本發(fā)明涉及一株皮疽諾卡氏菌株及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物寄生線蟲(plant parasitic nematodes)是世界范圍難以防治的重要的植物病害。該線蟲寄生范圍廣，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，可侵染2000多種植物。在引起植物侵染性病害的四大病原生物中，根結(jié)線蟲危害程度已超過細(xì)菌和病毒，僅次于病原真菌。全球每年因作物病原線蟲造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1570億美元，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。其中，根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne spp.)每年對(duì)世界農(nóng)業(yè)造成的損失數(shù)百億美元，在危害較為嚴(yán)重的地方，經(jīng)常會(huì)引起枯萎病、根腐病等真菌病害的伴隨發(fā)生，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。隨著現(xiàn)代化設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，根結(jié)線蟲已成為限制世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。目前已發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲90多個(gè)種，常見的主要有南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)、北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla)、爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogyne javanica)等4個(gè)種。其中南方根結(jié)線蟲最為普遍，對(duì)農(nóng)作物引起的危害也最為嚴(yán)重。

目前，根結(jié)線蟲的防治主要是采用傳統(tǒng)的防治方法，包括植物檢疫、抗病品種選育、農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治。植物檢疫是預(yù)防毀滅性入侵線蟲的有效辦法，但其對(duì)于世界性農(nóng)業(yè)為害的根結(jié)線蟲沒有實(shí)質(zhì)意義；抗病品種選育是一項(xiàng)高效、經(jīng)濟(jì)且無公害的防治措施，但其面臨遠(yuǎn)緣雜交、性不親和、雜交和分離世代長以及抗源僵乏和抗源基因不穩(wěn)定表達(dá)等問題，使該項(xiàng)工作開展比較困難；農(nóng)業(yè)防治主要包括輪作、日曬土壤、種植誘捕植物和調(diào)節(jié)播期等農(nóng)業(yè)技術(shù)措施，是我國主要采用的防治線蟲方法。輪作是采取寄主植物與非寄主植物隔年或隔幾年輪換種植，然而根結(jié)線蟲屬寄主范圍廣泛，日常種植的作物基本上都是根結(jié)線蟲的寄主，輪作對(duì)根結(jié)線蟲防效甚微；化學(xué)防治是使用來源于微生物和植物的農(nóng)藥或化學(xué)合成的農(nóng)藥來防治植物病蟲害，主要是采用甲基嗅熏蒸土壤或高毒、高殘留殺線蟲藥劑，雖然能起到立竿見影的防效，但其費(fèi)用昂貴，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、人畜和環(huán)境均造成嚴(yán)重污染，導(dǎo)致農(nóng)田土壤質(zhì)量嚴(yán)重退化，容易產(chǎn)生抗藥性；生物防治是指在人為的干預(yù)下利用天敵降低有害生物群體數(shù)量的過程，生物防治根結(jié)線蟲研究最多的是天敵真菌和天敵細(xì)菌。殺線蟲真菌分布非常廣泛，分為兩種類型，即捕食性真菌和寄生性真菌，然而，由于土壤的抑菌作用抑制了天敵真菌孢子的萌發(fā)，捕食真菌和寄生真菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上均不能取得顯著的防效；在天敵細(xì)菌中，研究和報(bào)道較多是穿刺巴氏桿菌(Pasteuria penetrans)，但因其專性寄生而難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，制劑成本較高。在科技日益發(fā)展的今天，農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治已經(jīng)受到越來越多的重視，也更加符合國家農(nóng)業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略要去，其效果也是顯而易見的。然而，對(duì)于日益嚴(yán)重的根結(jié)線蟲病害，目前的生物防治在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中依然呈現(xiàn)出時(shí)效慢、防效低的特點(diǎn)，所以尋找或篩選出土源性的、能毒殺根結(jié)線蟲的細(xì)菌具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

本發(fā)明涉及的皮疽諾卡氏菌株，關(guān)于其對(duì)根結(jié)線蟲線蟲的毒殺效果和相關(guān)機(jī)理尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為開發(fā)高效生物農(nóng)藥，而提供一株皮疽諾卡氏菌株及其應(yīng)用。

本發(fā)明篩選到的一株對(duì)南方根結(jié)線蟲J2高效毒殺的皮疽諾卡氏菌(Nocardia spp)，其特征為：氣生菌絲呈纖細(xì)狀,菌落在BHI培養(yǎng)基平板上表現(xiàn)為微黃色菌落且伴有典型性褶皺產(chǎn)生(附圖1B)，其基因組經(jīng)特異性引物Nfar-T(Hasegawa T,Gonoi T,Ito J,et al.2007)克隆后，出現(xiàn)僅皮疽諾卡氏菌才有的283bp的特異性產(chǎn)物片段(附圖1B)，且用細(xì)菌通用引物(27F,1492R)克隆出1245bp的片段(見附件“Nocardia farcinica 16S核酸序列”)，因而確定其為皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)。本發(fā)明的皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)于2016年4月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCC NO.12344。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北晨西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

篩選純化出皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)后，測其對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺效果。

皮疽諾卡氏菌的純化、培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)：

1.平板純化培養(yǎng)

LB平板培養(yǎng)基配方為：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，2％Agar，pH自然。將菌體涂布到平板培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)48h，待單菌落表面出現(xiàn)皺褶時(shí)，獲取單菌落。

2.液體擴(kuò)大培養(yǎng)

將LB平板上的單菌落接種到pH自然的液體培養(yǎng)基BHI(牛腦200.0g、牛心浸出汁250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、NaCl 5.0g、1L去離子水)恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為180rpm。

皮疽諾卡氏菌對(duì)南方根結(jié)線蟲毒殺效果的測定

1.J2幼蟲的收集和體表消毒

拔起萎蔫、下部葉片發(fā)黃的植株，剪掉地上部分，將根部沖洗干凈，選取根部卵塊呈米黃色而量多的番茄，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其置于40μm細(xì)胞篩網(wǎng)。挑取后將篩網(wǎng)和卵塊置于2％的次氯酸鈉中1min，期間緩慢振動(dòng)篩網(wǎng)。無菌水沖洗卵塊5-7次后將篩網(wǎng)放置于裝有15ml無菌水的6cm培養(yǎng)板中28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化，48h離心收集幼蟲。

向離心管中加入1ml 0.001％醋酸氯己定，放置于DNA混合儀上轉(zhuǎn)動(dòng)1h。其次，離心并用無菌水洗滌J2幼蟲3-5次。然后，再向離心管中加入1ml 0.01％氯化汞溶液，7min后離心并用無菌水洗滌J2幼蟲3-5次。最后，將J2制成濃度為40條/μl的線蟲懸浮液。

2.菌株對(duì)J2毒殺能力的測定

用移液槍吸取400μl 37℃下培養(yǎng)48h皮疽諾卡氏菌發(fā)酵液滴加到60mm無菌水瓊脂板中央，并用涂布器均勻涂布使之均勻分布于水瓊脂板表面，向水瓊脂平板加等體積的BHI培養(yǎng)液或無菌水設(shè)為對(duì)照。將水瓊脂板置于超凈工作臺(tái)中吹干，然后向水瓊脂板中央加入50μl的J2懸浮液。板將加有J2的水瓊脂平板放置于28℃，每隔24h在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)J2的存活情況。

3.毒殺效果計(jì)算

當(dāng)J2在平板上呈現(xiàn)僵直狀態(tài)并經(jīng)機(jī)械刺激后，5s內(nèi)仍然沒有活動(dòng)的判定為死亡，反之則認(rèn)為存活狀態(tài)。

存活率(％)＝N_死/N_總

毒殺效果(％)＝存活率(BHI)-存活率(皮疽諾卡氏菌)

本發(fā)明的皮疽諾卡氏菌株在制備毒殺南方根結(jié)線蟲J2的生物藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：皮疽諾卡氏菌對(duì)南方根結(jié)線蟲J2毒殺時(shí)效快、防效高；對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、人畜和環(huán)境均無污染；能夠用于制備生物農(nóng)藥。

附圖說明

圖1：皮疽諾卡氏菌的單菌落和特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(A:皮疽諾卡氏菌在BHI培養(yǎng)基上的單菌落；B:皮疽諾卡氏菌基因組經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳，M:1000bp marker,1:皮疽諾卡氏特異性產(chǎn)物，283bp)

圖2：96h內(nèi)J2在濃度梯度的皮疽諾卡氏菌液下的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(A,B,C和D分別指：J2在濃度梯度的皮疽諾卡氏菌液下在24h，48h,72h和96h的存活率統(tǒng)計(jì)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中的皮疽諾卡氏菌的純化、培養(yǎng)方法及對(duì)南方根結(jié)線蟲毒殺效果的測定同發(fā)明內(nèi)容部分所述。實(shí)施例子中的皮疽諾卡氏菌菌液OD₆₀₀＝3.294，即1.65x 10⁹cell/ml。

實(shí)施例一：

用移液槍取100μl經(jīng)37℃下培養(yǎng)48h的皮疽諾卡氏菌滴加到無菌水瓊脂板中央，再另加入300μl BHI,并用涂布器均勻涂布于60mm的無菌水瓊脂板上，向水瓊脂平板加300μl BHI培養(yǎng)液或無菌水設(shè)為對(duì)照。將水瓊脂板置于超凈工作臺(tái)中吹干，然后向水瓊脂板中央加入50μl的J2懸浮液。板將加有J2的水瓊脂平板放置于28℃，每隔24h在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)J2的存活情況。(見表1)

實(shí)施例二：

用移液槍取200μl經(jīng)37℃下培養(yǎng)48h的皮疽諾卡氏菌滴加到無菌水瓊脂板中央，再另加入200μl BHI,并用涂布器均勻涂布于60mm的無菌水瓊脂板上，向水瓊脂平板加400μl BHI培養(yǎng)液或無菌水設(shè)為對(duì)照。將水瓊脂板置于超凈工作臺(tái)中吹干，然后向水瓊脂板中央加入50μl的J2懸浮液。板將加有J2的水瓊脂平板放置于28℃，每隔24h在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)J2的存活情況(見表1)。

實(shí)施例三：

用移液槍取300μl經(jīng)37℃下培養(yǎng)48h的皮疽諾卡氏菌滴加到無菌水瓊脂板中央，再另加入100μl BHI，并用涂布器均勻涂布于60mm的無菌水瓊脂板上，向水瓊脂平板加400μl BHI培養(yǎng)液或無菌水設(shè)為對(duì)照。將水瓊脂板置于超凈工作臺(tái)中吹干，然后向水瓊脂板中央加入50μl的J2懸浮液。板將加有J2的水瓊脂平板放置于28℃，每隔24h在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)J2的存活情況(見表1)。

實(shí)施例四：

用移液槍取400μl經(jīng)37℃下培養(yǎng)48h的皮疽諾卡氏菌滴加到無菌水瓊脂板中央，并用涂布器均勻涂布于60mm的無菌水瓊脂板上，向水瓊脂平板加400μl BHI培養(yǎng)液或無菌水設(shè)為對(duì)照。將水瓊脂板置于超凈工作臺(tái)中吹干，然后向水瓊脂板中央加入50μl的J2懸浮液。板將加有J2的水瓊脂平板放置于28℃，每隔24h在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)J2的存活情況(見表1)。

表1不同濃度下皮疽諾卡氏菌對(duì)J2毒殺效果

結(jié)果表明：100μl和200μl皮疽諾卡氏菌液在48h內(nèi)，毒殺線蟲效果相對(duì)比較弱(分別為19.33％和26.33％)，分別從96h和72h表現(xiàn)出較為顯著的毒殺效果(分別為50.9％和49.00％)；然而，300μl和400μl皮疽諾卡氏菌液在48h已呈現(xiàn)出極為顯著的毒殺效果(分別為58.66％和63.00％)，并且二者在96h呈現(xiàn)出近乎100％的毒殺效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南大學(xué)

<120> 一株皮疽諾卡氏菌株及其應(yīng)用

<130> 2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> Nocardia farcinica

<400> 1

gggccgtgcg gcgtgcttac acatgcaagt cgagcggtaa ggcccttcgg ggtacacgag 60

cggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtgat ctgccctgta cttcgggata agcctgggaa 120

actgggtcta ataccggata tgaccttaca tcgcatggtg tttggtggaa agatttatcg 180

gtacaggatg ggcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac 240

gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc 360

cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc gacagggacg aagcgcaagt 420

gacggtacct gtagaagaag caccggccaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

ggtgcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagctt gtaggcggtt tgtcgcgtcg 540

tccgtgaaaa cttggggctc aaccccaagc ttgcgggcga tacgggcaga cttgagtact 600

gcaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc 660

ggtggcgaag gcgggtctct gggcagtaac tgacgctgag aagcgaaagc gtgggtagcg 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt gggcgctagg tgtgggtttc 780

cttccacggg atccgtgccg tagctaacgc attaagcgcc ccgcctgggg agtacggccg 840

caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgtggatta 900

attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gtttgacata caccggaaac ctgcagagat 960

gtaggccccc ttgtggtcgg tgtacagtga tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgga 1020

gatgttgggg ttaagtcccg cacgagcgca acccttgtcc tgtgttgcag cgcgttatgg 1080

cggggactcg cagaaactgc cgggtcactc gagaggtggg gacgacgtca gtcatcatgc 1140

ccctaatgtc caggctcacc atgcctacaa tggcccggta cagaagctgc taacgtgagg 1200

tgacgattcc gtaagcggta ttcagatttc gggaatcggg tgctg 1245