本發(fā)明提供一種來(lái)源于綠海龜(C.mydas)的Cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH3及其制備方法，功能研究及其在抗感染、抗炎、消毒等藥物制備，海產(chǎn)養(yǎng)殖，畜牧業(yè)飼料，日?；瘖y品、保健品和食品等添加劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗菌肽廣泛分布于自然界各種生物體內(nèi)，是生物體天然防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。Cathelicidin是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)多變具有多功能的抗微生物肽家族，因在信號(hào)肽與成熟肽之間含有一段高度保守的cathelin而自成一個(gè)家族。目前在許多物種中都有發(fā)現(xiàn)，包括哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、以及魚類等。Cathelicidins家族抗菌肽在結(jié)構(gòu)上存在較大差異，但是也存在一些共同點(diǎn)。Cathelicidins家族抗菌肽都富含帶正電荷的賴氨酸和精氨酸殘基，很少含或者不含帶負(fù)電荷的天冬氨酸和谷氨酸殘基，因此cathelicidins抗菌肽均帶正電荷。Cathelicidins具有廣譜的抗微生物活性，不但對(duì)普通革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、霉菌、原蟲和部分有包膜病毒有很強(qiáng)的活性，而且對(duì)許多臨床耐藥微生物同樣具有作用。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽不僅能夠直接抑制和殺滅病源微生物，同時(shí)具有多種免疫調(diào)節(jié)活性，在宿主的天然和適應(yīng)性免疫中起著重要的作用。此外，cathelicidins具有許多其他生物學(xué)活性，如人類Cathelicidins LL-37和豬PR-39都具有血管原特性，參與傷口的治愈，誘導(dǎo)細(xì)胞趨化，結(jié)合內(nèi)毒素；PR-39還可以抑制巨噬細(xì)胞的凋亡；而LL-37可以抑制嗜中性白細(xì)胞的凋亡，還具有抗腫瘤活性等。因而Cathelicidins具有廣闊的應(yīng)用前景。

由于傳統(tǒng)抗生素的大量使用導(dǎo)致了耐藥病原微生物的迅速增長(zhǎng)，因此現(xiàn)在亟待開發(fā)出新型抗生素來(lái)對(duì)付世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的病原微生物耐藥性?？咕脑谧匀唤绶植紡V泛，是生物體產(chǎn)生的抵御外源性感染的內(nèi)源性物質(zhì)，歷經(jīng)數(shù)百萬(wàn)年而很少產(chǎn)生耐受性，具有作用迅速、強(qiáng)大、廣譜等特點(diǎn)?？咕娘@然已成為替代抗生素的理想模板。相比于普通抗生素，其抗菌譜廣，相對(duì)分子質(zhì)量小，熱穩(wěn)定性好，無(wú)免疫原性，不易引起耐藥性。此外，抗菌肽通過其獨(dú)特的作用機(jī)制和廣泛的生物學(xué)功能，對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒有作用，只對(duì)原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞有選擇性的殺傷作用，極有可能成為一種新的預(yù)防和治療動(dòng)物疾病的藥物。目前抗菌肽的在醫(yī)療、醫(yī)藥方面應(yīng)用研究有很多，并且已有許多新型藥物逐步邁入醫(yī)藥市場(chǎng)。例如，Pexiganan又名MSI-78，為非洲爪蟾抗菌肽Maganin的類似物，是第一個(gè)進(jìn)行商業(yè)開發(fā)的抗菌肽，由22個(gè)氨基酸殘基組成，用來(lái)治療膿皰病和糖尿病患者足底潰爛等，已經(jīng)進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段；源自α-黑素細(xì)胞刺激素的CZEN-002，8氨基酸殘基，用于治療陰道念珠菌，處于臨床II期；來(lái)自人BPI的Neuprex，用來(lái)治療腦膜炎，已經(jīng)III期成功；來(lái)源于 豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)；源于人的XMP.629，用于治療痤瘡，處于臨床III期等?？咕臉O有可能成為一種高效低毒且無(wú)殘留的抗菌、抗病毒的新藥物。

傳統(tǒng)的防腐劑廣泛應(yīng)用于加入食品、藥品、生物標(biāo)本、化妝品、保健品等，是抑制物質(zhì)腐敗的藥劑，即對(duì)以腐敗物質(zhì)為代謝底物的微生物的生長(zhǎng)具有持續(xù)的抑制作用。以食品防腐劑為例，其作用是一把“雙刃劍”，保證食物新鮮的同時(shí)，也有可能給人們的健康帶來(lái)一定的麻煩。在我國(guó)，食品生產(chǎn)中使用的防腐劑絕大多數(shù)都是人工合成的，使用不當(dāng)會(huì)有一定的副作用；有些防腐劑甚至含有微量毒素，長(zhǎng)期過量攝入會(huì)對(duì)人體健康造成一定的損害，廣泛使用的食品防腐劑苯甲酸為例，國(guó)際上對(duì)其使用一直存有爭(zhēng)議。而抗菌肽具有廣譜的抗菌作用，本身就是天然活性物質(zhì)，是無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留的綠色產(chǎn)品，其成分為易消化吸收的氨基酸，不會(huì)對(duì)人的身體造成傷害，是理想的傳統(tǒng)防腐劑的替代品。不僅如此，抗菌肽還可以作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代飼喂動(dòng)物所用的抗生素，將會(huì)減少抗生素對(duì)動(dòng)物體的危害，避免抗生素殘留對(duì)人類的傷害?？梢?，Cathelicidin在生物制藥、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品化工和化妝品等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

綠海龜(C.mydas)是體型最大的硬殼海龜之一，因其身上的脂肪為綠色而得名。其廣泛分布在熱帶及亞熱帶海域中，為草食性動(dòng)物。目前科研人員在很多兩棲爬行類動(dòng)物中得到了Cathelicidin抗菌肽的編碼基因，并以兩棲爬行動(dòng)物Cathelicidin抗菌肽為模板進(jìn)行了抗感染藥物的開發(fā)研究，但是關(guān)于綠海龜cathelicidin抗菌肽的研究和應(yīng)用還沒有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種來(lái)源于綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH3及其編碼基因，制備方法，功能研究及其在抗感染、抗炎、消毒等藥物制備，海產(chǎn)養(yǎng)殖，畜牧業(yè)飼料中的抗生素，以及日?；瘖y品、保健品和食品等中的防腐劑和抗氧化劑的替代中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

以綠海龜脾臟為原料，按照下述步驟分離純化Cm-CATH3：

選取綠海龜脾臟組織，洗滌，勻漿，獲得脾臟組織蛋白粗提物。隨后，Sephadex G-50凝膠過濾層析，用自動(dòng)部分收集器收集3mL/管，220nm檢測(cè)并收集各峰檢測(cè)抗菌活性，凍干備用。然后經(jīng)反相高壓液相層析(RP-HPLC)進(jìn)行梯度洗脫，收集各多肽樣品峰，用滅菌去離子水溶解，檢測(cè)抗菌活性。最后對(duì)得到多肽樣品進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析，包括采用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測(cè)定分 子量。利用等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)，用Edman降解法確定活性多肽氨基酸序列組成。其氨基酸序列為：蘇氨酸¹-精氨酸²-甘氨酸³-精氨酸⁴-色氨酸⁵-賴氨酸⁶-精氨酸⁷-苯丙氨酸⁸-色氨酸⁹-精氨酸¹⁰-甘氨酸¹¹-丙氨酸¹²-甘氨酸¹³-精氨酸¹⁴-苯丙氨酸¹⁵-苯丙氨酸¹⁶-精氨酸¹⁷-精氨酸¹⁸-組氨酸¹⁹-賴氨酸²⁰-谷氨酸²¹-賴氨酸²²-異亮氨酸²³-異亮氨酸²⁴-精氨酸²⁵-丙氨酸²⁶-丙氨酸²⁷-纈氨酸²⁸-天冬氨酸²⁹-異亮氨酸³⁰-纈氨酸³¹-亮氨酸³²-絲氨酸³³。

綠海龜抗微生物肽Cm-CATH3基因的克隆包括:

綠海龜肝臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選綠海龜抗菌肽Cm-CATH3基因。獲得陽(yáng)性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定。編碼Cm-CATH3前體cathelicidin的基因由492個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:

其中391到489位是編碼抗微生物肽Cm-CATH3的核苷酸序列。

抗微生物肽Cm-CATH3的化學(xué)制備方法：根據(jù)Cm-CATH3氨基酸序列，用全自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相C₁₈柱層析脫鹽、純化，然后用HPLC方法鑒定并確定其純度大于97％；用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(FAB-MS)測(cè)定其分子量；等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，最后用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

所述抗微生物肽Cm-CATH3可應(yīng)用在抗感染、抗炎、消毒等藥物制備，海產(chǎn)養(yǎng)殖，畜牧業(yè)飼料，日?；瘖y品、保健品和食品等添加劑中。

本發(fā)明的有益效果在于：基因克隆得到編碼綠海龜cathelicidin抗微生物肽Cm-CATH3的基因，并利用化學(xué)合成方法得到抗微生物Cm-CATH3樣品。體外活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cm-CATH3具有顯著地抑制細(xì)菌和真菌的作用，包括對(duì)臨床分離得到的耐藥菌也有很好的抑制作用；其抗菌譜廣，殺菌效果迅速；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，人工合成方便；還具有低溶血、低細(xì)胞毒、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)免疫原性等有益特點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例1 Cm-CATH3的分離純化：

(1)從動(dòng)物園獲取瀕臨死亡的綠海龜新鮮完整脾臟組織，用生理鹽水少許洗滌脾臟組織表面。勻漿后，用少量生理鹽水溶解，按PS液與正丁醇1：50(V/V)比例，把PS與正丁醇在室溫下攪拌60min，13000r/min，20min離心兩次，然后將沉淀凍干。隨后，第一步Sephadex G-50凝膠過濾層析：0.9g凍干粉用10ml 0.1M磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4,pH 6.0)緩沖液溶解，12000rpm離心10min，取上清液上樣于已平衡好的Sephadex G-50凝膠排阻色譜柱(1.6cm x 90cm,Amersham Bioscience)，用同樣緩沖液洗脫，流速3mL/10min，用自動(dòng)部分收集器收集3mL/管，220nm檢測(cè)并收集各峰檢測(cè)抗菌活性，凍干備用。

(2)反相高壓液相層析(RP-HPLC)：將Sephadex G-50凝膠排阻色譜分離得到的活性成分的峰重新溶解于純水中，4℃，12000rpm離心15min，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDS C18,30cm x 0.46cm)用乙腈(含1‰三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,215nm檢測(cè)多肽濃度。收集得到的各峰，凍干濃縮，用滅菌的去離子水重新溶解并進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。

(3)活性多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。純化的Cm-CATH3采用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測(cè)定分子量。利用等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)，用Edman降解法確定了其氨基酸序列組成為Cm-CATH3：TRGRWKRFWRGAGRFFRRHKEKIIRAAVDI VLS。

實(shí)施例2 Cm-CATH3前體基因的克隆及基因測(cè)序

第一步、綠海龜肝臟總RNA提取(以下實(shí)驗(yàn)所用器具和試劑均經(jīng)過處理，無(wú)RNase)：

A.從新鮮宰殺的綠海龜各種新鮮組織上分別剪下1g左右的小塊，分別放入液氮預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存；

B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內(nèi)加入少許液氮；將大約30mg的組織粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml離心管中，向其中分別加入400μl Buffer R-I(裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號(hào)針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入150μl Buffer R-П，渦旋振蕩15-30s，4℃,12000rpm離心5min；

C.將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混勻；將混合液分別轉(zhuǎn)移至離心吸附柱，室溫，6000rpm離心1min；棄廢液，然后加入500μl Buffer W1A，4℃,12000rpm離心1min；棄廢液，加入700μl BufferW2A,4℃,12000rpm離心1min； 棄廢液，加入700μl Buffer W2A,4℃,12000rpm離心1min；棄廢液,空管12000rpm離心1min；將離心吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，然后直接向吸附膜上滴加70-100μl Buffer TE，室溫放置1min，12000rpm離心1min洗脫得到總RNA；

第二步、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

第一鏈的合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：

A.在新的0.2ml PCR管(無(wú)DNase和RNase)中配制下列混合液：

混合均勻，短暫離心；PCR儀中72℃保溫5min后，然后42℃2min；短暫離心后，在上述管中配制如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

混合均勻后，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序：

42℃，90min；68℃，10min；4℃，保存。cDNA保存于-80℃。

第二鏈的合成：

第三步、采用半巢式PCR進(jìn)行綠海龜cathelicidin的基因克隆篩選

引物使用前先12000rpm離心5min,然后根據(jù)標(biāo)明的摩爾數(shù)加入相應(yīng)體積的ddH₂O溶解至20μM的濃度。以合成的肝臟cDNA為模板，以P1和In-Fusion SMARTer CDS為引物， 進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。在0.2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20μl)：

混勻后，短暫離心。PCR條件為：94℃變性5min；25個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

取上步PCR產(chǎn)物1μl加入99μl ddH₂O稀釋100倍作為模板，以P2和CDSⅢ為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。在0.2ml PCR管中先后加入下列試劑(總體積20μl)：

PCR條件為：94℃變性5min；25個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測(cè)序載體pMD19-T Vecter連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl₂-MgCl₂法制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取100μl轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有100μlg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上；表面晾干后，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè)插入片段大小。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377進(jìn)行核苷酸測(cè)序。

第四步、綠海龜cathelicidin的基因序列測(cè)定和結(jié)果：

編碼Cm-CATH3前體cathelicidin基因由492個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:

其中391到489是編碼抗微生物肽Cm-CATH3的核苷酸序列，其氨基酸序列為：蘇氨酸 ¹-精氨酸²-甘氨酸³-精氨酸⁴-色氨酸⁵-賴氨酸⁶-精氨酸⁷-苯丙氨酸⁸-色氨酸⁹-精氨酸¹⁰-甘氨酸 ^11-丙氨酸¹²-甘氨酸¹³-精氨酸¹⁴-苯丙氨酸¹⁵-苯丙氨酸¹⁶-精氨酸¹⁷-精氨酸¹⁸-組氨酸¹⁹-賴氨酸 ²⁰-谷氨酸²¹-賴氨酸²²-異亮氨酸²³-異亮氨酸²⁴-精氨酸²⁵-丙氨酸²⁶-丙氨酸²⁷-纈氨酸²⁸-天冬氨酸²⁹-異亮氨酸³⁰-纈氨酸³¹-亮氨酸³²-絲氨酸³³。

實(shí)施例3 Cm-CATH3的化學(xué)制備方法：

(1)根據(jù)編碼綠海龜cathelicidin基因推斷的成熟肽Cm-CATH3氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列。

(2)通過HPLC反相C₁₈柱層析對(duì)合成多肽進(jìn)行脫鹽純化：過程中使用柱子是4.6×250nm，Venusil XBP-C4；溶劑A是0.1％trifluoroacetic溶于100％乙腈，溶劑B是0.1％trifluoroacetic溶于100％水；梯度設(shè)為：0.01min(A 15％，B 85％)，25min(A 40％,B 60％)，25.1min(A 100％，B 0％)，30min(stop)；流速為1.0ml/min，波長(zhǎng)為220nm，體積為5μl，結(jié)果測(cè)得合成的多肽序列純度大于97％。

(3)分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)：首先將Cm-CATH3樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，然后用激光照射晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即通過離子的質(zhì)量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比來(lái)分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量，得到Cm-CATH3樣品的分子量是4070.85Da。

(4)等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)：配膠：膠液組成為載體兩性電解質(zhì)，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質(zhì)等，灌膠，加電極液，電泳，樣品收集進(jìn)行檢測(cè)，得到Cm-CATH3等電點(diǎn)。

(5)用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。合成的Cm-CATH3抗菌肽可以溶于滅菌超純水或PBS，用于藥理活性檢測(cè)。

實(shí)施例4 綠海龜抗微生物肽Cm-CATH3的藥理實(shí)驗(yàn)：

(1)Cm-CATH3抗菌活性檢測(cè)：

將化學(xué)合成的CM-CATH3以2mg/ml的濃度溶解在無(wú)菌超純水中；用接種環(huán)挑取新活化 的微生物，然后均勻涂布在新的LB瓊脂板上；將直徑0.5cm的圓形無(wú)菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然后向紙片上滴加10μl CM-CATH3樣品溶液；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h；觀察抑菌圈形成與否，將對(duì)Cm-CATH3敏感的菌株記錄下來(lái)。

(2)Cm-CATH3對(duì)敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的測(cè)定

該實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌液體LB作陰性對(duì)照，最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長(zhǎng)的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰性對(duì)照5％的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩器中200rpm培養(yǎng)10-16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液600nm光波處的吸光值，吸光值為1時(shí)，濃度大約為10⁹cfu/ml，將菌液用無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至10⁶cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制濃度梯度為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、的經(jīng)0.22μm孔徑膜過濾的Cm-CATH3樣品溶液(即24.4501、12.2250、6.1125、3.0563、1.5281、0.7641、0.3820、0.1910μM)，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀釋菌液，充分混勻后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-16h；使用酶標(biāo)儀測(cè)600nm吸光值或肉眼觀察；上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1.Cm-CATH3的最小抑菌濃度(MIC)

*MIC：最小抑菌濃度，濃度值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值；ND：2mg/ml劑量紙片抑菌試驗(yàn)無(wú)明顯活性；IS：臨床分離菌株。以上結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值。

由表1可見，Cm-CATH3具有廣譜的抗菌活性，革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌都有很好的殺傷作用。其中，Cm-CATH3對(duì)大腸桿菌08040726、金黃色葡萄球菌08032712、金黃色葡萄球菌08032615和枯草桿菌08042313的最小抑菌濃度最小，僅為0.2866μM。Cm-CATH3不僅對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株有抑制作用，對(duì)臨床分離耐藥菌也有很強(qiáng)的殺傷作用。其本身不易引起耐藥性，又有顯著地抑制耐藥菌生長(zhǎng)的作用，可作為抗微生物物質(zhì)應(yīng)用于制備抗微生物感染制劑，也可以替代水產(chǎn)養(yǎng)殖，動(dòng)物飼料中的抗生素，也可以替代廣泛使用于食品，化妝品等中的防腐劑和抗氧化劑。

(3)Cm-CATH3對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)：

大腸桿菌ATCC25922接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出。用接種環(huán)挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×10⁶CFU/ml，將樣品加入稀釋好的菌液中，使其終濃度為5×MIC(陰性對(duì)照加入相應(yīng)體積的滅菌超純水)。加入樣品的菌液迅速放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中，150rpm振蕩培養(yǎng)，分別于0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min取10μl菌液用滅菌的生理鹽水稀釋1×10³倍，取50μl涂布LB固體平板。平板放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16h，菌落計(jì)數(shù)。

表2.Cm-CATH3對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)

表2殺菌動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cm-CATH3殺菌作用迅速，在30min左右即可殺死所有細(xì)菌，且其殺菌作用是致死性的。與之相比，陽(yáng)性對(duì)照抗生素美羅培南作用速度較慢，作用90分鐘時(shí)仍有細(xì)菌存活。結(jié)果再次驗(yàn)證了Cm-CATH3的強(qiáng)烈抑菌效果，展現(xiàn)了其良好前景。