山竹果殼提取物的藥物新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山竹果殼提取物的藥物新用途。該藥物用途是其在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用：1）預(yù)防和/或治療帕金森病的產(chǎn)品；2）預(yù)防和/或治療帕金森病人多巴胺神經(jīng)元樹突的退行性病變的產(chǎn)品；3）抗氧化應(yīng)激產(chǎn)品；4）預(yù)防和/或治療帕金森病氧化應(yīng)激的產(chǎn)品。藥效學(xué)實驗表明，山竹果殼提取物能夠使A30P帕金森病線蟲模型多巴胺神經(jīng)元樹突（部分）恢復(fù)；同時還可抑制魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病線蟲模型體內(nèi)的活性氧水平。進而證明，山竹果殼提取物具有較好的抗帕金森病作用及抗氧化應(yīng)激的作用。
【專利說明】山竹果殼提取物的藥物新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種山竹果殼提取物的藥物新用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森?。≒arkinson，s disease, PD)是僅次于阿爾茨海默病（Alzheimer' s disease, AD)的第二大神經(jīng)退行性疾病，它是一種黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺（dopamine, DA) 神經(jīng)功能受損所致多巴胺與乙酰膽堿平衡失調(diào)的一種慢性疾病，以運動遲緩、靜止性震顫 和強直為主要特征。ro病因至今未明，可能與年老、環(huán)境因素及遺傳因素有關(guān)，其發(fā)病機制 也涉及自由基、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體復(fù)合物I缺失、炎癥、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺 乏和凋亡等，在級聯(lián)生化反應(yīng)中這些機制相互作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。
[0003] 近年來，魚藤酮模型由于能夠同時再現(xiàn)ro的行為學(xué)改變和所有病理學(xué)特征而備 受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，魚藤酮誘導(dǎo)的模型更接近人類ro癥狀。魚藤酮來源于植物中的天然產(chǎn) 物，魚藤酮具有極強的親脂性，在不依賴DA轉(zhuǎn)運體的情況下自由通過血腦屏障和細胞膜并 聚集在細胞器如線粒體內(nèi)，是線粒體氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，特異性抑制呼吸鏈中的復(fù)合 物I。可選擇性抑制線粒體復(fù)合物I的活性產(chǎn)生活性氧和釋放凋亡誘導(dǎo)因子，引起氧化應(yīng)激 和細胞凋亡。實驗證實低劑量慢性給予魚藤酮可引起動物的ro癥狀。
[0004] a -synuclein被認為在帕金森病發(fā)病過程中發(fā)揮核心作用，表現(xiàn)在： I) a -synuclein突變體A53T、A30P、E46K在不同帕金森病家系中被鑒定出來；2) a -synuclein蛋白是帕金森病人Lewy小體的主要成分。a -synuclein基因突變可能與家 族帕金森病人黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元的退行性病變有關(guān)，所以，人們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是 野生型或突變型a -synuclein在小鼠或模式生物如果蠅、秀麗隱桿線蟲中過度表達制備 出動物模型來研究帕金森病發(fā)病機制或藥物作用機制。轉(zhuǎn)人a-synuclein突變基因(突變 位點A30P)的線蟲F 1D模型(簡稱A30P)由日本Tomoki Kuwahara等人制備而成的線蟲帕金 森病模型（Kuwahara T.，Koyama A.，Gengyo-Ando K. , et al. (2006). Familial Parkinson mutant alpha-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans[J]· J Biol Chem281(I):334_340)〇
[0005] 線蟲具有精確的解剖結(jié)構(gòu)，快速的復(fù)制周期，簡短的生活史以及半透明的胞體 (http://www. wormbook. org/)。線蟲雖小，卻能感受各種環(huán)境刺激（接觸、溫度、化學(xué)物質(zhì)、 離子、外激素等），并通過肌肉協(xié)調(diào)運動作出種種反應(yīng)，以完成趨利避害、進食、排糞、交配等 行為。還有證據(jù)表明線蟲的關(guān)聯(lián)記憶可保持一天以上。通過基因沉默或敲除等手段很容易 對其基因表達進行調(diào)節(jié)?？芍苯訉μ囟ǖ纳窠?jīng)元亞型，如多巴胺能神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)基因干預(yù)。 通過熒光指示劑容易實現(xiàn)在活體線蟲中觀察神經(jīng)元的完整性，并且可從幼蟲階段一直觀察 直到其衰老。這些特點使得線蟲成為研究衰老相關(guān)疾病強大的模式生物。線蟲的多巴胺神 經(jīng)元在細胞及分子水平上重點體現(xiàn)哺乳類多巴胺神經(jīng)元的特點。但不同于脊椎動物含有上 萬個多巴胺神經(jīng)元，雌雄同體的線蟲僅有8個多巴胺神經(jīng)元，易于觀察。其中6個位于大前 端，由兩對CEP (cephalic)和一對ADE (anterior deirid)神經(jīng)元組成。尾部還有兩個F1DE (posterior deirid)神經(jīng)元。它們表現(xiàn)出所有哺乳類動物與多巴胺生物合成、儲存、轉(zhuǎn)運及 傳遞信號的酶活性。
[0006] 山竹（Garcinia mangostana)又名山竹子、莽吉柿、鳳果，是藤黃科藤黃屬常綠喬 木山竹的果實，產(chǎn)于南洋熱帶地區(qū)，有"熱帶果后"之稱。外果皮中含有大量的粗纖維、果膠、 植物多酚類物質(zhì)，可以入藥。山竹外果皮在國內(nèi)的臨床應(yīng)用非常少，而作為泰國、緬甸、印度 等東南亞國家的傳統(tǒng)醫(yī)藥，山竹外果皮已經(jīng)被廣泛用于治療腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、 化膿、慢性潰瘍等疾病治療和抗?jié)儭⒖寡?、抗白血病和敗血病等?0世紀70年代，國外業(yè) 內(nèi)人士在山竹外果皮中相繼發(fā)現(xiàn)了一系列新的化學(xué)成分及非常有價值的生物活性成分。研 究發(fā)現(xiàn)山竹具有抗氧化活性、增強機體免疫力作用、抗炎及抗過敏作用、增強機體免疫力作 用等作用。目前尚未有將山竹果殼提取物用于治療帕金森病的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種山竹果殼提取物的藥物新用途。
[0008] 本發(fā)明所提供的山竹果殼提取物的藥物新用途是其在制備預(yù)防和/或治療帕金 森病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述帕金森病包括原發(fā)性帕金森病藥物和繼發(fā)性帕金森病。
[0009] 更進一步的，本發(fā)明還提供了山竹果殼提取物在制備預(yù)防和/或治療帕金森病人 多巴胺神經(jīng)元樹突的退行性病變的產(chǎn)品中的應(yīng)用；山竹果殼提取物在制備抗氧化應(yīng)激產(chǎn)品 中的應(yīng)用；以及山竹果殼提取物在制備預(yù)防和/或治療帕金森病氧化應(yīng)激的產(chǎn)品中的應(yīng) 用。
[0010] 上述廣品均包括藥物和保健品。
[0011] 本發(fā)明中所述山竹果殼提取物是從山竹干燥果殼中提取的有效成分。其提取方法 可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)對山竹果殼進行提取的常規(guī)操作，也可以采用體積分數(shù)為的80? 95%乙醇水溶液對山竹果殼進行回流提取處理，收集回流液，經(jīng)濃縮和干燥后得到山竹果殼 提取物。
[0012] 上述提取方法中，山竹果殼在提取前可先進行預(yù)處理：將山竹果殼清洗干凈后， 60°C干燥至恒重，將干燥的山竹果殼掰碎或粉碎后用于后期的提取。
[0013] 具體提取方法如下：將山竹果殼用體積分數(shù)為的80?95%乙醇水溶液進行回流提 取，收集回流液并濃縮，將得到的濃縮液真空干燥，得到山竹果殼提取物；所述回流、濃縮和 干燥均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
[0014] 所述回流提取至少進行一次，優(yōu)選提取2次，每次提取的時間可為1-2小時；每次 提取時，提取溶劑與所述山竹果殼的配比為8-10L: lkg。
[0015] 以山竹果殼提取物為有效成分制備的預(yù)防和/或治療帕金森病的藥物和/或保健 品，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016] 所述預(yù)防和/或治療帕金森病的藥物可通過口服、注射、噴射、滲透、吸收、物理或 化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹 后導(dǎo)入機體。
[0017] 以山竹果殼提取物為有效成分的藥物，需要的時候，在上述藥物中還可以加入一 種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘 合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。所述藥物的給藥方式 可以是但不局限于口服、靜注、肌注等方式，其劑型可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠 囊、口服液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0018] 藥效學(xué)實驗表明，山竹果殼提取物能夠使A30P帕金森病線蟲模型多巴胺神經(jīng)元 樹突(部分）恢復(fù)；同時還可抑制魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病線蟲模型體內(nèi)的活性氧水平。進而 證明，所述山竹果殼提取物具有較好的抗帕金森病作用及抗氧化應(yīng)激的作用，其單次服用 劑量范圍為1?200mg/kg。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為山竹果殼提取物對A30P線蟲帕金森病模型的干預(yù)作用，與對照組相比， P〈0.001。
[0020] 圖2為山竹果殼提取物對魚藤酮所致N2線蟲活性氧升高的抑制作用（RFU表示相 對熒光單位）;$$$魚藤酮vs.對照組，p〈0. 001 ;***山竹果殼提取物vs.魚藤酮，p〈0. 001。

【具體實施方式】
[0021] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中 所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從 商業(yè)途徑獲得。
[0022] 下述實施例中所用的實驗材料如下
[0023] 1、線蟲品系：菌株E. coli 0P50、野生型秀麗隱桿線蟲Bristol (N2)(參考文獻： Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans [J]. Genetics, 1974, 77:71 - 94)； 轉(zhuǎn)人α-synuclein突變基因（突變位點A30P)的線蟲H)模型（簡稱A30P)(參考文獻： Kuwahara T. , Koyama A. , Gengyo-Ando K. , et al. (2006). Familial Parkinson mutant alpha-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans[J], J Biol Chem281(I):334-340)
[0024] 2、藥物和試劑：瓊脂粉（日本協(xié)和株式會社），peptone、tryptone (OXOID)，魚藤酮 和DHR123 (sigma)，其余試劑均為國產(chǎn)。
[0025] 統(tǒng)計學(xué)分析：采用ANOVA方差檢驗分析藥物干預(yù)實驗結(jié)果，定量資料以JT±S表示； 采用兩樣本t檢驗方法比較分析組間差異。
[0026] 下述實施例中所使用的山竹果殼提取物是按照如下方法制備得到的：將山竹果殼 清洗干凈后，60°C干燥至恒重，稱重得到3kg ;將干燥的山竹果殼掰碎，加入體積分數(shù)為95% 的乙醇溶液分別以1:1〇，1:8的比例（kg/L)回流提取2次，每次提取時間為1.5小時，收集 回流液并濃縮，將得到的濃縮液真空干燥24小時，得到真空干燥的提取物；所述回流、濃縮 和干燥均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。
[0027] 實施例1、山竹果殼提取物對A30P帕金森病線蟲模型多巴胺神經(jīng)元樹突的影響線 蟲常規(guī)培養(yǎng)：
[0028] 模型組A30P線蟲，接種于涂布E. Coli 0P50的標準線蟲培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM)于 20°C恒溫培養(yǎng)。
[0029] 藥物干預(yù)實驗：
[0030] 同步化：用M9緩沖溶液將年輕成蟲洗至無菌EP管中，加適量裂解液（0. 5%次氯酸 鈉，0. 5N氫氧化鈉）裂解線蟲，置低速離心機上離心（3000rpm，lmin)，棄上清，再用M9緩沖 溶液沖洗線蟲2次，離心棄上清后用移液器吸取EP管底部線蟲滴于NGM的無菌區(qū)，約48小 時后裂解的線蟲體內(nèi)的受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同步化用于下一步實驗。
[0031] 同步化的線蟲接種到各組培養(yǎng)基中，20°C恒溫培養(yǎng)3天，加入不同濃度的山竹果 殼提取物（lmg/ml和0. lmg/ml)干預(yù)，20°C恒溫培養(yǎng)4天，挑取年輕成蟲置熒光顯微鏡下觀 察，統(tǒng)計多巴胺神經(jīng)元樹突(部分)恢復(fù)線蟲比例，結(jié)果見圖1。以上實驗獨立重復(fù)一次。由 圖1可知，lmg/ml山竹果殼提取物干預(yù)線蟲A30P 模型后，與對照組相比，多巴胺樹突缺 失表型線蟲存在比例明顯高于對照組（P < 0. 001)。
[0032] 實施例2、山竹果殼提取物對魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病線蟲模型體內(nèi)活性氧水平的影 響線蟲常規(guī)培養(yǎng)：
[0033] 野生型秀麗隱桿線蟲N2，接種于涂布E. Coli 0P50的標準線蟲培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM)于 20°C恒溫培養(yǎng)。
[0034] 藥物干預(yù)實驗：
[0035] 同步化：用M9緩沖溶液將年輕成蟲洗至無菌EP管中，加適量裂解液（0. 5%次氯酸 鈉，0. 5N氫氧化鈉）裂解線蟲，置低速離心機上離心（3000rpm，lmin)，棄上清，再用M9緩沖 溶液沖洗線蟲2次，離心棄上清后用移液器吸取EP管底部線蟲滴于NGM的無菌區(qū)，約48小 時后裂解的線蟲體內(nèi)的受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同步化用于下一步實驗。
[0036] 同步化的線蟲接種到各組培養(yǎng)基中，20°C恒溫培養(yǎng)3天，加入25 μ M魚藤酮誘導(dǎo)線 蟲Η)模型，同時加入不同濃度的山竹果殼提取物（lmg/ml和0. lmg/ml)干預(yù)，24h后，用Μ9 緩沖溶液清洗線蟲，加入終濃度為100 μ M DHR123(二氫羅丹明123)在30°C下避光孵育， 30min后M9清洗除去多余DHR123,上SYNERGY2多功能酶標儀檢測熒光度值（λ ex=485nm， λ em=520nm)的變化，以此反映線蟲體內(nèi)活性氧水平的改變。結(jié)果見圖2。由圖2可知，與 對照組相比，25 μ M魚藤酮可明顯增高線蟲體內(nèi)活性氧的水平（P〈0. 001);而給予0. lmg/ml 及l(fā)mg/ml山竹果殼提取物干預(yù)24h后，線蟲體內(nèi)活性氧水平明顯低于魚藤酮組（P〈0. 001， P〈0.001)。
【權(quán)利要求】
1. 山竹果殼提取物在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用：1)預(yù)防和/或治療帕金森病的產(chǎn)品；2) 預(yù)防和/或治療帕金森病人多巴胺神經(jīng)元樹突的退行性病變的產(chǎn)品；3)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)品； 4)預(yù)防和/或治療帕金森病氧化應(yīng)激的產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述帕金森病包括原發(fā)性帕金森病藥物 和繼發(fā)性帕金森病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物和/或保健品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于：所述山竹果殼提取物為山竹 果殼的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液優(yōu)選體積分數(shù)80?95%的乙醇水溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述山竹果殼提取物是按照下述方法提 取得到的：將山竹果殼用體積分數(shù)為的80?95%乙醇水溶液進行回流提取，收集回流液并 濃縮，將得到的濃縮液真空干燥，得到山竹果殼提取物； 其中，所述回流提取至少進行一次，優(yōu)選提取2次，每次提取的時間為1-2小時；每次提 取時，提取溶劑與所述山竹果殼的配比為8-10L: lkg。
6. -種產(chǎn)品，其活性成分為山竹果殼提取物； 所述產(chǎn)品選自下述任意一種：1)預(yù)防和/或治療帕金森病的產(chǎn)品；2)預(yù)防和/或治療 帕金森病人多巴胺神經(jīng)元樹突的退行性病變的產(chǎn)品；3)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)品；4)預(yù)防和/或治 療帕金森病氧化應(yīng)激的產(chǎn)品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述產(chǎn)品，其特征在于：所述帕金森病包括原發(fā)性帕金森病藥物和 繼發(fā)性帕金森病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物和/或保健品。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述山竹果殼提取物為山竹 果殼的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液優(yōu)選體積分數(shù)80?95%的乙醇水溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述山竹果殼提取物是按照下述方法提 取得到的：將山竹果殼用體積分數(shù)為的80?95%乙醇水溶液進行回流提取，收集回流液并 濃縮，將得到的濃縮液真空干燥，得到山竹果殼提取物； 其中，所述回流提取至少進行一次，優(yōu)選提取2次，每次提取的時間為1-2小時；每次提 取時，提取溶劑與所述山竹果殼的配比為8-10L: lkg。
【文檔編號】A61K36/185GK104435019SQ201310447244
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】李玉娟, 王丹巧, 于友華, 李連達 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心