帶魚肝臟抗菌肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種魚類內(nèi)臟活性多肽的制備方法，尤其涉及帶魚肝臟抗菌肽的制備 方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)又叫抗微生物肽、多肽抗生素，是指氨基酸 數(shù)目小于1〇〇,具廣譜抗性的一類小肽。由于抗菌肽對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲等有著廣泛的抑制 作用，并且隨著越來越多的抗生素耐藥微生物的出現(xiàn)，使得抗菌肽在醫(yī)藥行業(yè)和食品添加 劑等領(lǐng)域有這更為良好的應(yīng)用前景。抗菌肽在廣義上是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微 生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子陽離子多肽?？咕挠缮锛?xì)胞特定基因編碼， 經(jīng)特定外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生。目前為止，世界上已知的抗菌肽共有1200多種，而以天然陽離 子抗菌肽作模板進(jìn)行人工合成的模擬肽有數(shù)千種。
[0004] 基于此，申請(qǐng)人以帶魚肝臟為原料，利用現(xiàn)代生物技術(shù)制備抗菌肽，既增加了帶魚 資源的利用率，減少了肝臟等下腳料對(duì)環(huán)境的危害，同時(shí)也為海洋抗菌藥物的開發(fā)提供候 選藥物。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝科學(xué)合理、易于操作、提取的多肽具 有良好抗菌效果的帶魚肝臟抗菌肽的制備方法。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種帶魚肝臟抗菌肽的制備方 法，其特征在于包括以下步驟： 1) 帶魚肝臟酶解物的制備：帶魚肝臟從冰凍帶魚中取出、解凍，用高速組織搗碎機(jī)勻 漿，然后按照固液比I g :8~IOmL加入磷酸鹽緩沖液（0. 02 mol/L，pH 6. 5~7. 5)混勻， 加熱至20~30°C，在功率為900W，頻率為30~50kHz超聲波發(fā)生器內(nèi)超聲提取90~120 min，按照肝臟質(zhì)量的0. 3~0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OXlO4 U/g)，于溫度55~ 65°C下酶解6~8 h，10 000 r/min離心25~30 min，取上清液采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超 濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，冷凍干燥，得超濾酶解物； 2) 帶魚肝臟抗菌肽的制備：將制備的帶魚肝臟超濾酶解物依次經(jīng)大孔樹脂除雜、凝膠 過濾層析、細(xì)胞膜色譜純化和反相高效液相色譜（RP-HPLC)制備，得到帶魚肝臟抗菌肽。
[0008] 作為優(yōu)選，所述步驟1)中的帶魚為帶魚（Aawffie/a)。
[0009] 作為優(yōu)選，所述步驟2)中的大孔樹脂除雜、凝膠過濾層析、細(xì)胞膜色譜純化和反相 高效液相色譜（RP-HPLC)制備的具體過程為： 大孔樹脂除雜：將得到的超濾酶解物用雙蒸水制成濃度為10~15 mg/mL溶液，以2~ 3 mL/min的流速加入到D201大孔樹脂層析柱，用2~3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)， 然后用3~5倍柱體積75%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液于50 °C以下低壓旋蒸除去乙醇后，冷凍 干燥得大孔樹脂制備酶解物。
[0010] 凝膠過濾層析：將上述大孔樹脂制備酶解物溶于三蒸水配成濃度為1〇~15 mg/ mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用三蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)225 nm下的吸光 度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì)大腸桿菌（ikcAericAia co/i)和巨大芽孢桿菌（ ?egaieriw?)抑制率最高組分為凝膠過濾層析酶解物。
[0011] 細(xì)胞膜色譜純化：將上述凝膠過濾層析酶解物用三蒸水配成80~100 μ g/mL的 溶液，加入到細(xì)胞膜色譜柱進(jìn)行純化，根據(jù)225 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì) 大腸桿菌co7i)和巨大芽抱桿菌抑制率最高組分為 細(xì)胞膜色譜純化酶解物。
[0012] RP-HPLC制備：將上述細(xì)胞膜色譜純化酶解物用雙蒸水配成80~ 100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)大腸桿菌 coJ7)和巨大芽孢桿菌?egaieriw?)的抑制率得1個(gè)高活性抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-Hi s-Pro (KVFffGLHP)〇
[0013] 優(yōu)選，所述細(xì)胞膜色譜條件為：細(xì)胞膜為巨大芽孢桿菌（SaciBw1S ?egaieriw?)的 細(xì)胞膜；進(jìn)樣量為15~20 μ L ;細(xì)胞膜色譜柱（150 _ X 4. 6_，5 μ m);柱溫為37 °C; 流動(dòng)相為三蒸水；紫外檢測(cè)波長225 nm ;流速為0. 3~0. 5 mL/min。
[0014] 優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為：進(jìn)樣量為15~20 μ L ;色譜柱為Zorbax C18 (250 _ X 4. 6_，5 μ m);流動(dòng)相為20%乙腈(含0. 1%三氟乙酸）；洗脫速度為0. 8~I. 0 mL/ min ;紫外檢測(cè)波長為225 nm〇
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： (1)本發(fā)明以帶魚肝臟為原料，提高了帶魚資源的利用率，減少了環(huán)境污染。
[0016] (2)本發(fā)明制備的抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP) 對(duì)革蘭氏陰性菌（G)(大腸桿菌（co/i)、焚光假單抱菌（ /7Wore1Scefl1S )、綠胺桿菌（aerwgiflosa))和革蘭氏陽性菌（G+)(金黃色葡 萄球（成r/ococciAs aareiAs)、巨大芽抱桿菌（膨辟ieria?)、藤黃八疊球菌 均有較強(qiáng)的抑制作用，且安全性高，可應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等行 業(yè)。
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【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明步驟流程示意圖； 圖2是本發(fā)明大孔樹脂制備酶解物的葡聚糖凝膠G-25層析圖； 圖3是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物（Fr. C)的細(xì)胞膜色譜圖。
[0019] 圖4是本發(fā)明的細(xì)胞膜色譜制備酶解物（Fr. C-I)的反相高效液相色譜（RP-HPLC) 圖。
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【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0022] -種帶魚肝臟抗菌肽的制備方法，制備工藝流程如下：帶魚肝臟一蛋白抽提、酶解 -超濾一大孔樹脂除雜一凝膠過濾層析一細(xì)胞膜色譜純化一高效液相色譜制備一抗菌肽。
[0023] 實(shí)施例： 1) 帶魚肝臟酶解物的制備：帶魚（Aawffie/a)肝臟從冰凍帶魚中取出、解凍， 用高速組織搗碎機(jī)勻漿，然后按照固液比I g: IOmL加入磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7. 0)混勻，加熱至25°C，在功率為900W，頻率為40kHz超聲波發(fā)生器內(nèi)超聲提取120 min， 按照肝臟質(zhì)量的0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OX IO4 U/g)，于溫度60°C下酶解8 h，10 000 r/min離心30 min，取上清液采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa 部分，冷凍干燥，得超濾酶解物； 2) 帶魚肝臟抗菌肽的制備：將制備的帶魚肝臟超濾酶解物依次經(jīng)大孔樹脂除雜、凝膠 過濾層析、細(xì)胞膜色譜純化和反相高效液相色譜（RP-HPLC)制備，得到帶魚肝臟抗菌肽。
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