本發(fā)明涉及體外核酸檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。
背景技術(shù)：
：載脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)是血漿中重要的載脂蛋白之一，其基因定位于第19對染色體長臂上，長37kb，其包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。ApoE有三種構(gòu)體(isoform)即ε2、ε3和ε4。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交換決定了異構(gòu)體的種類。ApoEε4在這兩個位置上都是Arg；ε2都是Cys；112位為Cys和158位是Arg者為ApoEε3異構(gòu)體，在自然人群中，基因頻率ε3分布最高，ApoEε3/3表型分布約70％。人群中可有六種不同的表型：三種純合子(ε2/2，ε3/3，ε4/4)和三種雜合子(ε2/3，ε2/4，ε3/4)。ApoE主要在肝臟合成、分泌和代謝。既能和存在于肝臟的ApoE受體結(jié)合，也能和遍及全身組織的載脂蛋白LDLR結(jié)合，所以可通過多種代謝途徑參與機體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，成為影響機體血脂水平的重要內(nèi)在因素。研究表明ApoE基因多態(tài)性可影響其與LDL受體的結(jié)合能力，突變型ε2的受體結(jié)合能力最低，進一步影響血脂代謝及其水平。同時，藥物基因組學(xué)證明，ApoE基因多態(tài)性與他汀類藥物的降脂療效密切相關(guān)，他汀類藥物對等位基因ε2攜帶者的降脂作用最強，而在ε4攜帶者中治療療效不佳。此外，有研究表明，ApoEε4等位基因與散發(fā)型阿爾茨海默病(AD)有關(guān)聯(lián)，ApoEε4可能是散發(fā)性AD發(fā)病的危險因素，并建議把ApoEε4等作為散發(fā)性AD的生物標記。再者，多項研究發(fā)現(xiàn)ApoE基因多態(tài)性還與高脂血癥、腦梗塞、冠心病和慢性乙型肝炎等疾病有著密切的關(guān)系。因此，研究和開發(fā)出高效、經(jīng)濟檢測ApoE基因多態(tài)性的方法或試劑盒對臨床醫(yī)學(xué)具有深遠的意義。目前從基因水平檢測ApoE多態(tài)性的方法大致有以下幾種，反向斑點雜交、基因芯片、Taqman-MGB雙探針法等方法。中國專利CN1786188A報道了用反向斑點雜交方法檢測ApoE基因型的方法，該法存在操作復(fù)雜，周期長，以及分析速度慢，容易發(fā)生PCR產(chǎn)物的污染出現(xiàn)假陽性等缺點。中國專利CN102010897A公開了一種用液相基因芯片檢測ApoE多態(tài)性的方法，芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴，同樣也存在操作復(fù)雜，周期長，以及分析速度慢，容易發(fā)生PCR產(chǎn)物的污染出現(xiàn)假陽性等缺點。中國專利CN101608229A公開了一種用Taqman-MGB雙探針熒光PCR的方法，檢測ApoE基因型，該法常常需要兩條探針，而TaqmanMGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，并且不能檢測樣本中的含量較少(≥1,000個中的1個)的等位基因或突變位點。因此，如何解決檢測ApoE基因多態(tài)性存在的問題，成為亟待解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述方法檢測ApoE基因分型過程中存在敏感性不高、檢測周期長、操作繁瑣及成本高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種敏感性高、特異性強、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗要求的定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。本發(fā)明提供了一種定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對，所述ApoE基因檢測的多態(tài)性位點為Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述引物對包括：(1)對于ApoECys112Arg等位基因，擴增引物為：ApoECys112Arg正向擴增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’(SEQIDNO.1)；ApoECys112Arg反向擴增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’(SEQIDNO.2)；ApoECys112Arg測序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’(SEQIDNO.3)；其中，所述ApoECys112Arg反向擴增引物的5’端進行生物素標記；(2)對于ApoEArg158Cys等位基因，擴增引物為：ApoEArg158Cys正向擴增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’(SEQIDNO.4)；ApoEArg158Cys反向擴增引物：5’-GGCCTGGTACACTGCCAG-3’(SEQIDNO.5)；ApoEArg158Cys測序引物：5’-GCCGATGACCTGCAGAAG-3’(SEQIDNO.6)；其中，所述ApoEArg158Cys反向擴增引物的5’端進行生物素標記。本發(fā)明還提供了一種定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序試劑盒，所述ApoE基因檢測的多態(tài)性位點為Cys112Arg和/或Arg158Cys，所述試劑盒包括：(1)對于ApoECys112Arg等位基因，PCR反應(yīng)液1，所述PCR反應(yīng)液1含有ApoECys112Arg正向擴增引物：5’-CCGGCTGGGCGCGGACAT-3’；ApoECys112Arg反向擴增引物：5’-TCGCCGCGGTACTGCACC-3’；ApoECys112Arg測序引物：5’-CGCGGACATGGAGGACGCG-3’；其中，所述ApoECys112Arg反向擴增引物的5’端進行生物素標記；(2)對于ApoEArg158Cys等位基因，PCR反應(yīng)液2，所述PCR反應(yīng)液2含有ApoEArg158Cys正向擴增引物：5’-GCTCCTCCGCGATGCCGA-3’；ApoEArg158Cys反向擴增引物：5’-GGCCTGGTACACTGCCAG-3’；ApoEArg158Cys測序引物：5’-GCCGATGACCTGCAGAAG-3’；其中，所述ApoEArg158Cys反向擴增引物的5’端進行生物素標記。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：ApoECys112Arg陽性對照品1，其為插有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的ApoECys112Arg野生純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.8：5’-CTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCAC-3′；ApoECys112Arg陽性對照品2，其為所述ApoECys112Arg野生純合子質(zhì)粒與插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的ApoECys112Arg突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔?；ApoECys112Arg陽性對照品3，其為插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的ApoECys112Arg突變純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.9：5’-CTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCAC-3’；ApoEArg158Cys陽性對照品1，其為插有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的ApoEArg158Cys野生純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.10：5’-CGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCG-3’；ApoEArg158Cys陽性對照品2，其為所述ApoEArg158Cys野生純合子質(zhì)粒與插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的ApoEArg158Cys突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔铮籄poEArg158Cys陽性對照品3，其為插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的ApoEArg158Cys突變純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.11：5’-CGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCG-3’；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述ApoECys112Arg陽性對照品2中所述ApoECys112Arg突變純合子質(zhì)粒和所述ApoECys112Arg野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1；所述ApoEArg158Cys陽性對照品2中所述ApoEArg158Cys突變純合子質(zhì)粒和所述ApoEArg158Cys野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：質(zhì)控品(controloligo)和空白對照品，所述質(zhì)控品的序列為：TAYGGTTTGCA(SEQIDNO.7)；所述空白對照品為超純水；質(zhì)控品的序列是由QIAGEN設(shè)計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMarkQ24測序儀的各項性能指標。所述的PCR反應(yīng)液1和PCR反應(yīng)液2中其他組分為常規(guī)的10xPCRBuffer、dNTPS和H2O，各組分按常規(guī)體積比配置(10xPCRBuffer、dNTPs、H2O和反應(yīng)液中引物的體積比為5:3:37.5:1)。所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發(fā)明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測ApoE基因分型的試劑中的應(yīng)用。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得在檢測ApoE基因分型時，具有定性準確，靈敏度高及特異性強的優(yōu)點；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應(yīng)、直接給出檢測位點頻率分析及結(jié)果直觀的優(yōu)點；二、可實時監(jiān)測反應(yīng)進程、反應(yīng)時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標準方法，即毛細管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品、陽性對照品和質(zhì)控品，使得所述試劑盒在檢測ApoE基因分型時，可以更好的確保檢測結(jié)果的準確性。附圖說明圖1為臨床樣品ApoECys112Arg野生型的焦磷酸測序圖；圖2為臨床樣品ApoECys112Arg突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床樣品ApoECys112Arg突變純合型的焦磷酸測序圖；圖4為臨床ApoECys112Arg空白對照品的焦磷酸測序圖；圖5至圖7為ApoECys112Arg多組設(shè)計引物的焦磷酸測序圖；其中圖5和圖6的測序結(jié)果不準確，圖7的測序結(jié)果真實可靠。圖8為臨床樣品ApoEArg158Cys野生型的焦磷酸測序圖；圖9為臨床樣品ApoEArg158Cys突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖10為臨床樣品ApoEArg158Cys突變純合型的焦磷酸測序圖；圖11為臨床ApoEArg158Cys空白對照品的焦磷酸測序圖；圖12至圖14為ApoEArg158Cys多組設(shè)計引物的焦磷酸測序圖；其中圖12和圖13的測序結(jié)果不準確，圖14的測序結(jié)果真實可靠。圖15為臨床質(zhì)控品controloligo的焦磷酸測序圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1：試劑盒的制備一、引物和探針的設(shè)計與合成針對人ApoE基因的多態(tài)性位點Cys112Arg和Arg158Cys等位基因，選擇特異的突變位點，使用PyroMarkAssayDesign2.0軟件，設(shè)計引物；其中擴增引物和測序引物先經(jīng)過PAGE純化，再經(jīng)HPLC純化，其中SEQIDNO.2和SEQIDNO.5的5’端進行生物素標記。表1.突變位點與類型：MutationBasechangeCys112ArgAGGACGTG[C/T]GCGGCCGCCTGArg158CysTGCAGAAG[C/T]GCCTGGCAGTG擴增序列如表2：表2.特異性擴增引物及引物序列二、對照品選擇使用人工合成的一段寡聚核苷酸鏈TAYGGTTTGCAcontrololigo為質(zhì)控品；DNase/RNase-Free水為空白對照品。三、PCR反應(yīng)液組成表3.PCR反應(yīng)液1組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3ApoECys112Arg正向擴增引物1H2O37.5總體積46.5μL表4.PCR反應(yīng)液2組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3ApoEArg158Cys正向擴增引物1H2O37.5總體積46.5μL由于針對兩個檢測位點進行擴增，所以有2種不同的PCR反應(yīng)液，分別對ApoECys112Arg和ApoEArg158Cys位點進行檢測。實施例2：試劑盒的使用一、樣品檢測溶解引物干粉(引物溶解后有效期為1個月)。按照模板數(shù)配制體系：取PCR反應(yīng)液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分裝體系，加入樣品DNA、空白對照品或陽性對照品為模板，組成PCR反應(yīng)體系。按照PCR反應(yīng)程序進行PCR擴增。ApoECys112Arg和ApoEArg158Cys體系各主要成分分別如下：表5.ApoECys112Arg體系各主要成分表6.ApoEArg158Cys體系各主要成分該體系反應(yīng)程序如下：表7.PCR反應(yīng)程序擴增完成之后，瓊脂糖凝膠檢驗PCR結(jié)果，以進行下一步程序。二、焦磷酸測序按照焦磷酸測序標準操作規(guī)程進行測序操作，主要步驟為：樣品的制備和純化，然后將純化后的樣品加入含有退火液和測序引物的MIX中上機測序。焦磷酸測序儀試劑倉中加入運行程序相應(yīng)的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。質(zhì)控品controloligo自帶測序引物，最終濃度為0.2μM。三、結(jié)果判斷質(zhì)控品堿基檢出率為100％；空白對照品檢出率為0。四、質(zhì)控標準各類對照質(zhì)控品判斷結(jié)果如下表：表8.質(zhì)控品標準檢測結(jié)果對照品標準檢驗結(jié)果1質(zhì)控品峰高峰型正常、序列準確2空白對照品堿基檢出率為0五、結(jié)果報告：結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖8、圖9及圖10所示，樣品結(jié)果的判斷標準如下：表9.報告樣品檢測結(jié)果圖1及圖8分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys的野生型，圖2及圖9分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys的突變雜合型，圖3及圖10分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys的突變純合型，圖4、圖11及圖15分別顯示的是臨床檢測結(jié)果中ApoECys112Arg空白對照品、ApoEArg158Cys空白對照品及質(zhì)控品controloligo的焦磷酸測序圖。圖5至圖7為ApoECys112Arg多組設(shè)計引物的焦磷酸測序圖；其中圖5和圖6的測序結(jié)果不準確，圖7的測序結(jié)果真實可靠。圖12至圖14為ApoEArg158Cys多組設(shè)計引物的焦磷酸測序圖；其中圖12和圖13的測序結(jié)果不準確，圖14的測序結(jié)果真實可靠。本發(fā)明提供的定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys位點時，具有定性準確，靈敏度高及特異性強的優(yōu)點；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機反應(yīng)、直接給出檢測位點頻率分析及結(jié)果直觀的優(yōu)點；二、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys位點時，可實時監(jiān)測反應(yīng)進程、反應(yīng)時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標準方法，即毛細管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品、陽性對照品和質(zhì)控品，使得所述試劑盒在檢測ApoECys112Arg及ApoEArg158Cys位點時，可以更好的確保檢測結(jié)果的準確性。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>長沙三濟生物科技有限公司<120>定性檢測ApoE基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒<130>2016<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ccggctgggcgcggacat18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgccgcggtactgcacc18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcggacatggaggacgcg19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4gctcctccgcgatgccga18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5ggcctggtacactgccag18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6gccgatgacctgcagaag18<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>7tayggtttgca11<210>8<211>113<212>DNA<213>人工序列<400>8ctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcccggctgggcgcggacatggaggacgtgtgc60ggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcac113<210>9<211>113<212>DNA<213>人工序列<400>9ctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcccggctgggcgcggacatggaggacgtgcgc60ggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcac113<210>10<211>140<212>DNA<213>人工序列<400>10cgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgat60gacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggcccgcgagggcgccgagcgcggc120ctcagcgccatccgcgagcg140<210>11<211>140<212>DNA<213>人工序列<400>11cgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgat60gacctgcagaagtgcctggcagtgtaccaggccggggcccgcgagggcgccgagcgcggc120ctcagcgccatccgcgagcg140當前第1頁1 2 3