本發(fā)明屬于種子科學與技術應用領域，涉及水稻強耐鹽高活力基因qSE3的分子標記及其應用。

背景技術：

水稻(Oryza sativa L.)是我國重要的糧食作物之一，屬淡水沼澤植物，對鹽較為敏感。由于長期灌溉和施肥不當導致土壤中鹽分積累，我國鹽堿稻作區(qū)面積約占水稻栽培總面積的20％。同時，我國現(xiàn)有沿海灘涂面積3,500多萬畝，每年還以一定的速度淤長。近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，農村勞動力日益短缺，直播、機插秧水稻輕簡栽培變得越來越普遍，水稻萌發(fā)期的鹽害顯得尤為突出；同時，水稻強耐鹽品種的培育對我國鹽堿灘涂地土壤的利用具有重要現(xiàn)實意義。

目前，多位學者利用不同RILs、DH、F_2:3等水稻作圖群體，已定位了多個貢獻率大于20％水稻鹽脅迫相關主效QTLs。迄今，僅有一個苗期主效QTL SKC1被成功克隆。但有關水稻種子萌發(fā)期耐鹽性基因克隆，以及鹽脅迫下種子萌發(fā)形成正常幼苗的分子機理還未見報道。高活力種子能夠形成高、壯、整齊一致的幼苗，確保作物產量與質量。通過圖位克隆法已成功克隆多個與種子萌發(fā)相關基因，如：qLTG3-1、Sdr4、OsVP1、OsGA20ox1、OsFbx352及GD1等，但水稻種子耐鹽萌發(fā)相關基因仍鮮有報道。因此，挖掘與利用水稻強耐鹽高活力基因，對水稻強耐鹽品種的培育具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供水稻種子萌發(fā)期強耐鹽性篩選的分子標記方法。通過檢測與水稻強耐鹽高活力基因位點連鎖的分子標記，可以快速篩選出優(yōu)異水稻品種，提高水稻種子萌發(fā)期耐鹽性篩選的可靠性、有效性；可以確定有無水稻耐鹽高活力基因導入到育種品系中，提高水稻耐鹽性狀的選擇效率、加快育種進程。

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明所述的水稻耐鹽高活力基因qSE3的分子標記，所述的分子標記選自jm3、jm6、jm31和jm32中的任意一種；所述的分子標記jm3上游引物為jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物為jm3R：SEQ ID NO.2，擴增產物大小為116bp；所述的分子標記jm6上游引物為jm6L：SEQ ID NO.3，下游引物為jm6R：SEQ ID NO.4，擴增產物大小為154bp；所述的分子標記jm31上游引物為jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物為jm31R：SEQ ID NO.6，擴增產物大小為233bp；所述的分子標記jm32上游引物為jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物為jm32R：SEQ ID NO.8，擴增產物大小為214bp。

本發(fā)明所述的水稻耐鹽高活力基因qSE3的分子標記引物，所述的分子標記jm3上游引物為jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物為jm3R：SEQ ID NO.2，擴增產物大小為116bp；所述的分子標記jm6上游引物為jm6L：SEQ ID NO.3，下游引物為jm6R：SEQ ID NO.4，擴增產物大小為154bp；所述的分子標記jm31上游引物為jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物為jm31R：SEQ ID NO.6，擴增產物大小為233bp；所述的分子標記jm32上游引物為jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物為jm32R：SEQ ID NO.8，擴增產物大小為214bp。

本發(fā)明所述的分子標記在水稻種子萌發(fā)期耐鹽性分子篩選中的應用。

本發(fā)明所述的分子標記引物在水稻種子萌發(fā)期耐鹽性分子篩選中的應用。

水稻種子萌發(fā)期耐鹽性分子篩選方法，步驟如下：

(1)取水稻葉片，提取基因組DNA。

(2)利用表1中的任意1對或1對以上分子標記引物對所述的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物在8％非變性聚丙烯酰胺膠上進行電泳檢測，如果擴增出對應大小的DNA片段，標志著qSE3增效等位基因存在。

表1

其中，所述的PCR反應體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂1.5微升，4pmol/微升引物對2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應程序為DNA 95℃預變性5min；95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。

利用分子標記jm3的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者韭菜青與秈稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴增出116bp的擴增片段，則標志著qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否則擴增出105bp，則表明增效等位基因沒有導入。在3368個BC₅F₃分離群體中，用交換配子數(shù)計算，此標記與耐鹽高活力基因qSE3共分離的，單標記選擇效率達99.9％。

利用分子標記jm6的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者韭菜青與秈稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴增出154bp的擴增片段，則標志著qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否則擴增出141bp，則表明增效等位基因沒有導入。在3368個BC₅F₃分離群體中，用交換配子數(shù)計算，此標記與耐鹽高活力基因qSE3共分離的，單標記選擇效率達100％。

利用分子標記jm31的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者韭菜青與秈稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴增出233bp的擴增片段，則標志著qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否則擴增出195bp，則表明增效等位基因沒有導入。在3368個BC₅F₃分離群體中，用交換配子數(shù)計算，此標記與耐鹽高活力基因qSE3共分離的，單標記選擇效率達100％

利用分子標記jm32的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者韭菜青與秈稻雜交后代的基因組DNA，如果能夠擴增出214bp的擴增片段，則標志著qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否則擴增出203bp，則表明增效等位基因沒有導入。在3368個BC₅F₃分離群體中，用交換配子數(shù)計算，此標記與耐鹽高活力基因qSE3共分離的，單標記選擇效率達99.8％。

上述4個分子標記對qSE3的選擇效率在99％以上，其中SSR標記jm6、jm31與qSE3共分離，選擇準確率高，達100％。上述4個標記可以擇一使用，也可以任意選擇2對或2個以上標記聯(lián)合使用。4個標記中任意2個分子標記組合選擇，選擇效率也達到100％。

本發(fā)明所提供的水稻種子萌發(fā)期耐鹽性篩選的分子標記方法，具有以下優(yōu)點：

(1)通過本發(fā)明開發(fā)的分子標記首次從湖流域粳稻品種韭菜青中定位了位于3號染色體長臂上的耐鹽高活力基因qSE3，并獲得了共分離或高度緊密連鎖的分子標記jm3、jm6、jm31和jm32。

(2)通過本發(fā)明分子標記定位的水稻耐鹽高活力基因qSE3的位置明確、精細，鑒定方法快速簡便，選擇效率高。只需要檢測這些標記的擴增條帶特征，就可以判斷強耐鹽高活力基因qSE3是否存在，以此預測水稻種子萌發(fā)期的耐鹽水平，可以快速、有目的性的篩選耐鹽性強的品種或品系，用于改良水稻耐鹽性。這些標記與強耐鹽基因qSE3共分離或高度緊密連鎖，單標記選擇效率達99％-100％，任意雙標記選擇率達100％。

(3)分子輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本，不受環(huán)境影響。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集耐鹽親本與骨干親本進行一系列雜交，回交，而且要等到收獲種子破除休眠后，對后代進行耐鹽表型鑒定從而選擇單株。傳統(tǒng)育種方法受環(huán)境影響大，可靠性低。通過本發(fā)明與耐鹽高活力基因qSE3共分離和緊密連鎖的分子標記方法，可預測水稻萌發(fā)期耐鹽性水平，可以在種子萌發(fā)期就鑒定出耐鹽單株，淘汰其它植株，可以有效控制育種規(guī)模，提高育種效率，能快速篩選出水稻種子萌發(fā)期強耐鹽性品種；同時，在水稻耐鹽育種群體構建時，可以快速鑒定具有耐鹽高活力基因qSE3單株，大大提高選擇效率，縮短育種年限，為水稻耐鹽品種改良和育種服務。

附圖說明

圖1：兩親本韭菜青、IR26及NIL在高鹽濃度脅迫下表型圖

圖2：qSE3在3號染色體上初定位圖

圖3：qSE3在3號染色體上精細定位圖

圖4：新開發(fā)的與qSE3緊密連鎖的分子標記多態(tài)性電泳條帶

具體實施方式

實施例1

(一)材料與方法：

1.材料：以強耐鹽品種韭菜青為供體，鹽敏感秈稻IR26為受體，通過回交和自交獲取分離BC₂F₂分離群體，完成初定位；進一步構建高世代回交分離群體BC₅F₂，篩選交換株，再讓交換株進行自交產生BC₅F₃群體，使其雜合片段變?yōu)榧兒?，結合表型進行精細定位，確定與qSE3連鎖分子標記。

2.用CTAB法提取個體DNA。

3.多態(tài)標記篩選：選擇1000對SSR引物，以韭菜青與IR26為模板，進行PCR擴增，篩選多態(tài)性標記。

4.PCR反應體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物對2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應程序為DNA 95℃預變性5min；95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。在biometre擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯酰胺膠(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉雙丙烯酰胺)上進行電泳分離。在1000對SSR引物中獲得161對引物擴增產物在親本間存在多態(tài)，用于連鎖圖譜構建和QTL檢測。

5.種子萌發(fā)期強耐鹽性QTL初位點：利用BC₂F₂分離群體種植于江浦，取樣并收獲成熟的種子，去雜，42℃烘干破除休眠，再保存于-20℃冰箱，以備長期使用；同時，使用上述篩選的標記與BC₂F₂分離群體構建水稻遺傳圖譜，鑒定每個株系在種子萌發(fā)期的耐鹽性，結合軟件分析進行水稻種子萌發(fā)期耐鹽性QTL初步位點。

6.軟件運算：所用軟件為QTL IciMapping Version 4.0，最小LOD值設為2.5，步伐為1，獲取連鎖圖譜，并進行QTL定位分析(圖2)。

7.連鎖標記驗證與區(qū)間確定：對交換株BC₅F₃每個單株的后代進行耐鹽性狀鑒定，結合交換株基因型，驗證連鎖的分子標記，從而有效確定縮小定位區(qū)間。

(二)結果與分析

利用回交分離群體BC₂F₂的188個單株全部種植于江浦，取樣，提取DNA，利用161個具有多態(tài)性標記構建遺傳圖譜；同時，收獲成熟的種子，去雜，42℃烘干破除休眠，進行種子萌發(fā)期的耐鹽性鑒定；結合表型和遺傳圖譜，利用軟件分析在3號染色體定位一個耐鹽高活力QTL qSE3，位于RM6832與RM135標記之間。

對BC₅F₂分離群體3368株分離個體表型鑒定與標記分析，在分子標記RM15456和jm3間獲得14個交換株。通過目的區(qū)間純合交換株后代種子萌發(fā)期耐鹽性表型鑒定，結合其交換位點，將qSE3位點區(qū)間縮小在jm3與jm32標記之間(圖3)。標記jm6和jm31與qSE3共分離，沒有交換株，說明單標記對qSE3的選擇效率達100％；標記jm3和jm32與qSE3交換率在1％以下，單標記對qSE3的選擇效率達99％以上。

通過檢測與水稻耐鹽高活力基因qSE3連鎖的分子標記，可以預測水稻種子萌發(fā)期耐鹽性水平，可以確定有無耐鹽高活力基因導入育種品系中，提高水稻耐鹽性育種選擇效率，加快育種進度。利用與qSE3共分離或緊密連鎖的jm3、jm6、jm31和jm32進行單標記選擇，選擇效率可達到99％-100％，任何雙標記組合選擇效率均達到100％，可用于分子標記輔助選擇育種。

實施例2

(一)材料與方法：

1.材料：水稻品種韭菜青與IR26。

2.用CTAB法提取個體DNA。

3.標記：jm3、jm6、jm31和jm32。

4.PCR反應體系：體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物對2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5單位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。反應程序為DNA 95℃預變性5min；95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。在biometre擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯酰胺膠(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉雙丙烯酰胺)上進行電泳分離。

(二)結果與分析

用SSR分子標記jm3的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者IR26的基因組DNA，韭菜青能夠擴增出116bp的擴增片段，標志著韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26擴增出105bp，表明IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子標記jm6的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者IR26的基因組DNA，韭菜青能夠擴增出154bp的擴增片段，標志著韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26擴增出141bp，標志著IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子標記jm31的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者IR26的基因組DNA，韭菜青能夠擴增出233bp的擴增片段，則標志著韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26擴增出195bp，標志著IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子標記jm32的上下游引物擴增水稻品種韭菜青或者IR26的基因組DNA，韭菜青能夠擴增出214bp的擴增片段，標志著韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26擴增出203bp，標志著IR26中不存在qSE3增效等位基因(圖4，圖中每種分子標記引物對應兩條泳道，左邊的泳道對應韭菜青，左邊的泳道對應水稻品種IR26)。