專利名稱：：一類炭殼菌聚酮及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從大刀螳螂(7fewoc/era"^'^/0//")腸道菌光輪層炭殼菌(Z)aWfm'a^cfcc/zo/z/z')液體發(fā)酵物中提取的一類新骨架炭殼菌聚酮(dalesconols)及其制法與免疫抑制作用。
背景技術(shù)：
：雖然微生物的次生代謝產(chǎn)物已被廣泛研究，但一些特境微生物的代謝產(chǎn)物還是沒有引起人們足夠重視。昆蟲腸道菌就是其中的一類特境微生物，關(guān)于其代謝產(chǎn)物研究得較少。據(jù)估計地球上約有3000萬種昆蟲，昆蟲的多樣性意味著其腸道菌的多樣性，腸道菌的多樣性為次生代謝產(chǎn)物提供了一個豐富的來源。免疫抑制劑在器官移植、自身免疫病等中有重要作用。據(jù)報道一些昆蟲真菌感染昆蟲后能產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物抑制昆蟲的免疫系統(tǒng)，據(jù)此日本學者Fujita等從冬蟲夏草中分離得到一種免疫抑制劑ISP-I，該化合物的免疫抑制活性要比陽性對照環(huán)孢霉素A(CyA)強10-100倍(參見FujitaT,HiroseR，YonetaMetal.JMeofC/zew,1996，39:4451)，因此昆蟲真菌可能是篩選免疫抑制劑的一條重要途徑。然而，到目前為止，尚未見從昆蟲腸道菌光輪層炭殼(DoWfm'aMcfec/wfea)分離免疫抑制劑的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于1.提供一類具有免疫抑制活性的新骨架炭殼菌聚酮(dalesconols)。2.提供一種提取、分離炭殼菌聚酮(dalesconols)的方法。3.提供一類本發(fā)明的炭殼菌聚酮(dalesconols)在制備免疫抑制劑藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。一種炭殼菌聚酮(dalesconols)，它具有下述結(jié)構(gòu)通式(I):_R1C-19C-28k殼菌聚酮A:H(+)-炭殼菌聚酮A:HA'及(-)-炭殼菌聚酮A:HAS炭殼菌聚酮B:OH(+)-炭殼菌聚酮B:OHSS(-)-炭殼菌聚酮B:OH及及I其中1，3，5，7，9,11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29為碳原子序數(shù)編號，R'為H或OH，當R'為H時，是炭殼菌聚酮A;當W為OH時，是炭殼菌聚酮B。一種上述的炭殼菌聚酮(dalesconols)的制備方法，它包括下述步驟步驟l.將新鮮的從大刀螳螂(7fe"oAra"ri^/o/ffl)腸道中分離、純化得到的昆蟲腸道真菌光輪層炭殼菌菌絲體塊接種到ME培養(yǎng)基(麥芽提取物20g，蔗糖20g,蛋白胨lg,1L蒸餾水)上，于搖床上，在140卬m、28。C條件下培養(yǎng)3天作為種子液，步驟2.然后將種子液接種于ME培養(yǎng)基中，在140ipm、28'C條件下發(fā)酵10天，步驟3.將步驟2所得發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮干燥得黑色粗浸膏F1，步驟4.將粗浸膏F1懸浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經(jīng)濃縮得浸膏F2，步驟5.對浸膏F2進行硅膠柱層析，先用10倍體積的氯仿洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸膏F3，步驟6.然后用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸膏F4，歩驟7.對浸膏F3，用甲醇重結(jié)晶得到外消旋炭殼菌聚酮A(dalesconolA)，用手性高壓液相色譜法(手性柱ChiralpakAS-Hcolumn;流動相正己烷/異丙醇/醋酸=60/40/0.1(v/v/v);流速0.6mL/min)分離得到一對對應(yīng)異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮A[(+)-dalescono1A]和(-)-炭殼菌聚酮A[(-)-dalesconolA]，步驟8.對浸膏F4，進一歩進行硅膠柱層析，用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液洗脫得到外消旋炭殼菌聚酮B(dalesconolB)，用手性高壓液相色譜法(手性柱ChiralpakIAcolumn;流動相甲基叔丁基醚/四氫呋喃/醋酸=95/5/0.1(v/v/v);流速1.0mL/min)分離得到一對對應(yīng)異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮B[(+)-dalescono1B]和(-)-炭殼菌聚酮A[(-)-dalesconolB]。本發(fā)明的炭殼菌聚酮(dalesconols)對ConA所致小鼠脾細胞增殖有很強的抑制作用，且對正常的小鼠脾細胞沒有毒性，因此炭殼菌聚酮(dalesconols)可作為具有免疫抑制作用的化合物，并有望在制備免疫抑制藥物中得到應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述突出優(yōu)點1.本發(fā)明的炭殼菌聚酮(dalesconds)是全新骨架化合物，可以作為具有免疫抑制作用的新藥物或先導化合物。2.本發(fā)明的炭殼菌聚酮(dalesconols)可以利用微生物進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證。3.本發(fā)明利用生物法合成炭殼菌聚酮(dalesconols)對環(huán)境無污染。圖1為炭殼菌聚酮A(dalesconolA)的單晶結(jié)構(gòu)圖；圖2為炭殼菌聚酮B(dalesconolB)的單晶結(jié)構(gòu)圖。具體實施例方式通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限定。實施例l:昆蟲腸道真菌光輪層炭殼菌(Daldiniaeschscholzii)的分離與純化在無菌條件下解剖大刀螳螂(Tenoderaaridifolia),取出的螳螂腸道在75%酒精中表面消毒2分鐘，無菌水漂洗3次，后加少量無菌水在無菌研缽中研磨，用無菌水對研磨液梯度稀釋成10",10'2，10—3,10"4,分別取各梯度稀釋液0.2毫升涂布于MEA培養(yǎng)基(麥芽提取物20g，蔗糖20g，蛋白胨lg,瓊脂15g，1L蒸餾水)中，置于28'C恒溫箱中培養(yǎng)，待菌體長出后，挑取菌落邊緣菌絲純化培養(yǎng)，得到昆蟲腸道真菌，經(jīng)廣東省微生物研究所鑒定為光輪層炭殼菌(DflWi'w'aesc^c/iofe"rW/)，現(xiàn)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址武漢珞珈山武漢大學內(nèi))，保藏編號為CCTCCNO:M207198,保存日期為2007.12.13.(保藏存活證明后補)。實施例2:昆蟲腸道真菌光輪層炭殼菌(DflWi"&esc/wc/w^')的液體發(fā)酵活化昆蟲腸道真菌光輪層炭殼菌(DflWzVi/a^fecAo/z!'!'),將新鮮的菌絲體塊接種到1000mL錐形瓶中，每瓶含有400mL的ME培養(yǎng)基，接種5—6瓶于搖床上，在140rpm、28*0條件下培養(yǎng)3天作為種子液，然后將20mL種子液接種于含有400mL的ME培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中，在140rpm、28'C條件下發(fā)酵10天。實施例3:炭殼菌聚酮(dalesconols)的提取與分離實施例2中所得發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮干燥得黑色粗浸裔Fl。將粗浸裔F1懸浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經(jīng)濃縮得浸裔F2，對浸裔F2進行硅膠柱層析，先用10倍體積的氯仿洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸裔F3，然后用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸育F4。對浸裔F3，用甲醇重結(jié)晶得到外消旋炭殼菌聚酮A(dalescondA),用手性高壓液相色譜法(手性柱ChiralpakAS-Hcolumn;流動相正己垸/異丙醇臃酸=60/40/0.1(v/v/v);流速:0.6mL/min)分離得到一對對應(yīng)異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮A[(+)-dalescono1A]和(-)-炭殼菌聚酮A[(-)-dalesconolA]。對浸裔F4，進一步進行硅膠柱層析，用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液洗脫得到外消旋炭殼菌聚,B(dalesconolB)，用手性高壓液相色譜法(手性柱ChiralpakIAcolumn;流動相甲基叔丁基醚/四氫呋喃/醋酸=95/5/0.1(v/v/v);流速1.0mL/min)分離得到—對對應(yīng)異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮B[(+)-dalesconolB]和(-)-炭殼菌聚酮A[(-)-dalesco加lB〗。實施例4:炭殼菌聚酮(dalesconols)的結(jié)構(gòu)鑒定炭殼菌聚酮(dalesconols)的結(jié)構(gòu)是基于它們的質(zhì)譜、核磁共振譜和X-my單晶衍射分析而確定的。光譜學數(shù)據(jù)如下炭殼菌聚酮A(dalesconolA),紅色針狀晶體，熔點308-309°C;[a]2QD=0°(c=0.48inMeCN);UV(MeOH):Xmax(logs)=462(3.89)，338(4.17),206(4.51);IRv=(cm"):3063.1，3036.1,2958.5，2910.4,1644.7,1629.6,1608.6,1585.9,1552.0，1518.8,1473.8，1452.6,1411.8,1396.0,1266.7,1216.6，1161.3，852.0,820.9,772.8cm-1;HRESIMS:w/z463.1180[M+H]十,calculatedforC29H1906,463.1176;'Hand13CNMRdata見表1;(+)-炭殼菌聚酮A[(+)-dalesconolA]:[a]20D=+485.87。(c=0.066inMeCN);CD(MeCN)Xmax(△￡)216(—55.18),233.1(+28.79),265.4(-11.60)，323.1(+4.75);(-)-炭殼菌聚酮A〖(-)-dalesconolA]:[a]20D=-487.76°(c=0.070inMeCN);CD(MeCN)Xmax(As)216216(+52.52)，233.2(—27.16)，265.1(+11.33)，320.1(-4.62).炭殼菌聚酮B(dalesconolB),紅色針狀晶體，熔點344-346°C;[a]2()D=0°(c=0.48inMeCN);UV(MeOH):Xmax(logs)=459(3.80),337(4.08),206(4.46);IRv=(cm.1):3177.1，3068.1,2923.4，2852.6,1648.6,1611.8,1558.0,1523.6,1475.1，1450.3,1219.5,1198.6,1167.4,846.2cm.';EIMSm/z(relativeintensity):478.9(8.590/o),477.9(M+,100%),434.9(2.01%),416.9(10.18%),409.9(6.62%);HREIMSm/z478.1062,calculatedforC29H1807,478.1053;'Hand13CNMRdata見表1;(+)-炭殼菌聚酮B[(+)-dalesconolB[a]2()D=+613.4°(c=0.028inMeCN);CD(MeCN)Xmax(As)215.1(43.69),248.1(+11.62),296.9(-20.75),345.3(+6.75);(-)-炭売菌聚酮B[(-)-dalesconolB]:[a]20D=-613.8°(c=0.043inMeCN);CD(MeCN)Xmax(As)215.2(+41.41)，247.5(—10.84),296.7(+19.21)，346.1(—6.09).表1.炭殼菌聚酮A(dalesconolA)and炭殼菌聚酮B(dalesconolB)and13CNMR的數(shù)據(jù)(溶劑DMSO)碳原子dalesconolAdalesconolAdalesconolBdalesconolB序數(shù)<5C(mult.，J，Hz)<5Cd、H(mult.，Hz)1206.3204.42120.7113.0161.3165.74120.46.92(d，8.0)104.76.18(d，1.9)136.37.54(dd，8.0，8.0)164.66126.67.17(d，8.0)115.56.55(d,1.9)7136.9139.48163.5163.69142.6132.810136.18.04(d,9.8)135.78.01(d，9.8)11133.76.81(d,9.8)133.76.81(d,9.8)12189.2189.213114.4114.414159.2159.115115.56.80(d,8.2)115.76.81(d,8.3)16129.47.70(d,8.2)129.27.68(d，8.3)17133.1143.118144.6144.81964.964.720142.2142.321119.95.89(d,8.0)119.75.88(d,8.0)22138.47.09(dd,8.0,8.0)138.37.14(t,8.0)23117.46.67(d,8.0)117.26.67(d,8.0)24162.2162.025118.3118.326203.6203.62743.7a:2.87(dd，17.0，2.2)43.22.81(dd,16.8'3.5)(3:3.62(dd,17.0,6.4)3.51(dd，16.8,6.5)2838,62.82(m)37.32.90(m)2951.7a:3.39(dd,12.9，7.8)51.03.29(dd,13.2'7.5)P:2.77(dd,12.9,2.9)2.62(dd,13.2'1.9)3-OHl丄.50(s)12.39(s)14-OH10.68(s)10.66(s)24-OH12.08(s)12.18(s)5-OH10.95(brs)S:單峰，d:雙重峰，t:三重峰，dd:四重峰，m:多重峰，br:寬單峰炭殼菌聚酮A(dalesconolA)的X-ray單晶衍射分析C29H1806，M462，空間群為P2(l)/c,晶胞參數(shù)a=11.607(2)，b=11.607(2)，c=15.681(3)A，a=90.00。，(3=108.12(3)。，y=90.00。；晶胞體積V二2105.2(7)A3，晶胞內(nèi)分子數(shù)2=4。Rf和Rw值分別為0.0761，0.1242。用MoKa輻射、石墨單色器。用co掃描方式，獲得獨立衍射點4334個。在微機上用直接法(SHELXS-97)解析出炭殼菌聚酮A(dalesconolA)的單晶結(jié)構(gòu)(見附圖1)。炭殼菌聚酮B(dalesconolB)的X-ray單晶衍射分析C29H1807，M478,空間群為P2(l)/n，晶胞參數(shù)3=8.7130(17)，b=18.567(4)，c=13.317(3)A，a=90.00°，(3=94.78(3)°，y=90.00。；晶胞體積V-2146.9(7)A3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z-4。Rf和Rw值分別為0.1142，0.1853。用MoKa輻射、石墨單色器。用co掃描方式，獲得獨立衍射點4495個。在微機上用直接法(SHELXS-97)解析出炭殼菌聚酮B(dalesconolB)的單晶結(jié)構(gòu)(見附圖2)。實施例5:MTT法測定炭殼菌聚酮(dalesconols)免疫抑制活性及其細胞毒活性1)免疫抑制活性取Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性)，無菌摘取脾臟，置于盛有5mL、RPMI1640培養(yǎng)基(4°C)的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕撕碎，使細胞進入溶液并分散成單個細胞，過濾，4°C、1000rpm離心5min，除去上清，加入0.17MTris-0.75。/。NH4Cl溶液20mL，離心，以除去紅細胞，再以含10。/。胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，計數(shù)，調(diào)成5xl05cells/mL，細胞存活率大于99%。取5xl05cells/well置96孔培養(yǎng)板中，加入2.5|ig/mL刀豆蛋白(ConA)及不同濃度的供試化合物，同時設(shè)空白及陽性對照，置37'C，5%C02，培養(yǎng)72小時。終止培養(yǎng)前4h加入5mg/mL3-4,5-二甲基-2-噻唑-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)20^L，4小時后1000rpm離心5min，吸去上清，每孔加入200二甲亞砜，震蕩，待完全溶解后在酶聯(lián)免疫測定儀上于540nm測吸光度。所有實驗均設(shè)三次重復。2)細胞毒活性測定方法同上面免疫抑制活性測定方法，只是不加入刀豆蛋白(ConA)，其它都一樣。3)細胞生長抑制率計算方法不管是免疫抑制活性還是細胞毒活性，都采用下列公式計算細胞生長抑制率。生長抑制率=(l一用藥組平均OD值/對照組平均OD值)xl00%然后根據(jù)不同藥物濃度的生長抑制率計算出藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。免疫抑制活性測試結(jié)果(表2)表明炭殼菌聚酮(dalesconols)免疫抑制活性IC5o均小于0.6〃g/mL，可與陽性對照環(huán)孢霉素ACyA)相比較，且對正常的小鼠脾細胞沒有毒性(IC50均大于80^g/mL);炭殼菌聚酮A(dalesconolA)、(+)-炭殼菌聚酮A[(+)-dalescono1A]和炭殼菌聚酮B(dalesconolB)的選齊性(選擇指數(shù)SI均大于276)比陽性對照好，(-)-炭殼菌聚酮A[(-)-dalesconolA]、(+)-炭殼菌聚酮B[(+)-dalescono1B]和(-)-炭殼菌聚酮B[(-)-dalesconolB〗選擇性(選擇指數(shù)SI均大于138)可以與陽性對照相比較。表2.炭殼菌聚酮(dalesconols)對ConA所致小鼠脾細胞增殖的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>[a]藥物對ConA所致小鼠脾細胞增殖的抑制作用.[b]選擇指數(shù)(SI):為藥物對正常小鼠脾細胞的細胞毒作用(cytotoxicity)的ICso與藥物對ConA所致小鼠脾細胞增殖的抑制作用的ICso的比值。以上結(jié)果提示，炭殼菌聚酮(dalesconols)具有很強的免疫抑制活性且對正常細胞沒有毒性，因此本發(fā)明的炭殼菌聚酮(dalesconols)有望成功用于制備新型免疫抑制劑。權(quán)利要求1.一類炭殼菌聚酮，其特征是具有下述結(jié)構(gòu)通式其中1，3，5，7，9，11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29為碳原子序數(shù)編號，R1為H或OH，當R1為H時，是炭殼菌聚酮A；當R1為OH時，是炭殼菌聚酮B。2.—種權(quán)利要求1所述的炭殼菌聚酮A或炭殼菌聚酮B的制備方法，其特征是它包括下述歩驟步驟l.將新鮮的昆蟲腸道真菌光輪層炭殼菌菌絲體塊接種到ME培養(yǎng)基上，于搖床上，在140rpm、28'C條件下培養(yǎng)3天作為種子液，步驟2.然后將種子液接種于ME培養(yǎng)基中，在140rpm、28"C條件下發(fā)酵10天，歩驟3.將步驟2所得發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮干燥得黑色粗浸膏F1，步驟4.將粗浸膏F1懸浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經(jīng)濃縮得浸膏F2，步驟5.對浸膏F2進行硅膠柱層析，先用IO倍體積的氯仿洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸膏F3，步驟6.然后用體積比為100/1的氯仿/甲醇混合溶液洗脫，合并紅色部分洗脫液得紅色浸膏F4，步驟7.對浸膏F3，用甲醇重結(jié)晶得到外消旋炭殼菌聚酮A，歩驟8.對浸膏F4，進一步進行硅膠柱層析，用體積比為100/1氯仿/甲醇混合溶液洗脫得到外消旋炭殼菌聚酮B。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟7得到的外消旋炭殼菌聚酮A用手性高壓液相色譜法分離得到一對對映異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮A和(-)-炭殼菌聚酮A。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟8得到的外消旋炭殼菌聚酮B用手性高壓液相色譜法分離得到一對對映異構(gòu)體(+)-炭殼菌聚酮B和(-)-炭殼菌聚酮B。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的炭殼菌聚酮在制備免疫抑制劑藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的炭殼菌聚酮在制備免疫抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征是所述的炭殼菌聚酮是炭殼菌聚酮A或炭殼菌聚酮B。全文摘要一類新骨架炭殼菌聚酮(dalesconols)，它具有右述結(jié)構(gòu)通式(I)。其中1，3，5，7，9，11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29為碳原子序數(shù)編號，R¹為H或OH，當R¹為H時，是炭殼菌聚酮A；當R¹為OH時，是炭殼菌聚酮B。炭殼菌聚酮(dalesconols)對ConA所致小鼠脾細胞增殖有很強的抑制作用，且對正常的小鼠脾細胞沒有毒性，因此炭殼菌聚酮(dalesconols)可作為具有免疫抑制作用的化合物，并有望在制備相關(guān)新型藥物中得到應(yīng)用。文檔編號A61P37/06GK101367716SQ20071019196公開日2009年2月18日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日發(fā)明者張應(yīng)烙,強徐,譚仁祥,蔚趙,黎書華申請人:南京大學