本發(fā)明屬于中藥糖蛋白提取領(lǐng)域，涉及一種提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法。

背景技術(shù)：

糖蛋白(glycoprotein)是一類由寡糖與多肽鏈或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合蛋白，廣泛存在于植物中，并以不同的形式存在，對(duì)于生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)起著十分重要的作用，是生物體內(nèi)必不可少的生物大分子之一。研究報(bào)道指出，糖蛋白具有抗癌、抗氧化、抗疲勞、抑制腫瘤等多方面的生物活性及生理功能?；谔堑鞍椎纳飳W(xué)功能漸漸被挖掘，以多糖結(jié)構(gòu)、功能為核心的糖工程被認(rèn)為是繼蛋白質(zhì)工程、基因工程后生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中又一巨大的科學(xué)問(wèn)題，吸引著眾多學(xué)科領(lǐng)域的探討研究。

由于糖蛋白是以蛋白質(zhì)為主，只是在某些部位連接有一些短的糖鏈基團(tuán)，一般可采用提取純化蛋白質(zhì)的方法來(lái)提取糖蛋白。大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，并且糖蛋白中的糖鏈具有高度親水性，所以大多數(shù)糖蛋白均以水溶液提取為主，常用的方法有水提取法、稀鹽溶液或緩沖溶液提取法、酸堿溶液提取法、醇提取法、酶解液提取法等，具體方法可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求類別選擇。但由于糖蛋白活性的保持需要一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定、平衡的生存環(huán)境，所以在提取糖蛋白的過(guò)程中，要嚴(yán)格控制提取條件，以免破壞糖蛋白的結(jié)構(gòu)及生物活性[劉興華,趙浩如.天然糖蛋白的提取、分離與純化[M].藥學(xué)進(jìn)展,2006,30(12):542-547.]?？梢哉f(shuō)，糖蛋白的分離純化是一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)并需要重復(fù)摸索的過(guò)程，通常需要進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定不同來(lái)源糖蛋白各自特異的分離純化條件。

遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia Willd.)作為歷代藥食同源的藥材之一，被稱為“養(yǎng)命之要藥”，具有安神益智、祛痰、消腫的功能，可用于心腎不交引起的失眠多夢(mèng)、健忘驚悸，神志恍惚，咳痰不爽，瘡瘍腫毒，乳房腫痛等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物類、海洋類糖蛋白的研究較多，但針對(duì)中藥糖蛋白的研究尚不全面。目前還沒(méi)有提取、分析研究遠(yuǎn)志藥材中的糖蛋白類成分的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法。

本發(fā)明所提供的提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法，具體可包括如下步驟：

(a)將遠(yuǎn)志粉碎并脫脂；

(b)將經(jīng)步驟(a)脫脂后的遠(yuǎn)志粉末在pH為7.5-8.2的緩沖液中浸提；進(jìn)行所述浸提時(shí)的溫度為25-40℃；進(jìn)行所述浸提時(shí)所述遠(yuǎn)志粉末與所述緩沖液的配比為1g：7.5-9mL；

(c)將步驟(b)所得浸提液過(guò)濾，除去濾液中的游離蛋白，得到遠(yuǎn)志糖蛋白粗提取液。

在步驟(b)中，所述緩沖液的pH進(jìn)一步可為7.5-8.0；進(jìn)行所述浸提時(shí)所述遠(yuǎn)志粉末與所述緩沖液的配比進(jìn)一步可為1g：7.5-8.5mL。

更加具體的，所述緩沖液的pH最好為7.85；進(jìn)行所述浸提時(shí)的溫度最好為33℃；進(jìn)行所述浸提時(shí)所述遠(yuǎn)志粉末與所述緩沖液的配比最好為1g：8.0mL。

在步驟(b)中，所述緩沖液具體可為Tris-HCl緩沖液；所述緩沖液中最好含有濃度為0.05-0.1mol/L的NaCl；進(jìn)行所述浸提的時(shí)間具體可為1-2h。

更加具體的，所述緩沖液中NaCl的濃度最好為0.1mol/L；進(jìn)行所述浸提的時(shí)間最好為1.5h。

在步驟(a)中，所述“將遠(yuǎn)志粉碎并脫脂”具體可通過(guò)包括如下步驟的方法實(shí)現(xiàn)：將遠(yuǎn)志粉碎后的粉末用5倍量的石油醚30-60(即30-60℃沸程規(guī)格的石油醚)，40-45℃水浴脫脂1h，過(guò)濾，向?yàn)V渣中繼續(xù)加入3倍量的所述石油醚30-60，40-45℃水浴脫脂0.5h，過(guò)濾，濾渣自然晾干，即得脫脂后的遠(yuǎn)志粉末。其中，“n倍量”的單位為mL/g，表示1g遠(yuǎn)志粉末應(yīng)加入的所述石油醚30-60毫升數(shù)為n。如5倍量表示1g遠(yuǎn)志粉末應(yīng)加入5ml所述石油醚30-60。

其中，在將遠(yuǎn)志粉碎后，加入5倍量的石油醚30-60前可還包括用對(duì)遠(yuǎn)志粉末進(jìn)行過(guò)篩的步驟。具體可為過(guò)50目篩(3號(hào)篩，50目，孔徑大小為355±13μm)。

在步驟(c)中，所述除去濾液中的游離蛋白的方法具體可為經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白。其中，所述經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白的具體方法可參見(jiàn)“趙梅,丁霄霖.甘薯糖蛋白脫游離蛋白的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,01:89-91.”一文。

另外，本發(fā)明所提供的提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法在步驟(c)之后，還可包括如下“步驟(d)”或“步驟(d)和(e)”或“步驟(d)、(e)和(f)”：

(d)將所述遠(yuǎn)志糖蛋白粗提取液在無(wú)NaCl的pH7.85的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液中透析24h，離心(如常溫3500r/min離心10分鐘)，取上清液。

該步驟的目的是除去其中的一些無(wú)機(jī)鹽、色素、低聚糖等小分子雜質(zhì)。

(e)將步驟(d)所得的上清液用DEAE-52陰離子交換層析，收集用0.1mol/LTris-HCl緩沖液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl洗脫所得的洗脫液。

(f)將步驟(e)所得洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，即得遠(yuǎn)志糖蛋白。

在步驟(e)中，將預(yù)處理過(guò)的DEAE-52用緩沖液A(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液pH＝7.85不含NaCl)平衡；再以2個(gè)柱體積緩沖液A洗脫未被吸附的糖蛋白液，并收集；然后分別依次以2倍柱體積的緩沖液B(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液pH＝7.85含0.06mol/L NaCl)、緩沖液C(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液pH＝7.85含0.1mol/L NaCl)、緩沖液D(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl)、緩沖液E(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液pH＝7.85含0.5mol/L NaCl)進(jìn)行階段洗脫，收集各階段的洗脫液。

在步驟(f)中，所述冷凍干燥具體可為：-86℃冷凍24h以上。

本發(fā)明所提供的提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法即為制備含有遠(yuǎn)志糖蛋白的提取物的方法或者為制備遠(yuǎn)志糖蛋白的方法。

利用本發(fā)明所提供的提取遠(yuǎn)志糖蛋白的方法所得的含有遠(yuǎn)志糖蛋白的提取物或者遠(yuǎn)志糖蛋白，以及所述提取物或者遠(yuǎn)志糖蛋白在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

(1)制備具有抗衰老活性的產(chǎn)品；

其中，所述抗衰老活性可體現(xiàn)為如下中的至少一種：減緩D-半乳糖導(dǎo)致的臟器萎縮；提高血清中SOD和/或CAT的活力；提高腦組織中SOD的活力；降低腦組織中MDA的含量。

(2)制備具有免疫促進(jìn)活性的產(chǎn)品。

其中，所述免疫促進(jìn)活性可體現(xiàn)為如下中的至少一種：減緩免疫器官的萎縮；提高血清中IL-2和/或IL-6的含量。

在本發(fā)明中，所述遠(yuǎn)志具體為中藥材遠(yuǎn)志。

本發(fā)明采用響應(yīng)曲面法對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了一套提取效率高、條件簡(jiǎn)便的提取工藝，在此提取條件下，遠(yuǎn)志總糖蛋白提取率均值可高達(dá)5.96％。同時(shí)，本發(fā)明確定了遠(yuǎn)志糖蛋白的分離方法，因此，本試驗(yàn)從蛋白穩(wěn)定性、提取得率與分離三個(gè)方面進(jìn)行了綜合考量。本發(fā)明不僅可以提高遠(yuǎn)志藥材的使用價(jià)值，而且可以拓展免疫類新型藥物或新型保健品的開(kāi)發(fā)渠道。

附圖說(shuō)明

圖1為蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為緩沖液pH值對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

圖3為溫度對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

圖4為鹽濃度對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

圖5為液料比對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

圖6為提取時(shí)間對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

圖7為pH值、溫度的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。

圖8為pH、液料比的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。

圖9為溫度、液料比的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。

圖10為五種緩沖液的洗脫曲線。A為Buffer A的洗脫曲線；B為Buffer B的洗脫曲線；C為Buffer C的洗脫曲線；D為Buffer D的洗脫曲線；E為Buffer E的洗脫曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

遠(yuǎn)志(河北百合中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：815020161)經(jīng)山西中醫(yī)學(xué)院王兵老師鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd的干燥根，符合2015版《中國(guó)藥典》相應(yīng)藥材項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，藥材實(shí)物與名稱相符，且質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。

SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，4周齡，體重20±2g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004)，適應(yīng)飼養(yǎng)5天，3天換一次墊料，飼養(yǎng)期間自由攝食及飲水。

實(shí)施例1、響應(yīng)曲面試驗(yàn)法優(yōu)化遠(yuǎn)志糖蛋白的提取工藝

一、藥材預(yù)處理(粉碎脫脂)

取潔凈的遠(yuǎn)志藥材用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)3號(hào)篩(50目，孔徑大小為355±13μm)。將過(guò)篩的遠(yuǎn)志粉末置于圓底燒瓶中，加入5倍量的石油醚30-60(即30-60℃沸程規(guī)格的石油醚)(5倍量指液料比，單位為mL/g，比如1g藥材應(yīng)加入5mL的石油醚)，40-45℃水浴脫脂1h，過(guò)濾，藥渣繼續(xù)加入3倍量(具體含義參照以上“5倍量”)的所述石油醚30-60，同樣條件下脫脂0.5h，過(guò)濾，將脫脂后的遠(yuǎn)志粉末自然晾干，備用。

二、蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定遠(yuǎn)志糖蛋白中的蛋白質(zhì)含量。將牛血清蛋白配置成0.2mg·mL^-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，各取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，由蒸餾水補(bǔ)足1mL后，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，靜置5min，于波長(zhǎng)595nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。

結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y＝5.785x+0.0272(r＝0.9991)，其中x為蛋白質(zhì)的濃度(單位為mg·mL^-1，線性范圍：0.04～0.12mg·mL^-1)，y為吸光度值，r＞0.999，表明該回歸方程具有較好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。

三、單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、緩沖液pH值的影響

稱取步驟一脫脂后的遠(yuǎn)志粉末各5g，分別加入pH＝7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液(含有NaCl，NaCl濃度為0.1mol·L^-1)40mL，于40℃水浴條件下浸提1.5h，過(guò)濾，提取液經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白[參考文獻(xiàn)：趙梅,丁霄霖.甘薯糖蛋白脫游離蛋白的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,01:89-91.]，以所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白含量為指標(biāo)，根據(jù)步驟二建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線考察pH值對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。提取率＝所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白的總質(zhì)量/所用脫脂后的遠(yuǎn)志粉末的總質(zhì)量×100％。

結(jié)果如圖2所示，由圖可知，pH從7到8，蛋白得率呈上升趨勢(shì)，之后開(kāi)始下降。提取液pH值的改變可以直接影響到蛋白質(zhì)的帶電情況，進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)在溶劑中的溶解能力，由于糖蛋白中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)偏低，故適宜采用偏堿性的環(huán)境進(jìn)行提取，但pH值不宜過(guò)大，否則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，因此選擇pH＝8作為最佳提取pH值。

2、提取溫度的影響

根據(jù)步驟1的試驗(yàn)結(jié)果，稱取步驟一脫脂后的遠(yuǎn)志粉末各5g，加入pH＝8的Tris-HCl緩沖液(含有NaCl，NaCl濃度為0.1mol·L^-1)40mL，分別于0、20、40、60、80、100℃條件下浸提1.5h，過(guò)濾，提取液經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白(具體方法同上)，以所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白含量為指標(biāo)，根據(jù)步驟二建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線考察提取溫度對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

結(jié)果如圖3所示，由圖可知，0-40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，糖蛋白得率不斷增加，當(dāng)溫度超過(guò)40℃之后，隨著溫度的升高得率反而開(kāi)始下降，最佳提取溫度為40℃。在適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，可加速溶劑對(duì)藥物成分的解吸和溶解，但是溫度過(guò)高會(huì)使雜質(zhì)類成分也溶解出來(lái)，從而影響糖蛋白的得率，而且也會(huì)給后期的分離純化增加難度，所以必須適當(dāng)控制提取溫度。

3、鹽濃度的影響

根據(jù)步驟1和2的試驗(yàn)結(jié)果，稱取步驟一脫脂后的遠(yuǎn)志粉末各5g，分別加入pH＝8的Tris-HCl緩沖液(含有NaCl，NaCl濃度設(shè)置如下梯度：0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol·L^-1)40mL，于40℃條件下浸提1.5h，過(guò)濾，提取液經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白(具體方法同上)，以所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白含量為指標(biāo)，根據(jù)步驟二建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線考察緩沖液中鹽濃度對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取率的影響。

結(jié)果如圖4所示，由圖可知，鹽濃度在0.05～0.10mol·L^-1，糖蛋白得率相對(duì)較高，之后隨著鹽濃度的增大，得率反而呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，鹽濃度在0.10mol·L^-1時(shí)，蛋白得率最高。低濃度鹽溶液可以增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，使蛋白質(zhì)溶解度增大，但是當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定程度時(shí)，反而會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象，影響蛋白得率。

4、液料比的影響

根據(jù)步驟1-3的試驗(yàn)結(jié)果，稱取步驟一脫脂后的遠(yuǎn)志粉末各5g，分別加入pH＝8的Tris-HCl緩沖液(含有NaCl，NaCl濃度為0.1mol·L^-1)30、40、50、60、70mL，于40℃條件下浸提1.5h，過(guò)濾，提取液經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白(具體方法同上)，以所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白含量為指標(biāo)，根據(jù)步驟二建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線考察液料比對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白提取效果的影響。

結(jié)果如圖5所示，由圖可知，液料比在6～8mL·g^-1，蛋白得率呈上升態(tài)勢(shì)，但8mL·g^-1以后基本保持不變，這是由于隨著液料比的增大可以增加藥材與溶劑的接觸面積，使目標(biāo)成分更充分地溶解出來(lái)，但是液料比過(guò)大，雜質(zhì)溶出過(guò)多，對(duì)后期的濃縮及分離純化都會(huì)增加難度，所以，應(yīng)該控制合適的液料比例。

5、提取時(shí)間的影響

根據(jù)步驟1-4的試驗(yàn)結(jié)果，稱取步驟一脫脂后的遠(yuǎn)志粉末各5g，加入pH＝8的Tris-HCl緩沖液(含有NaCl，NaCl濃度為0.1mol·L^-1)40mL，分別于40℃條件下浸提0.5、1、1.5、2、2.5h，過(guò)濾，提取液經(jīng)Sevage法脫除游離蛋白(具體方法同上)，以所得脫除游離蛋白后的提取液中蛋白含量為指標(biāo)，根據(jù)步驟二建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線考察提取時(shí)間對(duì)糖蛋白提取率的影響。

結(jié)果如圖6所示，由圖可知，提取時(shí)間在0.5～1.5h內(nèi)增加趨勢(shì)較為明顯，1.5h后得率開(kāi)始下降，趨勢(shì)較緩，這是由于剛提取的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶出率尚未達(dá)到平衡，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出的成分不斷增加；1.5h后，溶出率達(dá)到平衡，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑開(kāi)始揮散，溶出率開(kāi)始下降，最佳的提取時(shí)間應(yīng)保持在1.5h左右。

四、響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化遠(yuǎn)志糖蛋白提取條件

1、響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)步驟三的單因素考察結(jié)果，選擇其中影響較大的3個(gè)因素(pH值、溫度和液料比)作為響應(yīng)變量，以蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)方案，并根據(jù)單因素考察結(jié)果選定各個(gè)因素的零水平和波動(dòng)區(qū)間，本試驗(yàn)因素與水平的取值如表1所示。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，經(jīng)Design-Expert V 8.0.6軟件分析處理，設(shè)計(jì)出3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)中，緩沖液中鹽濃度設(shè)定為0.1mol·L^-1，提取時(shí)間設(shè)定為1.5小時(shí)，遠(yuǎn)志糖蛋白的具體提取方法及糖蛋白提取率的計(jì)算方法參見(jiàn)步驟三進(jìn)行。

表1因素水平表

表2響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案與試驗(yàn)結(jié)果

2、建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果為表3所示。

表3回歸模型的方差分析結(jié)果

pH值(A)、溫度(B)、液料比(C)與蛋白得率(Y)之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y＝5.99-0.33A-0.86B-2.500E-0.03C+0.17AB-0.16AC+0.14BC-1.21A²-1.19B²-2.06C²，R²＝0.9902，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r＝0.9951，說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合良好，試驗(yàn)誤差較??；從上表可以看出，整體模型的P＝0.0002(P<0.001)，表明該二次方程模型比較顯著；模型失擬項(xiàng)的P值為0.7659>0.05，表明模型選擇較為合適，整體說(shuō)明應(yīng)用該響應(yīng)曲面模型預(yù)測(cè)遠(yuǎn)志糖蛋白的提取試驗(yàn)是可行的。由回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，因素A(P<0.05)與因素B(P<0.05)對(duì)提取效果的線性效應(yīng)顯著，因素C(P>0.05)差異無(wú)顯著性；因素A²、B²、C²(P<0.05)對(duì)提取效果的曲面效應(yīng)均顯著；因素AB、AC、BC(P>0.05)對(duì)提取效果的交互影響不顯著。

3、響應(yīng)曲面圖與等高值線圖的分析

經(jīng)Design-expert軟件分析得到響應(yīng)曲面圖與等高值線圖。

圖7至圖9分別顯示不同交叉因素對(duì)遠(yuǎn)志糖蛋白得率的交互影響趨勢(shì)。等高線圖可以直觀地反映兩個(gè)因素間交互作用的顯著程度，圓形表示交互作用不明顯，橢圓越扁平則代表兩因素間的交互作用越顯著。橢圓越大代表在該圓上取值時(shí)，蛋白得率越低，反之，在越靠近中心的較小橢圓上取值，蛋白得率越高。圖8和圖9中的橢圓明顯扁平于圖7，說(shuō)明pH值和液料比、溫度和液料比的交互影響明顯高于pH值和溫度的交互影響。

由圖7可得，在液料比為8mL·g^-1、pH值在7.5～8、溫度在25～40℃范圍時(shí)，遠(yuǎn)志蛋白的提取率最高；由圖8可得，在溫度為40℃、pH值在7.5～8.2、液料比在7.5～9mL·g^-1范圍時(shí)，遠(yuǎn)志蛋白的提取率最大；由圖9可得，在pH值為8、溫度在25～40℃、液料比在7.5～8.5mL·g^-1范圍時(shí)，遠(yuǎn)志蛋白的提取率最大。以上結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致，說(shuō)明響應(yīng)曲面試驗(yàn)分析蛋白提取率的方法比較可行。

應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6軟件預(yù)測(cè)試驗(yàn)的最優(yōu)化條件為：A＝7.84、B＝32.51、C＝7.99，此條件下遠(yuǎn)志蛋白的得率預(yù)計(jì)達(dá)到6.17％。考慮到實(shí)際操作條件，將提取方案修正為：pH＝7.85、溫度33℃、液料比8mL·g^-1。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)該結(jié)果進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到蛋白得率分別為5.92％、6.01％、5.96％，平均值高達(dá)5.96％，與理論預(yù)測(cè)結(jié)果相差不大，表明該回歸模型可以較好地預(yù)測(cè)遠(yuǎn)志糖蛋白得率。

實(shí)施例2、遠(yuǎn)志糖蛋白的分離純化研究

1、除雜

采用實(shí)施例1確定的最優(yōu)提取方案(pH＝7.85、溫度33℃、液料比8mL·g-1、緩沖液中鹽濃度0.1mol·L-1，提取時(shí)間1.5小時(shí))，按照實(shí)施例1步驟三中的相關(guān)步驟獲得脫除游離蛋白后的提取液。然后將所得脫除游離蛋白后的提取液用Cell-Sep即用型透析袋(12KDa)透析除去其中的一些無(wú)機(jī)鹽、色素、低聚糖等小分子雜質(zhì)，具體操作如下：將所得脫除游離蛋白后的提取液分裝于透析袋中，將透析袋放置在0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH＝7.85，無(wú)NaCl)透析24h，透析結(jié)束后將提取液常溫3500r/min離心10分鐘，取上清液。

2、遠(yuǎn)志糖蛋白的DEAE-52陰離子交換層析

將預(yù)處理過(guò)的DEAE-52填料裝柱，用平衡緩沖液平衡幾個(gè)柱體積，取適宜量的糖蛋白粗提液(即步驟1離心后的上清液)上樣，待樣品完全吸附后，先用平衡緩沖液洗脫未被吸附的糖蛋白，再依次用不同離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫各個(gè)組分的糖蛋白，洗脫液分管收集，分別檢測(cè)各管中蛋白含量和糖含量，收集重合峰。具體操作步驟如下：

A、根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置不同離子濃度的緩沖液

Buffer A：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液PH＝7.85不含NaCl(即平衡緩沖液)；

Buffer B：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液PH＝7.85含0.06mol/L NaCl；

Buffer C：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液PH＝7.85含0.1mol/L NaCl；

Buffer D：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液PH＝7.85含0.3mol/L NaCl；

Buffer E：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液PH＝7.85含0.5mol/L NaCl。

B、DEAE-52陰離子交換劑的預(yù)處理

取一定量(20g)的DEAE-52填料，加入一定體積Buffer A(6mL/g，表示每g的DEAE-52填料加入6mL的Buffer A，輕輕搖動(dòng)攪拌2-3min，讓懸液沉降并傾出上清液中的細(xì)小顆粒，然后再次使用Buffer A(6mL/g，含義同上)使離子交換劑松散，溶脹1小時(shí)后用于裝柱。

C、裝柱

將玻璃層析柱洗凈后垂直安裝于支架上，裝入約10mL Buffer A，打開(kāi)下嘴閥讓緩沖液慢慢滴出(目的：排除空氣)，同時(shí)，將懸浮于Buffer A中處理好的DEAE-52填料一邊攪動(dòng)一邊倒入層析柱中，讓其自然沉降到全部加入為止。裝柱時(shí)最好一次倒入，若分次倒入，則需在再次添加前將界面處的交換劑攪起，以保證柱床不分節(jié)，柱面平整，柱中無(wú)氣泡。待液面離填料沉降面1cm后，關(guān)閉下嘴閥。

D、平衡

用Buffer A以1.0mL/min的流速，平衡3個(gè)柱體積，待填料基本不再沉降時(shí)，關(guān)閉下嘴閥。

E、上樣

將步驟1透析后的樣品液(離心后所得的上清液)吸取適宜量10mL均勻加到纖維素柱面上，打開(kāi)下嘴閥，待降至柱面后關(guān)閉，加入少量Buffer A沖洗殘留于柱內(nèi)壁的樣品，最后在柱面上留一層1cm左右的Buffer A，吸附至少12小時(shí)以上。

F、洗脫

先以2個(gè)柱體積Buffer A洗脫未被吸附的糖蛋白液，并收集；然后分別依次以2倍柱體積的Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E進(jìn)行階段洗脫，并收集各階段的洗脫液。

G、檢測(cè)各管蛋白和多糖含量，并繪制洗脫曲線

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定遠(yuǎn)志糖蛋白中的蛋白質(zhì)含量，采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖蛋白中多糖的含量。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從以上5個(gè)不同離子強(qiáng)度洗脫液所得到的洗脫曲線來(lái)看，遠(yuǎn)志糖蛋白粗品在DEAE-52陰離子交換柱上利用Buffer D溶液洗脫得到了有效的分離，產(chǎn)生了明顯的蛋白和多糖的重疊峰，收集多糖和蛋白重疊的高峰部分洗脫液，透析、冷凍干燥(-86℃冷凍24h以上)即得遠(yuǎn)志糖蛋白(圖10)。

實(shí)施例3、遠(yuǎn)志糖蛋白的體內(nèi)抗衰老作用研究

一、遠(yuǎn)志總糖蛋白的制備

采用實(shí)施例1確定的最優(yōu)提取方案(pH＝7.85、溫度33℃、液料比8mL·g-¹、緩沖液中鹽濃度0.1mol·L^-1，提取時(shí)間1.5小時(shí))，按照實(shí)施例1步驟三中的相關(guān)步驟獲得脫除游離蛋白后的提取液。然后將所得脫除游離蛋白后的提取液用Cell-Sep即用型透析袋(12KDa)透析除去其中的一些無(wú)機(jī)鹽、色素、低聚糖等小分子雜質(zhì)，具體操作如下：將所得脫除游離蛋白后的提取液分裝于透析袋中，將透析袋放置在0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH＝7.85，無(wú)NaCl)透析24h，透析結(jié)束后將提取液常溫3500r/min離心10分鐘，取上清液分裝于培養(yǎng)皿中，-86℃冷凍干燥24h，取出即得遠(yuǎn)志總糖蛋白凍干粉，備用。

二、動(dòng)物分組、造模、給藥

選取SPF級(jí)昆明小鼠84只，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、遠(yuǎn)志糖蛋白低、中、高劑量組，每組14只，雌雄各半。采用邊造模邊給藥的方法，除空白組外，其余各組均頸背部皮下注射D-半乳糖1.25g/kg(每天每千克體重的小鼠注射D-半乳糖1.25g)，建立衰老模型[參考文獻(xiàn)：林映雪,莊朋偉,張金保,等.D-半乳糖劑量及小鼠性別對(duì)衰老模型的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,03:144-147.]；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃維生素E溶液1.25g/kg(每天每千克體重的小鼠灌胃維生素E 1.25g)，低、中、高劑量組分別灌胃遠(yuǎn)志總糖蛋白100mg/kg體重、200mg/kg體重、400mg/kg體重(均為每天的給藥劑量)，其余各組給予同等劑量蒸餾水，各組自由攝食飲水，連續(xù)4周。

三、血樣處理、臟器稱重

末次造模灌胃后，禁食不禁水12h，稱量體重，摘眼球取血后，3500r/min離心10min分離血清于離心管中，冷凍備用。然后頸椎脫臼處死，摘取胸腺、脾臟、腦組織，剝除周圍結(jié)締組織，并用濾紙除去臟器表面血跡，新鮮稱重，記錄數(shù)據(jù)。

四、組織勻漿的制備

將準(zhǔn)確稱重后的腦組織加入9倍體積的生理鹽水，于勻漿機(jī)處理制備勻漿，再將勻漿液3500r/min離心10min，取上清液得10％腦組織勻漿，冷凍備用。

五、指標(biāo)測(cè)定及分析方法

計(jì)算各臟器指數(shù)，即胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腦指數(shù)。

公式為：臟器指數(shù)(mg/g)＝臟器重(mg)/小鼠體重(g)。

血清中SOD、CAT活力的測(cè)定以及腦組織中SOD、MDA的測(cè)定，在酶標(biāo)儀或紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A001-3，生產(chǎn)批號(hào)：20160415)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A007-1，生產(chǎn)批號(hào)：20160308)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A003-1，生產(chǎn)批號(hào)：20160415)，均由南京建成生物工程研究所提供。

六、數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較，以P<0.05或P<0.01為差異，說(shuō)明組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、遠(yuǎn)志糖蛋白提取物對(duì)各臟器指數(shù)的影響

結(jié)果如表4所示。由表可知，與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和腦指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。衰老常表現(xiàn)為組織器官的退行性變化，即免疫器官等臟器的重量減輕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明注射D-半乳糖溶液會(huì)引起小鼠免疫器官萎縮，進(jìn)一步說(shuō)明致衰老模型建立成功。與模型組比較，從胸腺指數(shù)水平來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照組、遠(yuǎn)志糖蛋白低、高劑量組均顯著升高(P<0.05)，中劑量組極顯著升高(P<0.01)；從脾臟指數(shù)水平來(lái)看，遠(yuǎn)志糖蛋白中、高劑量組均顯著升高(P<0.05)；從腦指數(shù)水平來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照組與遠(yuǎn)志糖蛋白中、高劑量組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。綜合三種器官指數(shù)的變化結(jié)果來(lái)看，可以說(shuō)明遠(yuǎn)志糖蛋白在一定程度上能夠減緩D-半乳糖導(dǎo)致的臟器萎縮。

表4遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠各臟器指數(shù)的影響(n＝14，單位mg/g)

注：*.與空白組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；△.與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01。

2、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)小鼠血清中SOD、CAT活力的影響

結(jié)果如表5所示，由表可知：與空白組相比，模型組的SOD、CAT活力均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，遠(yuǎn)志糖蛋白高劑量組SOD活力顯著升高(P<0.05)，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與遠(yuǎn)志糖蛋白陽(yáng)性組比較，高劑量組血清中SOD活力顯著升高(P<0.05)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從SOD這一指標(biāo)來(lái)看，遠(yuǎn)志糖蛋白組的SOD活力高于陽(yáng)性組，說(shuō)明遠(yuǎn)志糖蛋白與維生素E有類似的抗氧化功效，其作用可能優(yōu)于維生素E。與模型組相比，以CAT水平來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照組活力顯著升高(P<0.05)，遠(yuǎn)志糖蛋白中、高劑量組極顯著升高(P<0.01)。SOD、CAT均屬抗氧化酶類，可清除活性氧，減輕對(duì)機(jī)體的損害，延緩衰老。遠(yuǎn)志糖蛋白可顯著提高小鼠血清中SOD、CAT的活力，SOD、CAT活力的升高表明遠(yuǎn)志糖蛋白具有延緩衰老的作用。

表5遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)血清中SOD、CAT活力的影響(n＝14)

注：*.與空白組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；△.與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01；#.與陽(yáng)性組比較，^#P<0.05。

3、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)小鼠腦組織中SOD活力、MDA含量的影響

結(jié)果如表6所示，由表可知：與空白組比較，模型組SOD活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，從SOD這一水平來(lái)看，遠(yuǎn)志糖蛋白低、中劑量組能顯著提高SOD活力(P<0.05或P<0.01)；從MDA這一水平來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照組和遠(yuǎn)志糖蛋白中劑量組能顯著降低腦組織中MDA的含量(P<0.05)，遠(yuǎn)志糖蛋白高劑量組腦組織中MDA的含量極顯著降低(P<0.01)。MDA在腦組織中的含量升高，使自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度加大，加速衰老，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遠(yuǎn)志糖蛋白有效的抑制了脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，起到了一定的抗衰老作用。

表6遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)小鼠腦組織中SOD活力、MDA含量的影響(n＝14)

注：*.與空白組比較，^*P<0.05；△.與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01。

實(shí)施例4、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用研究

一、遠(yuǎn)志糖蛋白的制備

遠(yuǎn)志糖蛋白的制備具體參照實(shí)施例2。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、免疫低下模型的建立及給藥

選取SPF級(jí)昆明小鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性組、遠(yuǎn)志糖蛋白低、中、高劑量組，每組12只，雌雄各半。除空白組外，其他各組連續(xù)14天腹腔注射環(huán)磷酰胺(30mg·kg^-1小鼠體重)建立免疫低下模型，空白組注射等量生理鹽水作為對(duì)照。陽(yáng)性組灌胃給予鹽酸左旋咪唑(20mg·kg^-1小鼠體重)，遠(yuǎn)志糖蛋白組灌胃給予遠(yuǎn)志糖蛋白低量(100mg·kg^-1小鼠體重)，中量(200mg·kg^-1小鼠體重)，高量(400mg·kg^-1小鼠體重)，其余各組灌胃給予等量蒸餾水。灌胃體積為0.025mL·g^-1小鼠體重，連續(xù)灌胃14天。以上各藥物的劑量均為每天的給藥劑量。

三、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

第14天晚上禁食，在第15天眼眶靜脈叢取血，離心取血清，分裝，凍存于冰箱待測(cè)。取血結(jié)束后，取其胸腺和脾臟，稱重記錄。

四、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)小鼠免疫分子的影響

按試劑盒提供的ELISA法測(cè)定血清中IL-2和IL-6的含量。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

小鼠白介素2(IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒(CK-E20010)，小鼠白介素6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(CK-E20012)，均由上海研吉生物科技有限公司提供。

五、統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異具有顯著性意義，P<0.01表示差異具有極顯著性意義。

六、結(jié)果

1、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)免疫低下小鼠臟器系數(shù)的影響

結(jié)果如表7所示，從表可知：與空白組比較，模型組小鼠胸腺系數(shù)極顯著降低(P<0.01)，脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)。以胸腺系數(shù)水平來(lái)看，陽(yáng)性組與模型組相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；遠(yuǎn)志糖蛋白中劑量組相比模型組，胸腺系數(shù)顯著升高(P<0.01)；以脾臟系數(shù)水平來(lái)看，與模型組相比，陽(yáng)性組、遠(yuǎn)志糖蛋白低、中劑量組均顯著升高(P<0.05)，表明因造模引起的胸腺和脾臟萎縮，在給予藥物治療后得到了一定程度的改善。

表7遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)免疫低下小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響

注：*.與空白組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；#.與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01

2、遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)免疫低下小鼠血清IL-2、IL-6含量的影響

結(jié)果如表8所示，由表可知：與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-2和IL-6含量均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，說(shuō)明以這兩種白介素水平來(lái)看，模型建立成功。與模型組相比，遠(yuǎn)志糖蛋白低劑量組能顯著提高免疫低下小鼠IL-2水平，遠(yuǎn)志糖蛋白高劑量組能顯著提高血清IL-6水平，其差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽(yáng)性組、遠(yuǎn)志糖蛋白中量組與模型組相比，在IL-2、IL-6水平，均顯著升高(P<0.01)。

表8遠(yuǎn)志糖蛋白對(duì)免疫低下小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL-6含量的影響

注：*與空白組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；#與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。