本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60核苷酸序列以及其在大腸桿菌中高效制備的方法。

背景技術(shù)：

β淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)是一種分子量約為4KD的跨膜蛋白,由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解產(chǎn)生。APP具有兩條代謝途徑：第一條途徑由α分泌酶作用于APP的Aβ序列16-17位氨基酸，水解后再由γ分泌酶作用，產(chǎn)生較小片段p3和胞內(nèi)片段(APP intracellular domain,AICD)，該途徑產(chǎn)物對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用；另一條途徑最終產(chǎn)物主要為Aβ，此途徑是APP在β分泌酶對其第一位氨基酸序列水解后，產(chǎn)生一個大的N端片段(sAPPβ)和小的跨膜片段(C99)，后者經(jīng)γ分泌酶在Aβ序列的第40、第42位氨基酸部位作用，產(chǎn)生39-42個氨基酸的肽段，即Aβ。

生理情況下，Aβ的生成和降解處于動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體遭受某種應(yīng)激，與眾多因素協(xié)同產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)打破平衡時，Aβ可在器官內(nèi)大量聚集，形成淀粉樣沉積。已有研究證實(shí)，Aβ的過量分泌和異常聚集是誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)及年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD的發(fā)生發(fā)展的重要原因。Aβ可通過加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡、影響膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、誘發(fā)氧化應(yīng)激與自由基產(chǎn)生等對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。因此通過抗原多肽進(jìn)行主動免疫從而清除病變部位的Aβ被廣泛研究，先前研究發(fā)現(xiàn)臨床疫苗接種會引起T-細(xì)胞的大量活化，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥等不良反應(yīng)，使得免疫治療的臨床試驗(yàn)被迫中止。然而最新研究顯示，Aβ_1-15-HSP60(Aβ1-15(B細(xì)胞表位)與輔助免疫增強(qiáng)蛋白熱休克蛋白60(HSP60)多肽p458融合)抗原多肽疫苗可有效清除AD大鼠模型的Aβ，且免疫過程僅產(chǎn)生溫和的T-細(xì)胞反應(yīng)。因此Aβ_1-15-HSP60抗原多肽具有廣闊的臨床開發(fā)前景。

研究及臨床中應(yīng)用的多肽主要采用化學(xué)合成及基因重組生物合成兩種方式?；瘜W(xué)合成產(chǎn)率低成本昂貴，基因重組生物合成則難以高效可溶性表達(dá)目的產(chǎn)物。其中，大腸桿菌系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于重組外源蛋白的制備，其具有生長速度快、發(fā)酵條件容易控制、外源蛋白表達(dá)量較高等優(yōu)點(diǎn)，但在大腸桿菌中所表達(dá)的外源蛋白容易形成包涵體，造成可溶性差。目前，重組Aβ_1-15-HSP60抗原多肽在大腸桿菌中的高效可溶性制備國內(nèi)外均無相關(guān)報道，因此開發(fā)一種能夠在大腸桿菌系統(tǒng)高效可溶性表達(dá)重組Aβ_1-15-HSP60抗原多肽的方法對于神經(jīng)退行性疾病的研究及治療具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60核苷酸序列，使其在大腸桿菌高效可溶性表達(dá)，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的重組蛋白表達(dá)量低及以包涵體形式表達(dá)的缺陷。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明第一方面提供了一種優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO:2所示。

上述優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60核苷酸序列，是在不改變氨基酸編碼序列的情況下按照大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行核苷酸序列優(yōu)化同時突變ACA密碼子制得；通過選擇低溫表達(dá)系統(tǒng)，利用在低溫條件下，外源蛋白緩慢表達(dá)可增進(jìn)蛋白的正確折疊，提高可溶性與穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，使重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60在大腸桿菌中總表達(dá)量及可溶性表達(dá)量同時增加。

本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種合適的原核表達(dá)系統(tǒng)，使其在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的重組蛋白表達(dá)量低及以包涵體形式表達(dá)的缺陷。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

在本發(fā)明的第二方面提供了一種重組表達(dá)載體pCold/Aβ_1-15-HSP60的構(gòu)建方法，將基因合成的Aβ_1-15-HSP60 DNA與pCold載體(購自Takara公司)分別用Nde I和Xba I酶切后，使用T4連接酶進(jìn)行連接得到一種重組表達(dá)載體即pCold/Aβ_1-15-HSP60。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種高效表達(dá)可溶性重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60工程菌的構(gòu)建方法，將重組表達(dá)載體pCold/Aβ_1-15-HSP60轉(zhuǎn)化宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選獲得高表達(dá)工程菌。優(yōu)選的，該表達(dá)菌株為大腸桿菌。更優(yōu)選的，為大腸桿菌BL21(DE3)。

進(jìn)一步地，所述的表達(dá)載體是pCold/Aβ_1-15-HSP60。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種高效表達(dá)可溶性重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)方法，該方法通過培養(yǎng)上述表達(dá)菌株實(shí)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑為1.0mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)溫度為15℃，誘導(dǎo)時間為6小時。

采用本發(fā)明提供的優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60的核苷酸序列及表達(dá)方法，外源蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白表達(dá)量的50％以上，在總表達(dá)量提高的同時，可溶性表達(dá)量占總表達(dá)量的70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上。

本發(fā)明的核苷酸序列表如下：

<110>江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所

<120>一種優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ1-15-HSP60核苷酸序列及其高效制備方法

<160>2

<210>1

<211>93

<212>DNA

<213>人Aβ1-15-HSP60

<400>1

gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat 42

aat gaa gat caa aaa att ggt ata gaa att att aaa aga aca ctc aaa att 93

<210>1

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gat gcg gaa ttt cgc cat gat agc ggc tat gaa gtg cat cat cag 45

aac gaa gat cag aaa att ggc att gaa att att aaa cgc acc ctg aaa att 96

其中，SEQ ID NO:1即為人Aβ 1-15-HSP60的氨基酸序列；SEQ ID NO:2為優(yōu)化的重組抗原多肽Aβ 1-15-HSP60核苷酸序列。

本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是：

本發(fā)明人根據(jù)天然Aβ_1-15-HSP60的氨基酸序列，按照大腸桿菌偏好密碼子原則，優(yōu)化核苷酸序列，同時對優(yōu)化的核苷酸序列進(jìn)行ACA密碼子突變，將人工合成的基因克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pCold質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)過表達(dá)篩選獲得重組Aβ_1-15-HSP60高效可溶性表達(dá)工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可在宿主菌中高效表達(dá)外源基因。

本發(fā)明提供了一種利用大腸桿菌系統(tǒng)高效制備抗原多肽Aβ_1-15-HSP60的方法，天然核苷酸序列優(yōu)化后非常適合在大腸桿菌中表達(dá)，具有高產(chǎn)量、高穩(wěn)定的特點(diǎn)；采用低溫表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的抗原多肽Aβ_1-15-HSP60具有天然的折疊結(jié)構(gòu)，可溶性高，純化簡單，成本低廉，為神經(jīng)退行性疾病疫苗的研究提供了一種價廉有效的工具。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1：重組表達(dá)質(zhì)粒(pCold/Aβ_1-15-HSP60)的酶切鑒定圖。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(L2000)，1：pCold空載體，2：pCold/Aβ_1-15-HSP60重組載體雙酶切。

圖2：大腸桿菌E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)總蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(未誘導(dǎo))，2：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(IPTG誘導(dǎo)，未優(yōu)化的核苷酸序列)，3：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)。

圖3：大腸桿菌E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)破菌蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)總蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)，2：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)上清蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)。

圖4：Aβ_1-15-HSP60分離純化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1.：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)上清蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)，2：Ni²⁺親和層析柱純化，3：Q Sepharose FF離子交換層析純化。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明；下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，列入分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：

重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60核苷酸序列的優(yōu)化

本發(fā)明的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60全基因合成由金斯瑞生物科技有限公司完成，在進(jìn)行基因合成時，要求在目的基因的上下端分別設(shè)計(jì)的Nde I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)，分別為CGCCATATG和ACGCTCTAGA。所合成的目的基因全長96bp，裝入克隆載體pUC57質(zhì)粒中測序驗(yàn)證。與天然抗原多肽Aβ_1-15-HSP60基因相比，本發(fā)明所合成的cDNA將部分密碼子改為大腸桿菌偏好密碼子，同時對ACA密碼子進(jìn)行了突變，但是沒有涉及到氨基酸的改變，屬同義突變。

實(shí)施例2：

重組表達(dá)載體pCold/Aβ_1-15-HSP60的構(gòu)建

(1)將帶有全長Aβ_1-15-HSP60的pUC57及pCold質(zhì)粒分別進(jìn)行Nde I，Xba I雙酶切，將兩個片段用T4連接酶進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物。

(2)將連接產(chǎn)物用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切及測序鑒定篩選陽性克隆，得到pCold/Aβ_1-15-HSP60質(zhì)粒。

實(shí)施例3：

Aβ_1-15-HSP60高效可溶性表達(dá)工程菌的構(gòu)建

(1)實(shí)施例2中獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌BL21(DE3)，即本發(fā)明的工程菌。

(2)在固體M9瓊脂培養(yǎng)基平板挑選單克隆，于含氨芐青霉素100ug/ml的4mLM9液體培養(yǎng)基中37℃，200轉(zhuǎn)/分，搖菌過夜。

(3)接種1％的菌液至含氨芐青霉素100ug/ml的M9培養(yǎng)液里，37℃搖菌至OD＝0.5，加入1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)，15℃搖菌6h，回收菌體。

(4)經(jīng)超聲破菌后，分別對全菌、上清和沉淀(包涵體)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析外源蛋白表達(dá)量。對照誘導(dǎo)前后菌體及上清外源蛋白的變化，篩選外源蛋白高效表達(dá)的工程菌。

實(shí)施例4：

表達(dá)產(chǎn)生的重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60的含量和可溶性比例

優(yōu)化的核苷酸序列所對應(yīng)的目的蛋白可在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)。發(fā)明人使用ImageTool 3.0灰度掃描軟件對SDS-PAGE圖進(jìn)行灰度掃描。其中，優(yōu)化的核苷酸序列表達(dá)目的蛋白占菌體總蛋白的52.7％以上(如圖2所示)?？扇苄阅康牡鞍妆磉_(dá)量占目的蛋白總表達(dá)量的94.3％以上(如圖3所示)。

實(shí)施例5：

可溶性重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60的純化

(1)將含有表達(dá)產(chǎn)物的菌體1g用細(xì)菌裂解液(20％蔗糖，20mM Tris-Cl，pH8.0)10mL進(jìn)行重懸，超聲裂解菌體，4℃高速離心(10000rpm)15min,收集裂解上清液。

(2)將裂解上清液用0.22μm的濾膜除雜，上Ni²⁺親和層析柱(Histrap HP，GE)，用不同濃度Imidazole Wash Buffer 200mM進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，考馬斯亮藍(lán)染液鑒定。

(3)將Ni²⁺親和層析柱洗脫產(chǎn)物過PD10脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，用20mM Tris-Cl(pH8.0)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，考馬斯亮藍(lán)染液鑒定。

將脫鹽產(chǎn)物(pH8.0)進(jìn)行離子柱(HiTrap Q，GE)純化，觀測紫外檢測峰，收集出峰樣品，即為純化重組抗原多肽Aβ_1-15-HSP60。

圖1：重組表達(dá)質(zhì)粒(pCold/Aβ_1-15-HSP60)的酶切鑒定圖。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(L2000)，1：pCold空載體，2：pCold/Aβ_1-15-HSP60重組載體雙酶切。

圖2：大腸桿菌E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)總蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(未誘導(dǎo))，2：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(IPTG誘導(dǎo)，未優(yōu)化的核苷酸序列)，3：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)。

圖3：大腸桿菌E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)破菌蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)總蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)，2：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)上清蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)。

圖4：Aβ_1-15-HSP60分離純化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。M：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1.：E.coli(pCold/Aβ_1-15-HSP60)上清蛋白(IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化的核苷酸序列)，2：Ni²⁺親和層析柱純化，3：Q Sepharose FF離子交換層析純化。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。