本發(fā)明涉及分子生物學及臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種β-連環(huán)蛋白互作蛋白1(CTNNBIP1)基因突變檢測的試劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用。如果這條信號通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變或者異常表達，導(dǎo)致信號異?；罨?，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。Wnt信號通路包括經(jīng)典的Wnt信號通路與非經(jīng)典的Wnt信號通路，在經(jīng)典通路即Wnt-β-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的Frizzle/LRP5/6協(xié)同受體后抑制細胞內(nèi)游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細胞質(zhì)中的β-catenin蛋白水平升高后將發(fā)生β-catenin蛋白的核移位，導(dǎo)致細胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯(lián)合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉(zhuǎn)錄因子家族形成復(fù)合體并激活Wnt信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。

CTNNBIP1在腫瘤細胞核中主要通過與β-catenin發(fā)生相互作用，進而導(dǎo)致β-catenin與TCF/LEF相互作用受到抑制，進一步影響Wnt信號通路的活性，在Wnt信號通路中發(fā)揮著重要的作用。目前越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤中CTNNBIP1蛋白均呈現(xiàn)不同程度的突變。

目前研究核心信號通路的核心分子調(diào)控機制，以及某些重要成員在細胞中的表達水平，已經(jīng)成為治療腫瘤的一種關(guān)鍵手段。近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，以及CTNNBIP1蛋白作為調(diào)控Wnt信號通路活性因子，其突變水平的研究，已經(jīng)成為研究開發(fā)腫瘤藥物急需解決的重要問題。尤其是在CTNNBIP1蛋白ICAT結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的突變，對CTNNBIP1蛋白發(fā)揮功能啟動非常重要的作用。例如在結(jié)直腸腺癌中檢測出G8R突變，胃腺癌中檢測出V68A突變等。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計算機設(shè)計構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶基因結(jié)合時因電荷相互排斥所導(dǎo)致的雜交不穩(wěn)定性，結(jié)合不易受雜交液離子強度的影響，從而顯示出極強的雜交優(yōu)勢，大大提高了檢測靈敏度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中如何確定Wnt信號通路中的核心調(diào)節(jié)分子CTNNBIP1基因突變情況，以及如何解釋核心分子CTNNBIP1在腫瘤細胞中的突變水平變化的困難，提供了一種檢測Wnt信號通路中CTNNBIP1基因突變檢測試劑及應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是提供一種用于CTNNBIP1基因突變檢測的試劑，包括用于阻斷野生型CTNNBIP1基因擴增的野生型PNA序列、用于特異性擴增G8R、V68A突變型CTNNBIP1基因序列的一組引物對及突變型PNA熒光探針：

所述檢測CTNNBIP1基因G8R或V68A突變正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；

所述檢測CTNNBIP1基因G8R或V68A突變反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；

所述檢測CTNNBIP1基因G8R突變PNA熒光探針如序列表中SEQ ID NO.3；

所述檢測CTNNBIP1基因V68A突變PNA熒光探針如序列表中SEQ ID NO.4；

所述特異性結(jié)合包含CTNNBIP1基因8密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.5；

所述特異性結(jié)合包含CTNNBIP1基因68密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.6；

所述PNA熒光探針的5'端的熒光報告基團為：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，3'端的淬滅基團為：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

本發(fā)明所述的檢測試劑還包括PCR反應(yīng)液、含8密碼子和68密碼子突變型參考品、含8密碼子和68密碼子野生型參考品，其中PCR反應(yīng)液包括：DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo(dT)和含Mg離子的溶液。

所述含8、68密碼子突變型參考品為含SEQ NO.7的重組質(zhì)粒DNA；

所述含8、68密碼子野生型參考品為含SEQ NO.8的重組質(zhì)粒DNA；

所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶為Taq酶；

所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴增反應(yīng)體系中的終濃度為：Taq酶0.01U/μL～0.05U/μL，dNTPs 0.2～0.6mM，10×PCR Buffer 1×，RNASIN 40U/μL～60U/μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U/μL～320U/μL，MgCl₂ 1.5～5.0mM，溶劑為DEPC水。

具體地，所述正向引物的終濃度為0.05～0.9μM，所述反向引物的終濃度為0.05～0.9μM，所述oligo(dT)終濃度為0.05～0.9μM，所述互補PNA序列終濃度為0.05～0.9μM，所述熒光探針的終濃度為0.05～0.9μM。

本發(fā)明所述的試劑進行實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：42℃逆轉(zhuǎn)錄20min；94℃預(yù)變性，2min；95℃變性，30s，58℃，45s(收集熒光)，進行40個循環(huán)。

本發(fā)明的原理是通過構(gòu)建與CTNNBIP1基因野生型互補的一段肽核酸PNA序列，當肽核酸PNA序列與CTNNBIP1基因互補結(jié)合時，任一突變均可導(dǎo)致PNA/DNA產(chǎn)生錯配，從而使得溶解溫度發(fā)生改變。進而根據(jù)CTNNBIP1基因突變型設(shè)計特異性的肽核酸PNA探針以及引物對CTNNBIP1突變型基因進行熒光定量PCR擴增，經(jīng)過一輪的PCR擴增后，即可將CTNNBIP1基因突變型與野生型進行區(qū)分開來。

進一步地，本發(fā)明還提供了所述的試劑在制備檢測癌細胞的檢測試劑中的應(yīng)用，所述癌細胞為結(jié)直腸腺癌、胃腺癌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：CTNNBIP1基因是Wnt信號通路中β-catenin蛋白上游發(fā)揮著重要功能的基因，本發(fā)明提供了直接檢測Wnt信號通路中CTNNBIP1基因突變檢測的試劑，借助于所述檢測試劑能夠通過實時熒光定量PCR法在轉(zhuǎn)錄水平快速檢測出CTNNBIP1基因的突變，而與普通實時熒光定量PCR不同的是，本發(fā)明設(shè)計野生型PNA序列，可有效抑制野生型基因組擴增，只富集突變型基因擴增，大大提高了檢測特異性，我們使用的突變型PNA熒光探針更加靈敏，本發(fā)明為抗癌藥物的篩選，新靶向藥物的機制研究都提供了非常有力的工具。

同時本發(fā)明的實驗體系可以在任何一臺實時熒光定量PCR儀器上進行，上述引物置于八聯(lián)管中，進行實時熒光定量PCR檢測，實驗操作簡單，費用低廉，結(jié)果重復(fù)性，敏感性好，是研究腫瘤相關(guān)藥物作用機理及基礎(chǔ)科學研究的一種重要手段。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中所述肽核酸質(zhì)譜圖；

圖2是樣品、G8R突變型和野生型參考品PCR擴增圖；

圖3是樣品、V68A突變型和野生型參考品PCR擴增圖；

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

本發(fā)明通過結(jié)直腸腺癌細胞進行舉例說明，但是本發(fā)明不局限于結(jié)直腸腺癌細胞，本發(fā)明所述檢測試劑還可以應(yīng)用于胃腺癌。

實施例中的有關(guān)DNA和RNA基本操作均參考《分子克隆：實驗室操作指南》(金冬雁等譯，科學出版社，北京(1998))和《精編分子生物學指南》(顏子譯，科學出版社，北京(1998))。

本發(fā)明中SW480(人結(jié)直腸腺癌細胞系)購自美國ATCC，培養(yǎng)細胞所使用的RPMI-1640培養(yǎng)基及10％胎牛血清均購自英俊公司，其他試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司。

【實施例1】引物探針設(shè)計

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)報道的CTNNBIP1mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_001012329.1)，使用Applied Biosystems公司開發(fā)的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設(shè)計特異的CTNNBIP1引物與探針。

CTNNBIP1G8R：

CTNNBIP1-F:5'-ATGAACCGCGAGGGAGC-3'；(SEQ NO.1)

CTNNBIP1-R:5'-CTACTGCCTCCGGTCTTCCG-3'；(SEQ NO.2)

突變型CTNNBIP1(PNA)-P:5'FAM-CCCCGGAAGAGTCCGGAG-BHQ3'；(SEQ NO.3)

野生型CTNNBIP1-PNA：5'-CTCCGGACTCTTCCCGGG-3'；(SEQ NO.5)

靶序列：

ATGAACCGCGAGGGAGCTCCCGGGAAGAGTCCGGAGGAGATGTACATTCAGCAGAAGGTCCGAGTGCTGCTCATGCTGCGGAAGATGGGATCAAACCTGACAGCCAGCGAGGAGGAGTTCCTGCGCACCTATGCAGGGGTGGTCAACAGCCAGCTCAGCCAGCTGCCTCCGCACTCCATCGACCAGGGTGCAGAGGACGTGGTGATGGCGTTTTCCAGGTCGGAGACGGAAGACCGGAGGCAGTAG

CTNNBIP1V68A:

CTNNBIP1-F:5'–ATGAACCGCGAGGGAGC-3'；(SEQ NO.1)

CTNNBIP1-R:5'-CTACTGCCTCCGGTCTTCCG-3'；(SEQ NO.2)

CTNNBIP1(PNA)-P:5'FAM-GGACGCGGTGATGGCGTT-BHQ 3'；(SEQ NO.4)

CTNNBIP1-PNA：5'-AACGCCATCACCACGTCC-3'；(SEQ NO.6)

靶序列同上；

以上：F：forward，正向；CTNNBIP1-F表示用于檢測核酸的正向引物。

R：reverse，反向；CTNNBIP1-R表示用于檢測核酸的反向引物。

P：probe，熒光探針；CTNNBIP1-P表示用于檢測核酸的熒光探針，該熒光探針為TaqMan熒光探針。

在本發(fā)明實施例中，修飾熒光探針的5'端的熒光報告基團可以為：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；修飾熒光探針的3'端的淬滅基團可以為：TAMRA，Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL，該熒光報告基團與淬滅基團不影響熒光定量PCR的擴增，只需根據(jù)探針的熒光報告基團和淬滅基團選擇所用的儀器的型號設(shè)置可檢測的熒光信號范圍。本發(fā)明實施例提供的熒光探針熒光報告基團：FAM、HEX、TET和FAM的激發(fā)波長為470-650nm，接收波長為500-700nm；淬滅基團：Eclipse、TAMRA、BHQ1。引物合成后的純化方式可以為：HAP、PAGE和HPLC純化方式。

【實施例2】構(gòu)建含有CTNNBIP1基因突變型和野生型的DNA片段的重組質(zhì)粒一、人結(jié)直腸腺癌SW480細胞系培養(yǎng)與傳代

1)細胞培養(yǎng)

所有細胞系使用RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA)，10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)，于37℃、5％CO₂環(huán)境下培養(yǎng)。

2)細胞傳代

首先使用滅菌吸管將細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出，加入PBS緩沖液清洗2遍，往細胞中慢慢滴加適量胰蛋白酶，待細胞變圓，調(diào)整角度細胞能夠移動后加入3ml的含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)輕輕吹打后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)，根據(jù)培養(yǎng)皿中細胞的含量將適量的細胞傳代至其他滅菌的培養(yǎng)皿中，加入5ml的DMEM培養(yǎng)基后放入5％CO₂培養(yǎng)箱。

細胞計數(shù)公式(個/ml)：(4大格細胞總數(shù))×10⁴×稀釋倍數(shù)/4

二、總RNA的提取

1)倒掉培養(yǎng)基，PBS清洗后，直接將1ml Trizol注入培養(yǎng)瓶(其中細胞5×10⁶個/ml)，反復(fù)抽吸均勻；

2)在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿(為Trizol總體積的1/5)，振蕩混均30秒，室溫下靜置5分鐘；

3)12000rpm 4℃離心15分鐘，分相為三層。上層：RNA(約為Trizol的60％)；中間：DNA；下層:蛋白質(zhì)(酚-氯仿)；

4)小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一EP管中。1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積約為0.4～0.6ml。有機相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避免觸及；

5)上清液加入約0.5ml的異丙醇,振蕩混均30秒。室溫下靜置10分鐘；

6)12000rpm 4℃離心10分鐘；

7)RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA沉淀；

8)離心管加入1ml預(yù)冷的75％乙醇(1ml Trizol至少1ml乙醇清洗DNA),振蕩混均30秒，使沉淀振蕩起來，室溫12000rpm離心1～2分鐘。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復(fù)以上清洗步驟一次。在75％乙醇中，RNA在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年；

9)室溫選擇流動性小，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥(5～10分鐘)。用DEPC水15μL溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分鐘。

10)RNA純度檢測

滴加2μL RNA溶液于超微量分光光度計(型號：P330-311)，并讀取儀器中OD260/OD280比值。

三、構(gòu)建重組質(zhì)粒

1)將含有CTNNBIP1基因突變型和野生型的DNA片段進行PCR擴增；

含G8R、V68A密碼子突變型的DNA片段為SEQ NO.7所示的序列；

ATGAACCGCGAGGGAGCTCCCCGGAAGAGTCCGGAGGAGATGTACATTCAGCAGAAGGTCCGAGTGCTGCTCATGCTGCGGAAGATGGGATCAAACCTGACAGCCAGCGAGGAGGAGTTCCTGCGCACCTATGCAGGGGTGGTCAACAGCCAGCTCAGCCAGCTGCCTCCGCACTCCATCGACCAGGGTGCAGAGGACGTGGCGATGGCGTTTTCCAGGTCGGAGACGGAAGACCGGAGGCAGTAG；

(SEQ NO.7)

含8、68密碼子野生型的DNA片段為SEQ NO.8所示的序列；

ATGAACCGCGAGGGAGCTCCCGGGAAGAGTCCGGAGGAGATGTACATTCAGCAGAAGGTCCGAGTGCTGCTCATGCTGCGGAAGATGGGATCAAACCTGACAGCCAGCGAGGAGGAGTTCCTGCGCACCTATGCAGGGGTGGTCAACAGCCAGCTCAGCCAGCTGCCTCCGCACTCCATCGACCAGGGTGCAGAGGACGTGGTGATGGCGTTTTCCAGGTCGGAGACGGAAGACCGGAGGCAGTAG；

(SEQ NO.8)

2)將PCR產(chǎn)物進行雙酶切；

載體和PCR產(chǎn)物分別用一下條件進行雙酶切(反應(yīng)體系均為30μl，37℃，酶切2小時)；

3)將雙酶切產(chǎn)物電泳后割膠回收(按照試劑盒說明書進行操作)；

4)將酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒載體進行連接；

上述雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化(其中載體酶切產(chǎn)物割膠回收，PCR片段酶切后純化步驟與上述PCR產(chǎn)物純化步驟相同)，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。連接體系如下：載體，2μl；PCR片段，6μl；10xT4 buffer，1μl；T4 DNA ligase，1μl。

5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)；

取上述連接液5μl轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5α化學感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42℃熱激2min,置冰上5min，加入1mlLB培養(yǎng)液37℃搖床45min，離心5000rpm，1-5min(不要離心太久，以免太實)，最后均勻涂布在含有100ng/ml抗生素的LB平板上(100-150μl)。將平板在37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆菌落轉(zhuǎn)劃到另一塊含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并對之進行編號，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

6)QIAGEN試劑盒抽提質(zhì)粒(按照說明書進行)，制成參考品。

【實施例3】實時熒光定量PCR法擴增樣本

取提取的總RNA 1-5μg，加入PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液包括：無菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo(dT)和含Mg離子的溶液。其中，濃度為5U/μL的具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶0.3μL，濃度為10mmol/L的dNTPs 2μL，10×PCR Buffer 5μL，濃度為40U/μL的RNASIN 0.6μL，濃度為200U/μL的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.6μL，濃度為25mmol/L的MgCl₂溶液5μL，添加無菌水至體積為50μL。其中，具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶可以為Taq酶。

PCR擴增：將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，選擇要用的Taqman熒光探針(本產(chǎn)品熒光報告基團為FAM、HEX、TAT，熒光淬滅基團為Eclipse)，定義樣品孔，并按下表提供的擴增程序進行PCR擴增：

表1為PCR擴增反應(yīng)擴增程序

在擴增程序的第三步的終了讀取熒光值；

數(shù)據(jù)分析判斷：

同時選定所檢樣本與該樣本檢測位點對應(yīng)的突變型和野生型參考品孔，對比三孔PCR擴增曲線(CT_A表示樣本孔CT值，CT_W表示野生型CT值，CT_M表示突變型CT值)：

當CT_M≤CT_A＜CT_W時，表明該樣本存在突變；

當CT_W＝CT_A時，表明該樣本為野生型。

圖1是本發(fā)明實施例中所述肽核酸質(zhì)譜圖；

圖2是本發(fā)明實施例中所述G8R突變型和野生型參考品PCR擴增圖,圖中上、中、下三條線各表示CTNNBIP1第8位密碼子突變型參考品、樣本以及野生型參考品的擴增曲線；

圖3是本發(fā)明實施例中所述V68A突變型和野生型參考品PCR擴增圖,圖中上、中、下三條線各表示CTNNBIP1第68位密碼子突變型參考品、樣本以及野生型參考品的擴增曲線；

以上實施例僅用來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換，而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學

<120> 一種β-連環(huán)蛋白互作蛋白1基因突變檢測的試劑及應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> G8R或V68A突變正向引物

<400> 1

atgaaccgcg agggagc 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> G8R或V68A突變反向引物

<400> 2

ctactgcctc cggtcttccg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> G8R突變PNA熒光探針

<400> 3

ccccggaaga gtccggag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> V68A突變PNA熒光探針

<400> 4

ggacgcggtg atggcgtt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 8密碼子野生型PNA序列

<400> 5

ctccggactc ttcccggg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 68密碼子野生型PNA序列

<400> 6

aacgccatca ccacgtcc 18

<210> 7

<211> 246

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 8、68密碼子突變型參考品

<400> 7

atgaaccgcg agggagctcc ccggaagagt ccggaggaga tgtacattca gcagaaggtc 60

cgagtgctgc tcatgctgcg gaagatggga tcaaacctga cagccagcga ggaggagttc 120

ctgcgcacct atgcaggggt ggtcaacagc cagctcagcc agctgcctcc gcactccatc 180

gaccagggtg cagaggacgt ggcgatggcg ttttccaggt cggagacgga agaccggagg 240

cagtag 246

<210> 8

<211> 246

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 8、68密碼子野生型參考品

<400> 8

atgaaccgcg agggagctcc ccggaagagt ccggaggaga tgtacattca gcagaaggtc 60

cgagtgctgc tcatgctgcg gaagatggga tcaaacctga cagccagcga ggaggagttc 120

ctgcgcacct atgcaggggt ggtcaacagc cagctcagcc agctgcctcc gcactccatc 180

gaccagggtg cagaggacgt ggcgatggcg ttttccaggt cggagacgga agaccggagg 240

cagtag 246