本發(fā)明涉及家畜分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種鑒別香豬品種的分子標(biāo)記和應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
：從江香豬，是我國珍貴的地方豬種，產(chǎn)區(qū)位于貴州省從江縣月亮山區(qū)。1980年被列入中國地方豬種；1982年編入《中國豬種》第二集；1993年被國家農(nóng)業(yè)部列為國家二級(jí)保護(hù)畜種。香豬體型矮小，基因較為純和，肉質(zhì)醇香，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是加工制作高品質(zhì)肉品的優(yōu)質(zhì)原材料，同時(shí)也是生命科學(xué)研究領(lǐng)域難得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(張藝等，2006)。結(jié)構(gòu)變異(structuralvariations，SVs)通常是指基因組中大于1kb的DNA片段的插入、缺失、重復(fù)、倒位、易位以及DNA拷貝數(shù)變異(CNVs)。我們應(yīng)用Illumina公司Hiseq2000測(cè)定了香豬的基因組序列，從中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)變異SV141。結(jié)構(gòu)變異(SVs)廣泛存在于哺乳動(dòng)物基因組中，WanhongLi等(Liwanhong.etal，2015)采用PCR技術(shù)檢測(cè)大白豬基因組DNA中抑制素α亞基基因片段，發(fā)現(xiàn)在抑制素α亞基基因中存在283bp的結(jié)構(gòu)變異，283bp存在時(shí)，會(huì)增加母豬發(fā)生卵泡囊腫的風(fēng)險(xiǎn)。JuliaBrinkmann等(2015)了解到馬αS2-酪蛋白有兩種類型，產(chǎn)生原因是αS2-酪蛋白基因中存在1.3kb的結(jié)構(gòu)變異，位于兩個(gè)編碼外顯子中，其中一種基因結(jié)構(gòu)中含有馬科動(dòng)物特異性的重復(fù)片段。基因的結(jié)構(gòu)變異可調(diào)控畜禽的生產(chǎn)性狀及抗病力，例如，引起牛流產(chǎn)和死胎的MIMT1基因內(nèi)有110kb的片段缺失，決定豬白毛色的KIT基因有450kb發(fā)生復(fù)制性插入，與雞羽毛生長(zhǎng)速度相關(guān)的包含PRLR和SPEF2基因的176kb的片段呈現(xiàn)多拷貝(趙鵬舉，2015)。本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)變異SV141處于線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrialcalciumuniporter,MCU)基因的內(nèi)啟子1中。MCU蛋白參與線粒體鈣離子的攝取過程，位于線粒體內(nèi)膜上，具有兩個(gè)跨膜的α-螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守(徐斌，2015)。豬的MCU基因定位于14號(hào)染色體，編碼351個(gè)氨基酸殘基。生理情況下，MCU將Ca2+從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)中，對(duì)于調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外鈣離子的平衡起重要的作用(趙芹，2013)。在促凋亡因子的刺激下，MCU過表達(dá)會(huì)加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性(張坤，2015)，提示MCU基因的結(jié)構(gòu)變化與線粒體的功能有關(guān)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種鑒別香豬結(jié)構(gòu)變異SV141的分子標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種在香豬群體中以缺失(D)為主的結(jié)構(gòu)變異SV141，缺失片段長(zhǎng)度為433bp，位于豬參考基因組Sscrofa10.2的chr14：81642734-81643166區(qū)段，處于MCU基因內(nèi)含子1中，將結(jié)構(gòu)變異SV141的兩種等位基因命名為D或A，相應(yīng)地，三種基因型命名為DD、AA和DA。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異SV141的一組引物，所述的引物分別為：上游引物F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，下游引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’，擴(kuò)增片段的堿基序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2本發(fā)明還提供所述結(jié)構(gòu)變異SV141在不同豬品種群體中的檢測(cè)方法。該方法包括以下步驟：(1)提取待測(cè)豬品種的基因組DNA；(2)以待測(cè)豬品種基因組DNA為模板，利用引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，據(jù)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)到的條帶判斷基因型，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)構(gòu)變異SV141在豬群體中的分布情況。步驟(2)中PCR擴(kuò)增體系為20μL，即：2×TaqPCRMasterMix10μL，10μmol/L上游引物F0.4μL，10μmol/L下游引物F0.4μL，ddH2O8.2μL，10ng/μL基因組DNA1μL；進(jìn)行AS-PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性：94.0℃5min；2)擴(kuò)增反應(yīng)：變性：94.0℃30sec，退火：64℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30個(gè)循環(huán)；72.0℃10min，4℃保存。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述結(jié)構(gòu)變異SV141鑒別香豬群體的分子標(biāo)記的應(yīng)用技術(shù)。前述的應(yīng)用包括以下步驟：(1)采用PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異SV141在不同豬品種群體中的基因型分布；(2)應(yīng)用SPSSv20.0進(jìn)行基因頻率的差異顯著性檢驗(yàn)，分析該結(jié)構(gòu)變異在香豬與其它豬品種之間的差異大??；(3)根據(jù)結(jié)構(gòu)變異SV141缺失或正常的基因型輔助鑒別香豬品種。本發(fā)明針對(duì)7個(gè)豬品種群體中結(jié)構(gòu)變異SV141的基因型進(jìn)行了檢測(cè)(表2)，得出香豬群體以DD和DA為主，其它6個(gè)豬品種以AA基因型占優(yōu)勢(shì)，經(jīng)SPSSv20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，得出香豬群體中D的基因頻率明顯高于其它6個(gè)豬品種(P<0.01)，其它豬品種群體之間的D基因頻率的差異不大(P>0.05)。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定，與豬參考基因組(Sscrofa10.2)序列進(jìn)行比對(duì)，確定SV141(433bp)位于MCU內(nèi)含子1中。采用PromoterScan和TRANSFAC軟件進(jìn)行啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，找到3個(gè)TFBS區(qū)域。MCU基因編碼的蛋白是線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體，位于線粒體的內(nèi)膜上，參與線粒體對(duì)鈣離子的攝取。MCU與因子MICU1、MICU2、MCUB以及EMRE/SMDT1在線粒體內(nèi)膜組成一個(gè)大分子的復(fù)合物，發(fā)揮功能。MCU具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)跨膜螺旋被一個(gè)高度保守的連接蛋白所分隔開，此蛋白中有一段短氨基酸，面向線粒體膜的間隙，在鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用(張坤，2015)。在低Ca2+水平下，MCU的活性受MICU2下調(diào)；高Ca2+水平下，MICU1增強(qiáng)MCU活性。使MCU基因沉默條件下，心肌細(xì)胞中的Ca2+濃度將顯著上升，并與心肌收縮的加強(qiáng)相對(duì)應(yīng)(SantulliG，etal，2015)。MCU基因參與Ca2+、cAMP和Lipid等信號(hào)通路，在人的MCU基因中含有3個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體。MCU基因中的SV141缺失可能通過調(diào)節(jié)鈣離子的分布，影響香豬的行為或生理過程。本發(fā)明檢測(cè)了結(jié)構(gòu)變異SV141在7個(gè)豬品種群體中的分布類型，并對(duì)結(jié)構(gòu)變異區(qū)的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示香豬群體中D基因的頻率高于其它豬品種的相應(yīng)值(P<0.01)，結(jié)構(gòu)變異SV141可作為鑒別香豬群體的分子標(biāo)記，為香豬品種的輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明提供的香豬結(jié)構(gòu)變異不受香豬的年齡、性別和飼養(yǎng)環(huán)境條件等因素的限制。(2)本發(fā)明建立的檢測(cè)香豬結(jié)構(gòu)變異SV141的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便。(3)本發(fā)明所技術(shù)的結(jié)構(gòu)變異SV141的檢測(cè)技術(shù)，可為香豬純種的分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中結(jié)構(gòu)變異SV141的基因分型結(jié)果；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中香豬結(jié)構(gòu)變異SV141基因頻率與其它豬品種的比較。具體實(shí)施方式以下實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)方法和條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)方法和常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或按照相關(guān)試劑廠商說明書建議的方法和條件。實(shí)施例1豬結(jié)構(gòu)變異SV141的檢測(cè)技術(shù)，步驟如下：1、提取基因組DNA采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，用于從血液或耳組織中提取基因組DNA，具體方法如下：(1)處理材料提取材料為血液時(shí)，可直接取200μL新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，不足200μL時(shí)加入緩沖液GA補(bǔ)足體積。提取材料為耳組織時(shí)，可取50mg樣品，剪碎，置于1.5mLEP管中，加入200μl緩沖液GA，震蕩充分懸浮組織顆粒。(2)加入20μL蛋白酶K，漩渦混勻，如為血液樣品，即可繼續(xù)進(jìn)行步驟(3)；如為耳組織，置于56℃水浴直至組織碎塊全部溶解，瞬時(shí)離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠。(3)加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，瞬時(shí)離心；(4)加入200μl無水乙醇，充分震蕩混勻15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時(shí)離心；(5)將上步所得溶液和絮狀沉淀都全部加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(6)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前需加入無水乙醇)，12000rmp離心1min，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前需加入無水乙醇)，12000rmp離心1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(8)重復(fù)操作步驟7)一次；(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rmp離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rmp離心2min，基因組DNA于離心管中；(11)為增加基因組DNA的得率，將離心收集的溶液再返回入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，收集DNA溶液，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或于-20℃保存。2、目標(biāo)序列的擴(kuò)增本發(fā)明中結(jié)構(gòu)變異SV141位于chr14：81642733-81643165，參考NCBIGenbank收錄的相應(yīng)序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，下游引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’，目的片段分別為992bp或559bp。PCR擴(kuò)增體系為20μL，計(jì)為：2×TaqPCRMasterMix10μL，10μmol/L上游引物F0.4μL，10μmol/L下游引物F0.4μL，ddH2O8.2μL，10ng/μL基因組DNA1μL；進(jìn)行PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性：94.0℃5min；2)擴(kuò)增反應(yīng)：變性：94.0℃30sec，退火：64℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30個(gè)循環(huán)；72.0℃10min；4℃保存。3、結(jié)構(gòu)變異SV141的基因型分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖電泳檢測(cè)，0.5μg/mL溴乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照像記錄條帶。如果一個(gè)樣品，只擴(kuò)增出559bp的一種條帶，將基因型定義為DD型；當(dāng)擴(kuò)增出559bp和992bp的兩種條帶，將基因型定義為DA型；如只擴(kuò)增出992bp一種條帶，將基因型定義為AA型(圖1)。將DD和AA基因型獲得的條帶分別克隆測(cè)序，正常的AA基因型對(duì)應(yīng)992bp的核苷酸序列即SEQIDNo.1，缺失的DD基因型559bp的核苷酸序列即SEQIDNo.2，缺失的433bp序列列于SEQIDNo.3。實(shí)施例2分子標(biāo)記SV141的應(yīng)用按照實(shí)施例1的方法，試驗(yàn)材料如表1所示，以chr14：81642734-81643166為候選結(jié)構(gòu)變異，利用PCR技術(shù)檢測(cè)該結(jié)構(gòu)變異的基因型在7個(gè)豬品種群體中的分布情況，應(yīng)用SPSSv20.0軟件中的χ2檢驗(yàn)分析該結(jié)構(gòu)變異的基因頻率在香豬與其它豬品種間的差異顯著性。結(jié)果顯示，該結(jié)構(gòu)變異在香豬群體中以“缺失”型(D)為主，而在其它豬品種中以“正常”型(A)為主，香豬與其它豬品種間基因頻率差異極顯著(P<0.01)，如表2和圖2所示。表1試驗(yàn)材料及其來源統(tǒng)計(jì)表豬品種樣本數(shù)血液/組織采集來源香豬695貴州省從江縣可樂豬36貴州省畢節(jié)市江口蘿卜豬44貴州省江口縣糯谷豬29貴州省納雍縣黔北黑豬61貴州省桐梓縣榮昌豬37重慶市榮昌縣大白豬74貴州省畢節(jié)市表2結(jié)構(gòu)變異chr14：81642734-81643166的基因型及基因頻率(備注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)當(dāng)前第1頁1 2 3