本發(fā)明涉及一套用于病毒快速檢測的引物組、試劑盒及使用方法，尤其涉及一套用于檢測2015年5月以來在中、南美洲爆發(fā)流行寨卡病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、試劑盒及其使用方法，屬于寨卡病毒檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1947年，烏干達(dá)恩德培市黃熱病研究所的科學(xué)家利用市郊Zika叢林中的恒河猴研究黃熱病時(shí)分離到一種新病毒，將其命名為寨卡病毒(Zika virus)，簡稱ZIKV。1948年在該叢林非洲伊蚊體內(nèi)也分離出同樣病毒。據(jù)記載，人類最早的感染病例見于1952年的尼日利亞和坦桑尼亞。此后，多個(gè)國家有散發(fā)病例報(bào)道，但主要在全球熱帶及亞熱帶地區(qū)流行；2007年，首次在密克羅尼西亞的雅普島發(fā)生ZIKV疫情的暴發(fā)流行，2013年10月，法屬波利尼西亞也發(fā)生大規(guī)模ZIKV暴發(fā)，約有29000人為疑似病例(約占總?cè)丝?0％)。

2015年5月，巴西發(fā)現(xiàn)了首例本地感染病例，其后疫情持續(xù)發(fā)酵，直到發(fā)生了大規(guī)模疫情，截至2016年1月已有150萬人感染ZIKV。此外，巴西衛(wèi)生部于2016年1月12日還通報(bào)了356例可能與ZIKV感染相關(guān)的小頭畸形病例；目前，非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)均有寨卡病毒病疫情暴發(fā)，ZIKV進(jìn)一步呈現(xiàn)蔓延擴(kuò)大和跨境傳播趨勢，引起了全球的廣泛關(guān)注。2016年2月1日世衛(wèi)組織宣布寨卡病毒正在美洲地區(qū)“爆炸性傳播”，巴西密集出現(xiàn)的新生兒小頭畸形和其他神經(jīng)系統(tǒng)病變構(gòu)成“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。美國疾病預(yù)防控制中心2016年2月8日宣布把針對(duì)寨卡病毒的警戒水平提升至最高級(jí)別，這是繼2009年甲型H1N1流感和2015年埃博拉疫情后，美國再次發(fā)布最高級(jí)別的疫情警報(bào)。

截至2016年3月10日，我國內(nèi)地共報(bào)告輸入性顯性感染寨卡病毒病確診病例13例，其中廣東8例，浙江4例，江西1例；輸入國家為委內(nèi)瑞拉9例，薩摩亞3例，蘇里南1例；入境口岸分別為廣州7例，深圳5例，上海1例。目前尚無本地感染病例報(bào)告，但不同省份在不同時(shí)期都極有可能面臨著寨卡病毒輸入和本地傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

ZIKV是一種蚊媒病毒，屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，全基因長度約為11Kb，直徑40～70nm，有包膜，包含10794個(gè)核苷酸，編碼3419個(gè)氨基酸，ZIKV基因編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和包膜蛋白(E)]和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。根據(jù)基因型分為非洲型和亞洲型，本次美洲流行的為亞洲型。人體因受攜帶病毒的雌蚊叮咬感染寨卡病毒。人類是宿主，蚊子是傳播媒介。母嬰傳播與實(shí)驗(yàn)室污染也有報(bào)道，目前還懷疑寨卡病毒能通過性傳播與輸血傳播。

在大多數(shù)情況下，寨卡病毒病是一種相對(duì)輕微的疾病，僅有五分之一的患者出現(xiàn)癥狀。最常見的癥狀為輕微發(fā)熱、乏力、皮疹、關(guān)節(jié)肌肉痛和結(jié)膜炎。其他癥狀還包括頭痛、乏力、頭暈、四肢水腫、眼眶痛、厭食、畏光、胃腸不適、咽痛、咳嗽、阿佛它潰瘍、背痛，盜汗、淋巴結(jié)腫大。成人感染寨卡病毒可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，主要為格林-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome)，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性上升性對(duì)稱性麻痹、四肢軟癱、不同程度的感覺障礙，以及腦膜炎、腦膜腦炎、脊髓炎等其他神經(jīng)系統(tǒng)病變。孕婦感染寨卡病毒與胎兒宮內(nèi)生長受限有關(guān)，病毒通過母嬰傳播可導(dǎo)致胎兒腦部發(fā)育異常，可能導(dǎo)致流產(chǎn)或小頭畸形。

目前，寨卡病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括PCR檢測病毒RNA，以及檢測血清中的寨卡病毒抗體(IgM)等。然而，寨卡病毒的IgM也可能與登革熱、黃熱病、乙腦、西尼羅病毒發(fā)生相關(guān)交叉反應(yīng)，而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)對(duì)溫度具有一定的依賴性，要求精密控溫系統(tǒng)，檢測時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)成本高。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有簡便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，該方法得到不斷完善，尤其在結(jié)果判定方面，已有多種肉眼可視的方法及實(shí)時(shí)熒光檢測法得到廣泛應(yīng)用，可從源頭上控制住由電泳開蓋造成的氣溶膠污染，尤其適合于現(xiàn)場快速檢測以及床旁檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一套用于寨卡病毒快速診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由寨卡病毒E基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組構(gòu)成，可用于檢測2015年5月以來在中、南美洲爆發(fā)流行的寨卡病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。

所述寨卡病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組是通過大量比對(duì)Genbank中下載的不同亞型寨卡病毒E基因的核酸序列，針對(duì)N-糖基化位點(diǎn)附近保守區(qū)片段所設(shè)計(jì)。其中，E基因引物組包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，引物組的內(nèi)引物與外引物按6∶1-12∶1的比例配制成，優(yōu)選比例為8∶1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1∶2。

所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液，可以是使擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)出熒光信號(hào)的一種商品化試劑盒Isothermal Master Mix或者等效的其他試劑盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜堿、MgSO₄和緩沖溶液組成。試劑盒中還同時(shí)引入一組陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，其中陽性質(zhì)控品，是由涵蓋E基因引物擴(kuò)增區(qū)域人工合成片段構(gòu)建的質(zhì)粒，陰性質(zhì)控品是不含各引物組的介質(zhì)溶液。

所述寨卡病毒E基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25μL，其中包括E基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液6μL，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液14μL，待測試樣或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品各5μL：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。

所述的寨卡病毒E基因檢測試劑盒，實(shí)時(shí)熒光檢測法中每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)最大值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間與質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值之間，在1拷貝數(shù)-10⁷拷貝數(shù)范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，R²＞0.990，可根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行待測樣本核酸拷貝數(shù)的測定；該方法的檢出限可達(dá)到單拷貝/反應(yīng)。

擴(kuò)增結(jié)果的分析和判定方法包括：

1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)測得的擴(kuò)增曲線平臺(tái)熒光值高于本底噪音信號(hào)5倍且溶解曲線為單一尖銳峰的判定為陽性結(jié)果，擴(kuò)增曲線平臺(tái)熒光值低于本底噪音信號(hào)5倍的判定為陰性結(jié)果，擴(kuò)增曲線平臺(tái)熒光值高于本底噪音信號(hào)5倍但溶解曲線不是單一尖銳峰的判定為非特異性的交叉干擾信號(hào)。

2)陽性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陽性結(jié)果，陰性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果的視為有效試驗(yàn)，否則試驗(yàn)無效，重新進(jìn)行。

3)待測試樣為陰性結(jié)果，則未檢測到寨卡病毒；待測試樣為陽性結(jié)果，則有寨卡病毒感染。其中E基因的擴(kuò)增曲線以30min時(shí)的讀數(shù)為基準(zhǔn)。

一種用于寨卡病毒診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的使用方法，還包括熒光信號(hào)達(dá)到最大值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間(Peak time)與模板初始拷貝數(shù)的量化關(guān)系分析。其方法為，分別配制濃度分別為10⁷拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁶拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁵拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)、10³拷貝數(shù)/反應(yīng)、10²拷貝數(shù)/反應(yīng)、10拷貝數(shù)/反應(yīng)、1拷貝數(shù)/反應(yīng)的E基因陽性質(zhì)控品水溶液系列，用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)分別測定陽性質(zhì)控品水溶液系列，以反應(yīng)Peak time為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值(Log(Copies/reaction))為橫坐標(biāo)，建立關(guān)系曲線。利用該曲線，通過測定未知樣品Peak time，即可測得待測樣品內(nèi)核酸的初始拷貝數(shù)。

附圖說明

圖1實(shí)時(shí)熒光檢測法E基因引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖中，1的模板為寨卡病毒E基因陽性質(zhì)控品質(zhì)粒，2的模板為寨卡病毒陽性臨床樣本cDNA，3的模板為黃熱病陽性臨床樣本cDNA，4的模板為甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1pdm09)cDNA，5的模板為甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)cDNA，6的模板為甲型流感病毒A/環(huán)境/江西/21/2011(H9N2)cDNA，7的模板為乙型流感病毒B/重慶渝中/1361/2013(Yamagata)cDNA。

圖2實(shí)時(shí)熒光檢測法E基因引物特異性實(shí)驗(yàn)之溶解曲線。

圖中，1-7說明同圖1。

圖3實(shí)時(shí)熒光檢測法E基因引物靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖中，7為配制濃度10⁷拷貝數(shù)/反應(yīng)、6為配制濃度10⁶拷貝數(shù)/反應(yīng)、5為配制濃度10⁵拷貝數(shù)/反應(yīng)、4為配制濃度10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)、3為配制濃度10³拷貝數(shù)/反應(yīng)、2為配制濃度10²拷貝數(shù)/反應(yīng)、1為配制濃度10拷貝數(shù)/反應(yīng)、0為配制濃度1拷貝數(shù)/反應(yīng)的E基因陽性質(zhì)控品水溶液系列。

圖4實(shí)時(shí)熒光檢測法E基因引物靈敏度實(shí)驗(yàn)之溶解曲線。

圖中，7-0說明同圖3。

圖5熒光信號(hào)達(dá)最大值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間(Peak time)與質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值(Log(Copies/reaction))間的關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方法

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法做進(jìn)一步詳細(xì)描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例

1.試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

寨卡病毒E基因人工合成片段，是參考Genbank上已發(fā)表的序列(KU312312.1)人工合成，片段連接到pCR II載體上，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，以30％甘油的菌液的形式儲(chǔ)存。

1.2引物設(shè)計(jì)

運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)寨卡病毒E基因進(jìn)行比對(duì)，選擇針對(duì)E基因N-糖基化位點(diǎn)附近保守區(qū)片段作為靶序列，運(yùn)用在線軟件PrimerExplorer V5(http：//primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)E基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。E基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由一對(duì)外引物(SEQ No.1、SEQ No.2)、一對(duì)內(nèi)引物(SEQ No.3、SEQ No.4)和一對(duì)環(huán)引物(SEQ No.5、SEQ No.6)組成，其引物序列為：

1.3重組質(zhì)粒的提取及驗(yàn)證

在3mL預(yù)先加入氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接入100uL的甘油菌液，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)8-10h，參照質(zhì)粒小提試劑盒的說明提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR鑒定，計(jì)算拷貝數(shù)，其余菌液加入30％甘油后放入-80℃保存。

1.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25μL，包括寨卡病毒E基因引物混合液6μL，反應(yīng)預(yù)混液14μL，反應(yīng)樣品5μL，陰性對(duì)照的試驗(yàn)中以DEPC水代替反應(yīng)樣品。加完樣品后，將反應(yīng)管置于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)中，設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min，系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的熒光信號(hào)，通過獲得的等溫?cái)U(kuò)增曲線和溶解曲線判斷試驗(yàn)結(jié)果。

1.5引物混合液的特異性試驗(yàn)

分別以寨卡病毒陽性臨床樣本cDNA、黃熱病陽性臨床樣本cDNA(以上樣品由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院饋贈(zèng))、甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1pdm09)cDNA、甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)cDNA、甲型流感病毒A/環(huán)境/江西/21/2011(H9N2)cDNA、乙型流感病毒B/重慶渝中/1361/2013(Yamagata)cDNA(以上樣品由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所饋贈(zèng))，用E基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物混合液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)檢測，同時(shí)以DEPC水代替模板作為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)引物混合液的特異性。

1.6Peak time與質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)的量化關(guān)系分析

將測定濃度的質(zhì)粒模板依次進(jìn)行10倍梯度稀釋(2x10⁶拷貝數(shù)/μL、2x10⁵拷貝數(shù)/μL、2x10⁴拷貝數(shù)/μL、2x10³拷貝數(shù)/μL、2x10²拷貝數(shù)/μL、2x10拷貝數(shù)/μL、2拷貝數(shù)/μL、0.2拷貝數(shù)/μL)，通過實(shí)時(shí)熒光檢測系統(tǒng)對(duì)各濃度質(zhì)控品(終濃度梯度為10⁷拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁶拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁵拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)、10³拷貝數(shù)/反應(yīng)、10²拷貝數(shù)/反應(yīng)、10拷貝數(shù)/反應(yīng)、1拷貝數(shù)/反應(yīng))分別進(jìn)行檢測。每個(gè)反應(yīng)的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Peak time之間的線性分析。

2.試驗(yàn)結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光檢測法引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別以寨卡病毒陽性臨床樣本cDNA、黃熱病陽性臨床樣本cDNA、甲型流感病毒A/上海普陀/1203/2013(H1N1pdm09)cDNA、甲型流感病毒A/杭州/1/2013(H7N9)cDNA、甲型流感病毒A/環(huán)境/江西/21/2011(H9N2)cDNA、乙型流感病毒B/重慶渝中/1361/2013(Yamagata)cDNA為模板，寨卡病毒E基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測的試驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示，只有陽性質(zhì)控品質(zhì)粒模板及寨卡病毒陽性臨床樣本cDNA出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，且溶解曲線為單一尖銳峰，說明寨卡病毒E基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物混合液的特異性良好。

2.2Peak time與E基因質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)的量化分析結(jié)果

將測定濃度的E基因陽性質(zhì)控品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋(反應(yīng)終濃度梯度為10⁷拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁶拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁵拷貝數(shù)/反應(yīng)、10⁴拷貝數(shù)/反應(yīng)、10³拷貝數(shù)/反應(yīng)、10²拷貝數(shù)/反應(yīng)、10拷貝數(shù)/反應(yīng)、1拷貝數(shù)/反應(yīng))，通過實(shí)時(shí)熒光檢測系統(tǒng)對(duì)上述各濃度質(zhì)控品分別進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。圖4為圖3各反應(yīng)的溶解曲線。圖5(橫坐標(biāo)顯示每個(gè)反應(yīng)內(nèi)質(zhì)粒模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為各反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到最大值的擴(kuò)增時(shí)間)為圖3的量化關(guān)系分析結(jié)果，在1拷貝數(shù)-10⁷拷貝數(shù)范圍內(nèi)寨卡病毒E基因線性方程為y＝-0.76488x+9.3042，R²＝0.9931。提示寨卡病毒E基因熒光信號(hào)達(dá)到最大值的擴(kuò)增時(shí)間隨反應(yīng)體系的模板含量增加而加快，線性關(guān)系良好，檢出限可以達(dá)到單拷貝。