專利名稱：一種定量檢測炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于感染性疾病檢測技術領域。特別是涉及到一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，同時還涉及一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條的制備方法。
背景技術：
炭疽芽孢桿菌(Bacillus an thracis)是一種可產生芽孢的需氧桿菌，竹節(jié)狀排列，為革蘭氏陽性。該菌可引起人畜共患的炭疽病，且在草食性動物中發(fā)病率最高，人類通過接觸土壤中，皮毛上的芽孢也可導致感染。由于炭疽芽孢對高溫，高壓，干燥、電離輻射以及一些化學物質具有極強的抵抗能力，故而可在環(huán)境中生存數(shù)十年，甚至數(shù)百年。為此，炭疽芽孢一直被列為頭號生物戰(zhàn)斗劑。2001年，發(fā)生在美國的炭疽恐怖事件再次讓全世界震驚，無論是自然感染還是生物反恐，在掌握炭疽芽孢桿菌致病機制的同時如何快速準確的檢驗、鑒定炭疽芽孢桿菌是當今人類必須要解決的難題。針對炭疽芽孢的現(xiàn)有檢測方法包括利用免疫學技術的酶標法或熒光抗體染色法，利用分子生物學技術的PCR法，以及多種傳統(tǒng)的檢測方法，包括細菌分離培養(yǎng)、溶血性實驗、莢膜染色、噬菌體裂解實驗、串珠實驗等。上述方法耗時較長，而且需要純化工作或購買復雜的儀器，操作繁瑣，多數(shù)只能進行定性檢測而不能實驗定量檢測。磁個生免疫層析(Magnetic Immuno-chromatography Testing,MICT)是以膠體金技術為基礎發(fā)展出的一種單人份快速定量檢測技術。此免疫層析以超順磁顆粒(superPMPs) 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標記物進行免疫層析，通過超順磁顆粒捕獲的生化物質來定量判斷樣品中的待測物含量，采用磁標記免疫復合物-磁場強度標準曲線來進行定量測定。該技術與傳統(tǒng)技術相比具有下述優(yōu)勢a)比各類目測快速診斷法靈敏10-100倍；b)加樣后30分鐘內可得到數(shù)據(jù)，且可實現(xiàn)多重檢測；c)在3到4個數(shù)量級濃度范圍內呈線性；d)所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡便；e)超順磁顆粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變。該技術繼承了傳統(tǒng)免疫層析技術簡便快速、單人份操作的優(yōu)點，又彌補了傳統(tǒng)免疫層析技術靈敏度低、只能定性不能定量的缺點，從而成為替代傳統(tǒng)免疫層析技術的首選。磁免疫層析法是以超順磁顆粒標記抗體進行免疫反應檢測，通過檢測磁性強度提供針對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)，采用標記的免疫復合物-磁場強度的標準曲線來計算出待測物質的含量。用作標記物的超順磁顆粒，在沒有外加磁場的情況下不具有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現(xiàn)出磁性，商品化的超順磁顆粒都經(jīng)過表面修飾，大大方便了標記過程，標記簡便，重復性好。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，此試紙條可實現(xiàn)針對炭疽芽孢的快速、定量的現(xiàn)場檢測。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條的制備方法，采用此方法制備出的磁性免疫試紙條可用于針對炭疽芽孢的快速、 定量檢測，且信號穩(wěn)定性強，可長期保存。為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案將磁性免疫層析技術應用在炭疽芽孢定量檢測試紙條中，將一株針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體共價偶聯(lián)于超順磁顆粒上，將另一株針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜上作為檢測線捕獲固相，將羊抗小鼠IgG包被于硝酸纖維素膜上作為質控線捕獲固相，按照常規(guī)免疫層析法的原理進行標本檢測，結合磁性檢測儀進行檢測，在高靈敏度檢測的同時大大縮短了檢測時間，并且可以即時給出定量結果，測量儀器簡單可靠，便攜實用。一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，該試紙條由98mm長的底板(millipore公司生產級底板)、25mm長的硝酸纖維素膜(millipore公司實驗級硝酸纖維素膜)、結合有炭疽芽孢抗體偶聯(lián)的超順磁顆粒的8mm長的結合墊(millipore公司生產級Au-pad)、22mm長的樣品墊(millipore公司生產級樣品墊)以及^mm長的吸收墊(millipore公司生產級吸收墊)構成，硝酸纖維素膜上預包被有炭疽芽孢檢測線T和質控線C。構成該試紙條的所有部件長度不同，寬度均為5mm。粘貼于底板上的第一層為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜靠近檢測線的一端粘貼有結合墊(第二層)，另一端粘貼有吸收墊 (第二層)，結合墊遠離硝酸纖維素膜的一端上粘貼有樣品墊(第三層)，三層之間相互交錯 2. 5mmο一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，共包括起支撐作用的底板；粘貼在底板上，包被有檢測線抗體(針對炭疽芽孢的單克隆抗體)與質控線抗體(商品化羊抗小鼠IgG)的硝酸纖維素膜；粘貼在底板上，并有2. 5mm長的部分與硝酸纖維素膜交錯重疊(覆蓋硝酸纖維素膜的靠近檢測線一端)，用于儲存磁顆粒的結合墊；粘貼在底板上，并有2. 5mm長的部分與結合墊交錯重疊(覆蓋結合墊的遠離硝酸纖維素膜的一端)，起承載與釋放樣品作用的樣品墊；粘貼在底板上，并有2. 5mm長的部分與硝酸纖維素膜交錯重疊(覆蓋硝酸纖維素膜的靠近質控線一端)，用于吸收樣品以提供展層動力的吸收墊；包被在硝酸纖維膜上，用于捕獲樣品中的炭疽芽孢的檢測線(T線)；包被在硝酸纖維膜上，用于捕獲多余的磁顆粒并指示反應的完全程度的質控線(C線)。一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其步驟是A、抗體的制備采用標準B淋巴細胞雜交瘤技術制備兩種針對炭疽芽孢表面EAl 蛋白的單克隆抗體，并用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對制備出的抗體進行純化；B、抗體偶聯(lián)超順磁顆粒的制備選用直徑為100-300 nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的方式將針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體共價交聯(lián)到超順磁顆粒上，交聯(lián)后的超順磁顆粒用BSA封閉；C、將制備好的抗體偶聯(lián)磁顆粒使用定量噴液裝置以10 μ l/cm-20 μ 1/cm的量噴涂于結合墊上；D、硝酸纖維素膜的包被使用包被緩沖液將針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體以及羊抗小鼠IgG稀釋到0. 5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 4-0. 8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于干燥處(濕度20%至40%)封存?zhèn)溆?，保存溫度?°C至25°C，避免陽光直射；E、試紙條的組裝在底板上依次相互交錯2. 5mm地貼上包被有抗體的硝酸纖維素膜、磁顆粒結合墊、樣品墊、吸收墊，然后根據(jù)要求寬度切割即得到試紙條。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果可對樣品中的炭疽芽孢濃度進行定量檢測，在高靈敏度檢測的同時大大縮短了檢測時間，并且可以即時給出定量結果，測量儀器簡單可靠，操作簡易，方便實用。檢測下限可達IO3個芽孢；方便快捷，20分鐘可進行信號讀??；磁性分析儀可靠且便攜，適合現(xiàn)場檢測； 信號穩(wěn)定性好，便于長期保存。


圖1為一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條結構示意圖。圖2為一種裝入卡板后的試紙條結構示意圖。其中底板1、樣品墊2、結合墊3、檢測線4、質控線5、硝酸纖維素膜6、吸收墊7。
具體實施例方式實施例1 根據(jù)圖1、圖2可知，一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，該試紙條由98mm長的底板1、25mm長的硝酸纖維素膜6、結合有炭疽芽孢抗體偶聯(lián)的超順磁顆粒的8mm長的結合墊3、22mm長的樣品墊2以及^mm長的吸收墊7構成，硝酸纖維素膜6上預包被有炭疽芽孢檢測線4(T)和質控線5(C)。構成該試紙條的所有部件長度不同，寬度均為5mm。粘貼于底板1上的第一層為硝酸纖維素膜6，硝酸纖維素膜6靠近檢測線4的一端粘貼有結合墊3 (第二層)，另一端粘貼有吸收墊7 (第二層)，結合墊3遠離硝酸纖維素膜6的一端上粘貼有樣品墊2 (第三層)，三層之間相互交錯2. 5mm。制作完成的試紙條裝入卡板9中，使用時通過卡板9的加樣孔8加入約100微升樣品即可。在具體實施中，所采用的抗體為單克隆抗體技術所制備的單抗，以及購買的商品化的二抗。利用雙抗體夾心檢測炭疽芽孢表面抗原的原理檢測樣品，當待測樣品中含有炭疽芽孢抗原時，抗原展層到結合墊3時會與磁顆粒上偶聯(lián)的抗體結合，隨著層析作用的繼續(xù)，磁顆粒-免疫復合物隨溶液移動到包被了另一種炭疽單抗的檢測線4(T)處，抗原會再次發(fā)生免疫反應形成雙抗體夾心復合物聚集在檢測線4 (T)處，而剩余的抗體偶聯(lián)磁顆粒及未被捕獲的過量磁顆粒-免疫復合物會繼續(xù)展層至質控線5 (C)處，磁顆粒上偶聯(lián)的單抗被質控線5(C)處包被的二抗捕獲而使質控線5(C)處同樣出現(xiàn)磁顆粒聚集。整個反應在40分鐘內進行完全，一般反應20 分鐘后即可進行儀器讀數(shù)，通過分析檢測線4 (T)及質控線5 (C)處的磁性信號來確定結果。 整個讀數(shù)、分析的過程已經(jīng)完全程序化，磁性分析儀會直接給出結果。實施例2 一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其步驟是Α、抗體制備采用標準B淋巴細胞雜交瘤技術[Kohler G，Milstein C(1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497]制備抗炭疽芽孢表面單克隆抗體[Wang DB, et al(2009). Detection of B. anthracis spores and vegetative cells with the samemonoclonal antibodies. Plos One 4(11) :e7810]，并用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對制備出的抗體進行純化[Perosa F, Carbone R, Ferrone S, Dammacco F(1990)Purification of human imunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulphate. J Immunol Methods 128 :9-16.]B、包被膜的制備用包被緩沖液(0. OlM PBS, pH7. 2-7. 5均適用)將炭疽芽孢單抗稀釋為ang/ml，將二抗稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以2μ 1/cm的量將二者以 0. 6-0. 7cm的間隔均勻噴印于35cm長2. 5cm寬的硝酸纖維素膜上，室溫(20-25°C以下相同)晾干。C、炭疽芽孢單克隆抗體偶聯(lián)磁顆粒的制備使用含0. 1 % (體積/體積)Tween20 的50mM、pH4. 7的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使終濃度均為20mmol，室溫反應一小時，洗滌磁珠后，加入炭疽芽孢單克隆抗體使其與磁顆粒含有的羧基的數(shù)量比例是1 300到1 400，37°C搖床120rpm反應2小時，洗滌磁顆粒后加入含有5% (質量/ 體積)BSA的0. 02M、pH7. 2的PBS，37°C搖床120rpm封閉2小時，使用含0. 1 % (體積/體積)Tween20的50mM、pH4. 7的醋酸鈉緩沖液反復洗滌磁顆粒，并將抗體偶聯(lián)磁顆粒轉移至含1 % (質量/體積)PVP, 1% (質量/體積)BSA、0· 5 % (體積/體積)Tween20,5% (質量/體積)蔗糖的50mM pH8.5硼酸緩沖液中保存，置于4°C備用。D、結合墊的噴涂使用BioDot噴膜儀將一定比例稀釋過的抗體偶聯(lián)磁顆粒以 20 μ 1/cm的量均勻噴涂于0. 9cm寬的結合墊上，4_25°C干燥備用。E、試紙條的組裝及切割將2. 5cm包被有抗體的硝酸纖維素膜，0. 8cm噴涂有抗體偶聯(lián)磁顆粒的結合墊，2. 2cm樣品墊，2. 9cm吸收墊組裝于9. 8cm寬底板上，并將組裝好的試紙板切成0. 5cm寬的成品試紙條，如圖1所示。F、檢測卡的組裝所述的組裝好的試紙條置于塑料底卡的卡槽內，蓋上上蓋，使用壓卡器將上下卡壓緊，確保試紙條位置固定且處于緊繃狀態(tài)如圖2，放入鋁箔袋中抽真空封存?zhèn)溆?。G、檢測卡的使用方法1、處理樣品將待測樣品用層析緩沖液溶解或稀釋；2、加樣取出單人份的檢測卡，用微量移液器取100 μ 1樣品加入檢測卡表面的加樣孔內，等待反應進行20分鐘；3、測量將檢測卡插入磁性分析儀，運行后儀器會自行讀取檢測卡上的信息。層析緩沖液配方為:0. OlM PBS, 0. 1% Tween20,0. 5% BSA, pH7. 5 (pH7. 2-7. 6 均適用)。
權利要求
1.一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，該試紙條由底板(1)、硝酸纖維素膜(6)、結合墊(3)、樣品墊(2)及吸收墊(7)構成，其特征在于硝酸纖維素膜(6)上預包被有炭疽芽孢檢測線(4)和質控線(5)，粘貼于底板(1)上的第一層為硝酸纖維素膜 (6)，硝酸纖維素膜(6)靠近檢測線(4)的一端粘貼有結合墊(3)第二層，另一端粘貼有吸收墊(7)第二層，結合墊(3)遠離硝酸纖維素膜(6)的一端上粘貼有樣品墊(2)第三層，三層之間相互交錯2. 5mm，試紙條裝入卡板(9)中，通過卡板(9)的加樣孔(8)加入樣品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條，其特征在于所述的底板為98mm，硝酸纖維素膜為25mm，結合墊為結合有炭疽芽孢抗體偶聯(lián)的超順磁顆粒的8mm，樣品墊為22mm，吸收墊為^mm。
3.權利要求1所述的一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其步驟是A、抗體的制備采用標準B淋巴細胞雜交瘤技術制備兩種針對炭疽芽孢表面EAl蛋白的單克隆抗體，并用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對制備出的抗體進行純化；B、抗體偶聯(lián)超順磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺和琥珀酰亞胺共價偶聯(lián)的方式將針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體共價交聯(lián)到超順磁顆粒上，交聯(lián)后的超順磁顆粒用BSA封閉；C、將制備好的抗體偶聯(lián)磁顆粒使用定量噴液裝置以10μ l/cm-20 μ /cm的量噴涂于結合墊上；D、硝酸纖維素膜的包被使用包被緩沖液將針對炭疽芽孢表面蛋白的單克隆抗體以及羊抗小鼠IgG稀釋到0. 5-2 mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 4-0. 8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于干燥處封存?zhèn)溆茫４鏈囟葹?°C至25°C，避免陽光直射；E、試紙條的組裝在底板上依次相互交錯2.5mm地貼上包被有抗體的硝酸纖維素膜、 磁顆粒結合墊、樣品墊、吸收墊，然后根據(jù)要求寬度切割即得到試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測樣品中炭疽芽孢的磁性免疫層析試紙條及制備方法，硝酸纖維素膜上預包被有炭疽芽孢檢測線和質控線，粘貼于底板上的第一層為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜靠近檢測線的一端粘貼有結合墊，另一端粘貼有吸收墊，結合墊遠離硝酸纖維素膜的一端上粘貼有樣品墊，三層之間相互交錯，試紙條裝入卡板中，通過卡板的加樣孔加入樣品。其步驟是A、抗體的制備；B、抗體偶聯(lián)超順磁顆粒的制備；C、將制備好的抗體偶聯(lián)磁顆粒使用定量噴液于結合墊上；D、硝酸纖維素膜的包被；E、試紙條的組裝。簡單可靠，操作簡易，方便實用。檢測下限可達103個芽孢；方便快捷，20分鐘可進行信號讀取，適合現(xiàn)場檢測；信號穩(wěn)定性好，便于長期保存。
文檔編號G01N33/569GK102353776SQ20111015121
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權日2011年6月7日
發(fā)明者危宏平, 張先恩, 張治平, 王殿冰, 田博 申請人:中國科學院武漢病毒研究所