本發(fā)明涉及一種辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法，專用于辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的快速分子檢測(cè)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)田間辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

辣椒為茄科辣椒屬(Capsicum)一年生草本植物，是重要的蔬菜及調(diào)味品，原產(chǎn)南美，現(xiàn)世界各國栽培較為普遍，在我國已有數(shù)百年栽培歷史。辣椒營(yíng)養(yǎng)豐富，辣椒中的維生素種類和含量豐富，一顆辣椒中，含有維生素 A、B、C、E、K、胡蘿卜素和葉酸等，還含有鈣和鐵等礦物質(zhì)以及膳食纖維。辣椒中維生素 C 含量在蔬菜中居第一位，辣椒果實(shí)含有辣椒素而有辣味，可增進(jìn)食欲。辣椒現(xiàn)分布全國各地，華北、西北南部為主要產(chǎn)地。是我國主要的蔬菜品種之一。

炭疽病是辣椒的主要病害之一，對(duì)辣椒果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，嚴(yán)重時(shí)可致絕收。辣椒炭疽病主要危害葉片和果實(shí)。初呈水浸狀黃褐色圓斑，進(jìn)而發(fā)展為中央灰褐色，有同心輪紋，上生小黑點(diǎn)的圓型或不規(guī)則型病斑，干燥時(shí)呈現(xiàn)膜狀且易破裂。病菌侵染葉片時(shí)，初期病斑呈褪綠呈水漬狀，慢慢擴(kuò)大，病斑中間灰白色，周圍褐色。在果實(shí)上，病斑表面初生為水漬狀，逐漸擴(kuò)展為褐色凹陷，圓形或不規(guī)則形狀，病斑上生有黑點(diǎn)，為病原菌分生孢子。受害的辣椒莖病部呈不規(guī)則或梭形病斑，縱裂凹陷。辣椒炭疽病病菌以菌絲體在被害植株內(nèi)越冬，或以擬菌核隨病殘?bào)w在土中越冬，種子帶病菌也成為重要的侵染來源。帶病種子可遠(yuǎn)距離傳播，病斑上病菌可借雨水、露水傳染。在我國辣椒種植地區(qū)辣椒炭疽病每年均有不同程度的發(fā)生，一旦發(fā)病當(dāng)年就會(huì)造成10%-30%的損失，如果防治不力，次年就可能造成絕收毀園，給辣椒生產(chǎn)造成極大威脅。辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌在田間主要通過風(fēng)雨傳播，雨水飛濺是近距離傳播的主要因子，而病害初發(fā)期是病害防治的最佳時(shí)期。因此，建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法用于辣椒炭疽病的早期診斷，為病害的最佳防治時(shí)期提供技術(shù)支撐。目前以癥狀為基礎(chǔ)的病害常規(guī)診斷技術(shù)，需要采用柯赫氏法則經(jīng)過病原菌分離培養(yǎng)、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、準(zhǔn)確性差，難以做到病害發(fā)生時(shí)及時(shí)檢測(cè)和有效控制病原菌的傳播和病害流行，難以滿足辣椒炭疽病診斷的實(shí)際需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、結(jié)果可靠、靈敏度高的快速診斷技術(shù)。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物病理學(xué)科不斷發(fā)展和應(yīng)用，一些分子標(biāo)記技術(shù)為植物病原菌的診斷檢測(cè)提供了新的途徑，其中PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)以特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn)被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，對(duì)病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定的技術(shù)已受到廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外研究人員已成功開發(fā)出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏和準(zhǔn)確的鑒定。但目前有關(guān)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌分子檢測(cè)的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)辣椒炭疽病的識(shí)別主要基于病斑的形態(tài)特征，對(duì)辣椒病原菌的檢測(cè)和鑒定主要基于病原形態(tài)學(xué)特征，程序繁瑣、耗死長(zhǎng)、對(duì)鑒定經(jīng)驗(yàn)要求高、準(zhǔn)確度低，難以滿足辣椒炭疽病診斷的實(shí)際需要問題，提供了一種辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌分子檢測(cè)引物，其核苷酸序列為：

上游引物CAF：5’-CTATAACTGTTGCTTCGGCGG-3’；

下游引物CAR：5’-TCCCAGTGCGAGACGTAAAG-3’。

所述引物CAF和CAR對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌特異性擴(kuò)增出406bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)從辣椒葉片或辣椒果實(shí)中提取DNA；

用于檢測(cè)病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測(cè)辣椒葉片或果實(shí)組織是否存在辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌時(shí)，采用NaOH 快速裂解法提取辣椒組織基因組DNA。

(2) 以提取辣椒葉片或辣椒果實(shí)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測(cè)結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出406bp的產(chǎn)物，則可判定所述的辣椒葉片或辣椒果實(shí)中存在辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌，否則所述的辣椒葉片或辣椒果實(shí)中不存在辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準(zhǔn)確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR 引物。已經(jīng)對(duì)不同地理來源的辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌、攜帶辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的植物葉片、攜帶辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的果實(shí)和健康的辣椒組織進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，只有辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌和攜帶該病菌葉片和果實(shí)中能特異性地?cái)U(kuò)增出一條406 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物用于檢測(cè)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌準(zhǔn)確可靠；

（2）特異性強(qiáng)：本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌具有很強(qiáng)的特異性，能夠用于區(qū)別早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）及辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)等辣椒上常見的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在辣椒上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增后，對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的檢測(cè)靈敏度在DNA 水平上可達(dá)到1fg；

（4）適用性廣、實(shí)用性好：本發(fā)明的辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的檢測(cè)方法，不僅能對(duì)病菌菌絲體進(jìn)行檢測(cè)，也能對(duì)感病的辣椒果實(shí)和葉片進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的早期檢測(cè)，即在病害顯癥前進(jìn)行檢測(cè)，防治病害的爆發(fā)流行。

（5）操作簡(jiǎn)便快速：本發(fā)明只需進(jìn)行DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個(gè)檢測(cè)過程可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌特異性擴(kuò)增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌，泳道4-10分別為：辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)、陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明引物辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的靈敏性檢測(cè)擴(kuò)增電泳圖：圖A：普通PCR靈敏度檢測(cè)，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照; 圖B為巢式PCR靈敏度檢測(cè)，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明辣椒發(fā)病果實(shí)和葉片擴(kuò)增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的辣椒葉片、自然發(fā)病的辣椒果實(shí)、人工接種發(fā)病的辣椒葉片、人工接種發(fā)病初期的辣椒果實(shí)、健康的辣椒葉片、健康的辣椒果實(shí)、健康的辣椒果柄、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 分子檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌特異分子檢測(cè)方法的建立

1.辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌基因組DNA的提取：

采用 CTAB 法提取本實(shí)驗(yàn)室保存的2株辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動(dòng)，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50 μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌ITS序列測(cè)定：

以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對(duì)提取辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測(cè)序。

3.辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌特異分子檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)：

根據(jù)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測(cè)序得到的2 株辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的ITS 序列與GenBank 中Colletotrichum屬不同種的ITS序列、辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）ITS 序列、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）ITS 序列、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）ITS 序列、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici) ITS 序列、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）ITS 序列、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)ITS 序列進(jìn)行同源性分析和差異位點(diǎn)比較，用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)了對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌具有特異性擴(kuò)增作用的一對(duì)PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測(cè)引物的序列為：

上游引物CAF：5’-CTATAACTGTTGCTTCGGCGG-3’；

下游引物CAR：5’-TCCCAGTGCGAGACGTAAAG-3’

4.辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌快速分子檢測(cè)方法的建立：

(1)從辣椒葉片或辣椒果實(shí)中提取DNA:

①用于檢測(cè)病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA;

②用于檢測(cè)辣椒植株組織是否感染辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌時(shí)，采用NaOH 快速裂解法提取辣椒植株組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測(cè)的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5 μl ；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0 μL 作為PCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增；

(2) 以提取辣椒葉片或辣椒果實(shí)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測(cè)結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出406bp的產(chǎn)物，則可判定所述的辣椒葉片或辣椒果實(shí)中存在辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌，否則所述的辣椒葉片或辣椒果實(shí)中不存在辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌。

實(shí)施例2 辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌特異性擴(kuò)增

1.采用CTAB 法提取2株辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌、辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.特異性擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，2株辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌可以特異性擴(kuò)增出406bp的條帶，而辣椒早疫病菌（Alternaria sdani）、辣椒褐斑病菌（Cercospora capsici）、辣椒疫霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani）、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測(cè)引物可以將辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌與其他病原菌區(qū)分開來，具有很強(qiáng)的特異性，本發(fā)明的檢測(cè)方法可用于辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例3本發(fā)明引物對(duì)辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的靈敏性檢測(cè)

1.采用CTAB 法提取辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的基因組DNA；

2.將提取的辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增：

（1）第一輪PCR 擴(kuò)增：以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對(duì)配制的成系列濃度DNA 進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以CAF/CAR為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示，以本發(fā)明引物CAF/CAR為引物進(jìn)行常規(guī)PCR時(shí)，在25μL反應(yīng)體系中，10pg的辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10pg（圖2-A）；而進(jìn)一步以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物CAF/CAR為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增時(shí)，在25μL反應(yīng)體系中，1fg的辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1fg(圖2-B)。

實(shí)施例4辣椒葉片及辣椒果實(shí)中辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌的檢測(cè)

1.采用NaOH 快速裂解法提取辣椒植株組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的CAF和CAR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3. 檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，自然發(fā)病的辣椒葉片、自然發(fā)病的辣椒果實(shí)、人工接種發(fā)病的辣椒葉片、人工接種發(fā)病初期辣椒果實(shí)、陽性對(duì)照中均可產(chǎn)生406bp左右的可視條帶，而健康的辣椒葉片、健康的辣椒果實(shí)、健康的辣椒果柄、陰性對(duì)照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測(cè)方法還可用于田間辣椒炭疽病的檢測(cè)。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌分子檢測(cè)引物及檢測(cè)方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctataactgt tgcttcggcg g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccagtgcg agacgtaaag 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggga acctgcgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20