本發(fā)明屬于宮頸癌技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法。

背景技術(shù)：

目前，宮頸癌是全球女性第二大常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。研究已證實高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是發(fā)生宮頸癌的必要病因。然而，約80％的女性在50歲之前都曾感染過HPV，其中絕大多數(shù)可在一年內(nèi)自限清除，僅10％左右發(fā)生持續(xù)感染，最終約1％逐步進展為宮頸癌。

因此，僅依靠檢測HPV感染陽性作為宮頸癌高危人群判斷標(biāo)準(zhǔn)，不符合人群篩查的成本-效益原則，勢必增加社會衛(wèi)生經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，以及個人和家庭的精神負(fù)擔(dān)；HPV感染者中真正成癌的比例較低，有大批HPV感染者的分流、分診存在不確定性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法，旨在解決依靠檢測HPV感染陽性作為宮頸癌高危人群判斷存在大批HPV感染者的分流、分診存在不確定性的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法，包括以下步驟：

步驟一，收集子宮頸口內(nèi)外的脫落細胞，將沾有細胞物的小刷子放入裝有保存液的標(biāo)本儲存瓶里；采用DNA提取試劑盒提取宮頸脫落細胞中HPV病毒和人類基因組的總DNA，用于HPV的PCR檢測和人類基因遺傳變異位點的分型檢測；

步驟二，PCR反應(yīng)體系為：總體積20μl，含有約50ng模板DNA,12.5pmol每種引物，0.1mM每種單核苷酸，10×PCR緩沖液，1.5mM MgCl₂和1.0單位Taq酶；10×PCR緩沖液為50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100；取5ul PCR產(chǎn)物與1ul溴酚藍混勻后上樣，于3％瓊脂糖凝膠80V電泳40分鐘，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察條帶位置可明確HPV型別；

步驟三，選取的人類免疫相關(guān)通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。使用ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀進行基因分型；

步驟四，實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)次數(shù)為45次。擴增循環(huán)結(jié)束后，讀取擴增后熒光信號，運用SDS2.0軟件進行基因型判讀。

進一步，所述PCR反應(yīng)條件：

第一步，95℃預(yù)變性5min；

第二步，95℃變性30s；

第三步，采用各型別引物退火溫度復(fù)性40s；

第四步，72℃引物延伸45s，第二步至第四步重復(fù)35個循環(huán)；

第五步72℃延伸10min。

進一步，所述核心基因的潛在功能性多態(tài)位點篩選方法如下：使用NCBI dbSNPs數(shù)據(jù)庫進行多態(tài)性位點的篩選，選點原則包括：(1)位于潛在功能性區(qū)域，即基因編碼區(qū)、5’側(cè)翼區(qū)即轉(zhuǎn)錄起始位點上游2kb以內(nèi)的區(qū)域、5’非翻譯區(qū)、3’UTR；(2)在中國人群中的最小等位基因頻率≥0.05；(3)如果多個位點間存在高連鎖不平衡，僅選擇其中一個位點作為代表。

進一步，所述ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀每塊384孔反應(yīng)平板中5ul反應(yīng)體系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探針各0.125ul，DNA樣本0.5ul，雙蒸水1.25ul。

進一步，所述基因分型的引物和探針序列如下：

IL17A rs2275913引物F:GGGGTGACACCATTTTGGTTA

R:ATGAATTTCTGCCCTTCCCA

探針FAM-AGAATCTCTCCTTCTGAA-MGB

HEX-AGAATCTCTTCTTCTGAAG-MGB

IL23R rs1884444引物F:CCTAATCAAAGGTTCCCATCA

R:ACCATACCTCCATGACACCAG

探針FAM-CATGAATCAGGTCACTA-MGB

HEX-CATGAATCATGTCACTAT-MGB

IL23R rs6682925引物F:AATGAAATCAGCACCATGAGAG

R:TTATGGCTGCATAATATTCCTGTA

探針FAM-TATTCCACTAATAGGCACTT-MGB

HEX-ATTCCACTGATAGGCA-MGB

IL12R rs11209046引物F:TGCGGCCCAGAGCAC

F:CCCCGACCCCGAGTCA

探針FAM-CACTCACCGCGTGTCG-MGB

HEX-CACTCACCACGTGTCG-MGB

IL12R rs1874396引物F:TGAGACCAGTCATGACCACCTT

R:AAAACAAATCAACCTAGTTCTATAGATGAAGACA

探針FAM-CTTTTACCTTGGTGTTTAC-MGB

HEX-CCTTTTACATTGGTGTTTAC-MGB

TLR1rs5743551引物F:AGTAGTGGGGATGAGTCTGTGGG

R:TTGTGAATCCAGGCTGAGGG

探針FAM-TGCTGAGAAGCTTC-MGB

HEX-TGCTGAGGAGCTTC-MGB

TLR3rs3775291引物F:ATTTGTATCACTTGCTCATTCTCCC

R:CCCAACCAAGAGAAAGCATCA

探針FAM-TACACATACTCAACCTAAC-MGB

HEX-TACACATATTCAACCTAAC-MGB

TLR9rs187084引物F:GGGTGTACATAATTCAGCAGATATCAA

R:TCATGGTTTATTGTATATCGTCTTATTCC

探針FAM-CTGCCCTTAAGAAG-MGB

HEX-TGCCCTCAAGAAG-MGB

HLA-DP rs3077引物F:TCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTG

R:GAGCTTGAAGGGTCAGCAATTC

探針FAM-AAACTACCCCAGTGGC-MGB

HEX-AAACTACTCCAGTGGCT-MGB

HLA-DP rs9277535引物F:AATGGTGAGCAGACTGCAAATCT

R:TGGTAATGATAAAACATGCTCTCAGTAA

探針FAM-ATAGGACCCGTATTC-MGB

HEX-ATAGGACCCATATTC-MGB

HLA-DQ rs2856718引物F:GAGCTCCCTCTGGCAGGTT

R:TATGCTTTCACCAACTTCCTTCAC

探針FAM-AGAGCTGTTTAATCC-MGB

HEX-AGAGCTGTCTAATCC-MGB

HLA-DQ rs7453920引物F:TTTAGGGAGGTAAGAGGGAAAGC

R:CGAGAACGCCCTGATCTAAGA

探針FAM-ACCGATTCGACATTG-MGB

HEX-ACCGATTCAACATTG-MGB。

本發(fā)明提供的HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法，綜合HPV和宿主雙方因素，能夠有效提高對宮頸癌發(fā)病的預(yù)警能力，有利于開展符合成本-效益的宮頸癌篩查，為宮頸癌預(yù)防關(guān)口前移，從而采取合理診治提供了可靠的生物標(biāo)志物和檢測手段。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)顯著增加了宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險，與攜帶rs3077GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，攜帶GA/AA基因型且感染HPV-16的女性發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險增加了3.11倍(OR＝4.11,95％CI＝2.62-6.49)；與攜帶rs3775291GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，攜帶GA/AA基因型且感染HPV-16的女性發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險增加了2.64倍(OR＝3.64,95％CI＝2.30-5.75)；因此，聯(lián)合HPV型別和宿主遺傳因素可有效預(yù)測宮頸癌發(fā)病風(fēng)險，綜合指標(biāo)的靈敏度和特異度優(yōu)于單獨檢測HPV。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的與感染者的對比示意圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例的HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法包括以下步驟：

S101：收集子宮頸口內(nèi)外的脫落細胞，將沾有細胞物的小刷子放入裝有保存液的標(biāo)本儲存瓶里；采用DNA提取試劑盒提取宮頸脫落細胞中HPV病毒和人類基因組的總DNA，用于HPV的PCR檢測和人類基因遺傳變異位點的分型檢測；

S102：PCR反應(yīng)體系為：總體積20μl，含有約50ng模板DNA,12.5pmol每種引物，0.1mM每種單核苷酸，10×PCR緩沖液(50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl₂和1.0單位Taq酶；取5ul PCR產(chǎn)物與1ul溴酚藍混勻后上樣，于3％瓊脂糖凝膠80V電泳40分鐘，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察條帶位置可明確HPV型別；

S103：選取的人類免疫相關(guān)通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。使用ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀進行基因分型；

S104：每塊384孔反應(yīng)平板中5ul反應(yīng)體系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探針各0.125ul，DNA樣本0.5ul，雙蒸水1.25ul。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)次數(shù)為45次。擴增循環(huán)結(jié)束后，讀取擴增后熒光信號，運用SDS2.0軟件進行基因型判讀。

所述HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)的測試方法采用流行病學(xué)的病例-對照研究設(shè)計，病例為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院(CIHCAMS)確診的新發(fā)宮頸癌患者，對照來源于同期參加CIHCAMS宮頸癌篩查項目進行婦科檢查的健康人群。由醫(yī)務(wù)人員使用專門的HPV采樣刷與研究對象的子宮頸口外部分充分接觸并逆時針旋轉(zhuǎn)5次(2.5個整圈)，以收集子宮頸口內(nèi)外的脫落細胞。將沾有細胞物的小刷子放入裝有保存液的標(biāo)本儲存瓶里。采用QIAGEN公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取宮頸脫落細胞中HPV病毒和人類基因組的總DNA，用于后續(xù)HPV的PCR檢測和人類基因遺傳變異位點的分型檢測。中國人群中最常見的4種HPV的分型檢測引物見表1，PCR反應(yīng)體系為：總體積20μl，含有約50ng模板DNA,12.5pmol每種引物，0.1mM每種單核苷酸，10×PCR緩沖液(50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl₂和1.0單位Taq酶。反應(yīng)條件：第一步95℃預(yù)變性5min，第二步95℃變性30s，第三步采用各型別引物退火溫度復(fù)性40s，第四步72℃引物延伸45s，第二步至第四步重復(fù)35個循環(huán)，第五步72℃延伸10min。取5ul PCR產(chǎn)物與1ul溴酚藍混勻后上樣，于3％瓊脂糖凝膠80V電泳40分鐘，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察條帶位置可明確HPV型別。選取的人類免疫相關(guān)通路的核心基因，包括了IL17A、IL23R、IL12R、TLR1、TLR3、TLR9。這些基因的潛在功能性多態(tài)位點篩選方法如下：使用NCBI dbSNPs數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp,build 127)進行多態(tài)性位點的篩選，選點原則包括：(1)位于潛在功能性區(qū)域，即基因編碼區(qū)、5’側(cè)翼區(qū)(即轉(zhuǎn)錄起始位點上游2kb以內(nèi)的區(qū)域)、5’非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTRs)、3’UTR；(2)在中國人群中的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)≥0.05；(3)如果多個位點間存在高連鎖不平衡(Linkage disequil ibrium，LD)(r2≥0.80)，僅選擇其中一個位點作為代表。最終8個位點符合篩選條件，結(jié)合文獻報道的HLA-DP/DQ上4個重要位點，共納入并檢測12個位點，基本信息見表2。使用Primer Express引物設(shè)計軟件(http://www.appl iedbiosystems.com)定制設(shè)計的引物和探針，詳細序列見表3。使用ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀進行基因分型。每塊384孔反應(yīng)平板中5ul反應(yīng)體系，含有MasterMix 2ul，正、反向引物各0.25ul，TaqMan探針各0.125ul，DNA樣本0.5ul，雙蒸水1.25ul。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃2min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)次數(shù)為45次。擴增循環(huán)結(jié)束后，讀取擴增后熒光信號，運用SDS2.0軟件進行基因型判讀。

表1四種高危型別HPV(HPV-16、18、52和58型)檢測擴增引物序列

表2候選基因及其多態(tài)性位點的基本信息

*最小等位基因頻率(中國漢族人群)，來源于NCBI SNP數(shù)據(jù)庫

表3 Taqman基因分型引物與探針序列

所述基因分型的引物和探針序列如下：

IL17A rs2275913

SEQ ID NO：1

引物F:GGGGTGACACCATTTTGGTTA

R:ATGAATTTCTGCCCTTCCCA

SEQ ID NO：2

探針FAM-AGAATCTCTCCTTCTGAA-MGB

HEX-AGAATCTCTTCTTCTGAAG-MGB

IL23R rs1884444

SEQ ID NO：3

引物F:CCTAATCAAAGGTTCCCATCA

R:ACCATACCTCCATGACACCAG

SEQ ID NO：4

探針FAM-CATGAATCAGGTCACTA-MGB

HEX-CATGAATCATGTCACTAT-MGB

IL23R rs6682925

SEQ ID NO：5

引物F:AATGAAATCAGCACCATGAGAG

R:TTATGGCTGCATAATATTCCTGTA

SEQ ID NO：6

探針FAM-TATTCCACTAATAGGCACTT-MGB

HEX-ATTCCACTGATAGGCA-MGB

IL12R rs11209046

SEQ ID NO：7

引物F:TGCGGCCCAGAGCAC

F:CCCCGACCCCGAGTCA

SEQ ID NO：8

探針FAM-CACTCACCGCGTGTCG-MGB

HEX-CACTCACCACGTGTCG-MGB

IL12R rs1874396

SEQ ID NO：9

引物F:TGAGACCAGTCATGACCACCTT

R:AAAACAAATCAACCTAGTTCTATAGATGAAGACA

SEQ ID NO：10

探針FAM-CTTTTACCTTGGTGTTTAC-MGB

HEX-CCTTTTACATTGGTGTTTAC-MGB

TLR1rs5743551

SEQ ID NO：11

引物F:AGTAGTGGGGATGAGTCTGTGGG

R:TTGTGAATCCAGGCTGAGGG

SEQ ID NO：12

探針FAM-TGCTGAGAAGCTTC-MGB

HEX-TGCTGAGGAGCTTC-MGB

TLR3rs3775291

SEQ ID NO：13

引物F:ATTTGTATCACTTGCTCATTCTCCC

R:CCCAACCAAGAGAAAGCATCA

SEQ ID NO：14

探針FAM-TACACATACTCAACCTAAC-MGB

HEX-TACACATATTCAACCTAAC-MGB

TLR9rs187084

SEQ ID NO：15

引物F:GGGTGTACATAATTCAGCAGATATCAA

R:TCATGGTTTATTGTATATCGTCTTATTCC

SEQ ID NO：16

探針FAM-CTGCCCTTAAGAAG-MGB

HEX-TGCCCTCAAGAAG-MGB

HLA-DP rs3077

SEQ ID NO：17

引物F:TCAGCTTTTCTTCTCACTTCATGTG

R:GAGCTTGAAGGGTCAGCAATTC

SEQ ID NO：18

探針FAM-AAACTACCCCAGTGGC-MGB

HEX-AAACTACTCCAGTGGCT-MGB

HLA-DP rs9277535

SEQ ID NO：19

引物F:AATGGTGAGCAGACTGCAAATCT

R:TGGTAATGATAAAACATGCTCTCAGTAA

SEQ ID NO：20

探針FAM-ATAGGACCCGTATTC-MGB

HEX-ATAGGACCCATATTC-MGB

HLA-DQ rs2856718

SEQ ID NO：21

引物F:GAGCTCCCTCTGGCAGGTT

R:TATGCTTTCACCAACTTCCTTCAC

SEQ ID NO：22

探針FAM-AGAGCTGTTTAATCC-MGB

HEX-AGAGCTGTCTAATCC-MGB

HLA-DQ rs7453920

SEQ ID NO：23

引物F:TTTAGGGAGGTAAGAGGGAAAGC

R:CGAGAACGCCCTGATCTAAGA

SEQ ID NO：24

探針FAM-ACCGATTCGACATTG-MGB

HEX-ACCGATTCAACATTG-MGB。

下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。

本發(fā)明采用流行病學(xué)的病例-對照研究設(shè)計，病例為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院(CIHCAMS)確診的新發(fā)宮頸癌患者，對照來源于同期參加CIHCAMS宮頸癌篩查項目進行婦科檢查的人群，收集研究對象的宮頸脫落細胞標(biāo)本，應(yīng)用HPV型別特異性引物檢測中國人群中最常見的4種HPV亞型的感染情況，選取宿主免疫炎癥基因的12個潛在功能性位點，應(yīng)用TaqMan基因分型技術(shù)進行基因型檢測。如圖2所示，曲線下面積越大，表明診斷價值越高；首次發(fā)現(xiàn)HPV-16與宿主遺傳因素的聯(lián)合效應(yīng)顯著增加了宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險，與攜帶rs3077GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，攜帶GA/AA基因型且感染HPV-16的女性發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險增加了3.11倍(OR＝4.11,95％CI＝2.62-6.49)；與攜帶rs3775291GG基因型的其他高危型HPV感染者相比，攜帶GA/AA基因型且感染HPV-16的女性發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險增加了2.64倍(OR＝3.64,95％CI＝2.30-5.75)。因此，聯(lián)合HPV型別和宿主遺傳因素可有效預(yù)測宮頸癌發(fā)病風(fēng)險，綜合指標(biāo)的靈敏度和特異度優(yōu)于單獨檢測HPV。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。