lys³⁹-GLP-1(1-39),Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(1-39),Arg²⁶Lys³⁹-GLP-1(7-39),Arg³⁴Lys³⁹-GLP-1(7-39)和Arg^26,34Lys^36,39-GLP-1(7-39)。

適合本發(fā)明的GLP-1類似物在現(xiàn)有技術中有多處記載，具體可參考描述于WO93/19175中(Novo Nordisk)，WO99/43705(Novo Nordisk)，WO99/43706(Novo Nordisk)，WO99/43707(Novo Nordisk)，WO98/08871(具有親脂性取代基的類似物)和WO02/46227(與血清白蛋白或與Ig的Fc部分融合的類似物)(Novo Nordisk A/S)，WO99/43708(Novo Nordisk A/S)，WO99/43341(Novo Nordisk A/S)，WO87/06941(The General Hospital Corporation)，WO90/11296(The General Hospital Corporation)，WO91/11457(Buckley等)，WO98/43658(Eli Lilly&Co.)，EP0708179-A2(Eli Lilly&Co.)，EP0699686-A2(Eli Lilly&Co.)，WO01/98331(Eli Lilly&Co.)和CN200480034152.8中所提及的那些，在此全部引入作為參考。

可用一簡單體系來描述GLP-1多肽的片段及類似物。例如Arg³⁴-GLP-1(7-37)表示從GLP-1缺失掉氨基酸殘基No.1-6，并在位置34(Lys)用Arg取代天然存在的氨基酸殘基后形成的GLP-1片段,其他類似物以此類推。本文中提到C-末端延伸的GLP-1類似物時，則除非另外說明，在38位的氨基酸殘基均是Arg，在39位的可選氨基酸殘基也是Arg(除非另有說明)，在40位的可選氨基酸殘基是Asp(除非另有說明)。同樣，如果C-末端延伸的類似物延伸到位置41、42、43、44或45，則除非另外說明，此延伸物的氨基酸序列均與人前胰高血糖素原中的對應序列一樣。

所述融合基因中，C部分的GLP-1或其類似物優(yōu)選自Arg³⁴-GLP-1(7-37)、Arg³⁴-GLP-1(8-37),Arg³⁴-GLP-1(9-37),Arg³⁴-GLP-1(10-37),Arg³⁴-GLP-1(11-37),Arg³⁴-GLP-1(12-37),Arg³⁴-GLP-1(13-37),Arg³⁴-GLP-1(14-37)和Arg³⁴-GLP-1(15-37)。

其中，Arg³⁴-GLP-1(7-37)的序列為：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；

其基因序列和氨基酸序列分別如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。

Arg³⁴-GLP-1(9-37)的序列為：

EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；

其基因序列和氨基酸序列分別如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示。

本發(fā)明構建的融合基因，優(yōu)選為編碼TrxA-腸激酶酶切位點-Arg34-GLP-1(7-37)融合蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID No.9所示，編碼的融合蛋白的氨基酸序列如如SEQ ID No.10所示。

本發(fā)明構建的融合基因，另一優(yōu)選為編碼TrxA-腸激酶酶切位點-Arg34-GLP-1(9-37)融合蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID No.11所示，編碼的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

構建好融合基因后，可用本領域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達載體中去。所用標準的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995.)的敘述。不同的融合基因可分別在宿主中表達得到各種融合蛋白。

本發(fā)明的另一目的提供一種可以大規(guī)模,低成本生產(chǎn)重組GLP-1多肽或其類似物的方法，所述方法包括如下的步驟：

(1)、在保持各自基因密碼子閱讀框架不變的前提下，構建具有如下結構的融合基因：A-B-C，其中A部分為編碼伴侶蛋白的核苷酸序列，B為編碼蛋白酶切位點的連接肽的核苷酸序列，C為GLP-1多肽或其類似物基因；

(2)、將上述的A-B-C融合基因序列連接到表達載體，將表達載體轉化導入大腸桿菌中，經(jīng)篩選得到重組基因工程菌；

(3)、高密度發(fā)酵重組大腸桿菌，經(jīng)誘導表達獲得融合蛋白，加入蛋白酶切，經(jīng)分離純化獲得重組GLP-1多肽或其類似物。

步驟(1)中，A、B、C各部分的基因定義如前所述。人工合成C部分(GLP-1或其類似物)基因，并在5’和3’端分別添加KpnI和BamHI酶切位點，合成好的基因克隆在pUC32質粒中，此部分工作由技術服務公司完成。抽提質粒雙酶切，得到GLP-1基因片段，將此片段通過連接酶克隆島雙酶切后的pET32a質粒載體，利用載體上已有的A和B部分基因，構成完整的表達序列A-B-C。

構建好融合基因后，可用本領域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達載體中去。所用標準的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995.)的敘述。許多表達載體和其對應的宿主可以從公司購得，如表達載體pET系列載體、pDEST系列載體等。優(yōu)選的方法是將編碼本發(fā)明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至表達載體pDEST-15，含有T7啟動子。

載體可經(jīng)轉化大腸桿菌宿主，宿主可選自BL21(DE3)、T7Express、BL21(DE3pLyss)等，優(yōu)選BL21(DE3pLyss)。轉化所需載體至宿主細胞中去可用通常的方法，如：熱激法、電轉法等。成功轉化的細胞，即含有本發(fā)明DNA構建體的細菌，可通過人們熟知的技術加以鑒定，如細胞經(jīng)收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鑒定。

可以通過培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構建體的宿主，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以用搖瓶或生物反應器等，生產(chǎn)時優(yōu)選的為生物反應器。培養(yǎng)基應能提供菌體(或細胞)生長和產(chǎn)物表達所需的物質，應包含氮源、碳源、pH緩沖成分等，培養(yǎng)基配方一般應根據(jù)不同培養(yǎng)對象，通過試驗獲得。培養(yǎng)可分兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細胞)的生長，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。可以用各種蛋白分離的方法分離純化蛋白，如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。

本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例是在大腸桿菌中表達GLP-1及其類似物，為此構建一個重組質粒，該質粒含有T7啟動子、融合蛋白、蛋白酶切位點、GLP-1或其類似物。將構建好的質粒，轉化大腸桿菌BL21，得到重組工程菌，表達重組融合蛋白。構建好重組工程菌經(jīng)發(fā)酵，重組蛋白獲得表達。離心收集菌體，通過高壓勻漿破碎大腸桿菌，釋放重組蛋白。利用重組蛋白中的His-Tag，通過金屬螯合柱層析，純化出融合蛋白。再利用E切割，將GLP-1或其類似物與融合蛋白斷開，釋放出多肽。最后利用等電沉淀，獲得GLP-1或其類似物。

本發(fā)明的技術現(xiàn)對于現(xiàn)有技術具有以下的優(yōu)點：

1、由于融合蛋白的存在，目的蛋白以可溶性蛋白形式表達，表達量高(占菌體總蛋白15％以上，最高可達50％)。2、融合蛋白的存在可以大大簡化下游簡化工藝。如TrxA融合蛋白很容易通過硫胺分級沉淀與其它蛋白分離。

3、利用EK酶酶切，酶識別位點特異性高，酶活性高、反應時間短、反應條件溫和，處理工藝簡易。

4、融合蛋白的純在，使得酶切后多肽與余下部分容易分離，簡化了多肽的純化工藝。

5、通過等點沉淀的方法，一步從酶切液里面回收多肽，工藝簡單、成本低。

附圖說明

附圖1：pET32a-GLP-1質粒圖譜

附圖2：pDEST-15-GLP-1質粒圖譜

附圖3：融合蛋白HPLC檢測圖譜

附圖4：EK酶切后HPLC檢測圖譜

附圖5：EK酶切后SDS-PAGE檢測圖譜，(泳道4為未酶切樣品泳道1-3；5-7為酶切不同時間終止反應后的樣品)

附圖6：粗肽Arg³⁴-GLP-1(7-37)體外活性檢測結果圖

具體實施方式

實施例1

構建一種表達人胰高血糖素-1類似物的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg³⁴-GLP-1(7-37)的基因工程菌，此處TrxA為硫氧還蛋白。

首先根據(jù)Arg³⁴-GLP-1(7-37)多肽序列，翻譯成基因序列，在其5’端添加EK酶切位點對應的核酸序列以及KpnI酶切位點，在其3’端添加終止子以及BamHI酶切位點，具體如下：

GGTACCGACGACGACGACAAGGAGGGTACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT

由基因合成服務公司合成上述序列，并克隆在克隆載體pUC32上。抽提該質粒，通過KpnI和BamHI雙酶切，將合成的基因片段從質粒上酶切下來。TrxA蛋白的基因來自于pET32a質粒。具體得，設計引物通過PCR得到TrxA基因片段,并在片段兩端添加NdeI和KpnI酶切位點；將擴增片段通過拓撲異構酶連接到T載體上，將該載體轉化大腸桿菌Top1，搖菌抽提質粒通過NdeI和KpnI雙酶切得到TrxA基因片段。將上述酶切得到的多肽基因片段和TrxA基因片段通過酶切鏈接克隆到pET32a質粒的NdeI和BamHI酶切位點之間，構建好的質粒如圖1所示。將上述質粒通過NdeI和BamHI酶切得到表達序列，通過連接酶連接到表達載體pDEST-15相應的酶切位點中間，得到表達GLP-1類似物的表達載體，構建好的質粒如圖2所示。

將表達載體通過熱激法轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，由于構建好的質粒帶有氨芐青霉素抗性，通過抗性平板篩選，得到表達GLP-1類似物的基因工程菌。

實施例2

構建一種表達人胰高血糖素-1類似物的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg³⁴-GLP-1(9-37)的基因工程菌，此處TrxA為硫氧還蛋白。

首先合成Arg³⁴-GLP-1(9-37)多肽的基因序列，在其5’端添加EK酶切位點對應的核酸序列以及KpnI酶切位點，在其3’端添加終止子以及BamHI酶切位點，具體如下：

GGTACCGACGACGACGACAAGACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT

由基因合成服務公司合成上述序列，并克隆在克隆載體pUC32上。抽提該質粒，通過KpnI和BamHI雙酶切，將合成的基因片段從質粒上酶切下來。TrxA蛋白的基因來自于pET32a質粒。具體得，設計引物通過PCR得到TrxA基因片段,并在片段兩端添加NdeI和KpnI酶切位點；將擴增片段通過拓撲異構酶連接到T載體上，將該載體轉化大腸桿菌Top1，搖菌抽提質粒通過NdeI和KpnI雙酶切得到TrxA基因片段。將上述酶切得到的多肽基因片段和TrxA基因片段通過酶切鏈接克隆到pET32a質粒的NdeI和BamHI酶切位點之間。

將上述質粒通過NdeI和BamHI酶切，將酶切片段連接到表達載體pDEST-15相應的酶切位點中間，得到表達Arg³⁴-GLP-1(9-37)多肽的表達載體。

將表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，通過抗性平板篩選，得到表達Arg³⁴-GLP-1(9-37)多肽的基因工程菌。

實施例3

構建一種表達人胰高血糖素-1的基因工程菌：含有TrxA-EK-Arg³⁴-GLP-1(11-37)的基因工程菌，此處TrxA為硫氧還蛋白。其構建方法同實施例1和2。

實施例4

構建一種表達人胰高血糖素-1的基因工程菌：含有DsbA-EK-GLP-1的基因工程菌，此處DsbA為二硫鍵形成蛋白A。

首先合成Arg³⁴-GLP-1(11-37)多肽的基因序列，在其5’端添加EK酶切位點對應的核酸序列以及KpnI酶切位點，在其3’端添加終止子以及BamHI酶切位點，具體如下：

GGTACCGACGACGACGACAAGACTTTCACTTCTGACGTTTCTTCTTACTTGGAGGGTCAAGCTGCTAAGGAGTTCATTGCTTGGTTGGTTAGGGGTAGAGGATGAAAGCTT

將該序列克隆到pET39a載體的KpnI和BamHI酶切位點之間。如此利用pET39a載體原有序列，可以在Arg³⁴-GLP-1(11-37)上游融合DsbA蛋白。

將上述質粒通過NdeI和BamHI酶切，克隆到表達載體pDEST-15相應的酶切位點中間，得到表達Arg³⁴-GLP-1(11-37)的表達載體。

將表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，通過抗性平板篩選，得到表達Arg³⁴-GLP-1(11-37)的基因工程菌。

實施例5

取實施例1(其它構建的菌種可同樣處理)中構建好的基因工程菌，進行高密度發(fā)酵，離心后獲得菌體，10L發(fā)酵液可得1kg濕菌。菌體按照1:10重懸于100mM Tris-HCl pH8.5的緩沖液中，勻漿破菌后收集上清液。上清液加入硫酸銨沉淀蛋白，收集蛋白沉淀，用20mM Tris-HCl pH8.5溶解，然后用Q-FF離子交換層析純化出融合蛋白，純化出的融合蛋白約為10g/L發(fā)酵液，純度大于90％，見附圖3。

實施例6

實施例5經(jīng)Q-FF純化后得到的融合蛋白，加入10X切割緩沖液，然后加入腸激酶進行酶切。酶切溫度2-8°，酶切時間4-12h，酶切效率大于95％，見附圖4(RP-HPLC)和5(SDS-PAGE)。酶切結束后加入20％無水乙醇，調節(jié)pH至4.5，靜置過夜后，收集沉淀即為Arg³⁴-GLP-1(7-37)，其中Arg³⁴-GLP-1(7-37)的收率大于90％。

實施例7

Arg³⁴-GLP-1(7-37)體外活性測定

根據(jù)本公司專利CN201410079787.5，采用RIN-m5f細胞測定Arg³⁴-GLP-1(7-37)的體外活性。將RIN-m5f培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)一定時間后，加入對照品以及Arg³⁴-GLP-1(7-37)粗品，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，采用Promega試劑盒，測定細胞內cAMP水平。結果顯示(附圖6)，Arg³⁴-GLP-1(7-37)粗品具有70％左右的體外活性。